昆虫来源的几丁质酶的分离纯化及酶学性质

几丁质酶在真菌和昆虫的生理和发育过程中起着关键作用,该酶本身及其酶抑制剂是获取生物农药的重要途径。本研究从蚕蛹体内提取几丁质粗酶,经硫酸铵分级沉淀和Sephadex G-150分离得到几丁质酶。用SDS-PAGE测得该酶的分子量为88kDa。水解胶体几丁质的Km值为22.3μmol/L。酶反应的最适温度为45℃,最适pH值为6.0,金属离子和有机试剂对几丁质酶活性都有影响,其中高浓度的Mn2+对酶有较强的激活作用,而Cu2+、SDS则有较强的抑制作用。研究结果为基于几丁质酶的生物农药筛选研究奠定了基础。     

几丁质酶基因的克隆表达及酶学性质

【背景】几丁质是自然界中储藏量仅次于纤维素的有机物,几丁质酶能降解几丁质生成几丁寡糖,实现废弃物的高值化利用,目前菌株产几丁质酶能力低限制了它的生产应用。【目的】克隆弧菌(Vibrio sp.)GR52的几丁质酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,对分离纯化的重组几丁质酶进行酶学性质研究。【方法】以弧菌GR52菌株基因组DNA为模板,克隆得到几丁质酶基因GR52-1,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-chi GR52-1,诱导表达的产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应pH为6.0,在pH5.0-10.0范围内37°C保温1 h仍能保持85%以上的相对酶活力,具有较好的pH稳定性;最适反应温度为50°C,在45°C保温1 h其酶活力基本没有损失,在50°C保温1 h其残余酶活力仍达60%;在1 mmol/L浓度下,Cu~(2+)、Ca2+对该酶具有促进作用,Hg+对该酶具有明显的抑制作用;在5 mmol/L浓度下,Ni+对该酶具有一定的促进作用,Mn~(2+)、Co~(2+)、Li~+、Fe~(2+)、Hg~+、SDS(十二烷基硫酸钠)对该酶具有明显的抑制作用。以胶体几丁质为底物时,动力学参数Km、Vmax、kcat分别为0.85 mg/m L、0.19μmol/(m L·min)和7.02 s-1。底物特异性分析表明该重组酶能特异性降解几丁质。【结论】重组几丁质酶具有良好的酶学性质,为几丁质酶的开发应用奠定基础。     

莱氏野村菌产几丁质酶条件及酶学性质研究

对莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)菌株CQ031021产几丁质酶条件及酶学性质进行了研究。结果表明:该菌株最适产酶碳源为2.0%(W/V)葡萄糖,氮源为1.2%(W/V)复合氮源(蛋白胨、牛肉膏按1∶1的比例),接种量为孢悬液2mL(1×107个/mL),培养温度28℃,培养液初始pH6.0,培养时间6d;一定浓度的吐温-80对几丁质酶活性有促进作用,而SDS有抑制作用;粗酶液最适反应温度50℃,最适pH6.0,在40℃以下及pH5.5～6.5范围内酶活力较稳定。     

豇豆几丁质酶N端序列测定及与其它植物的比较

通过自动 Edman降解程序 ,测定了经诱导、纯化的豇豆几丁质酶 N端 1 0个氨基酸的序列 ,并将该序列与其它植物几丁质酶 N端相应部分的氨基酸序列进行了比较分析。结果表明 ,该豇豆 ( Vigna sesquipedalis)几丁质酶 N端 1 0个氨基酸的序列为 EQCGSQAGGA,与 类几丁质酶同一部分同感序列同源性高达 1 0 0 % ;而与 、 及 类几丁质酶的相应序列均无同源性。结合考虑此酶的等电点 ( 8.3)及分子量 ( 33k D) ,可推测该豇豆几丁质酶属于 类几丁质酶。其 N端序列的高度保守性提示 ,该段序列可作为 类几丁质酶的一段主要特征序列 ,并可据其合成核酸探针 ,以分离、克隆其它 类几丁质酶编码基因。     

外来入侵植物空心莲子草几丁质酶特性研究

外来入侵植物空心莲子草因其强抗逆性而迅速蔓延,成为有害杂草.拟研究其病程相关蛋白--几丁质酶酶学性质,为探讨该植物的抗逆机理和入侵机制提供理论依据.空心莲子草经乙烯利处理后,其叶片蛋白质提取液在4℃经40～60%饱和硫酸铵溶液沉淀,SephadexG-75洗脱后得几丁质酶液.结果表明:空心莲子草几丁质酶最适反应pH为5.7左右,在pH4.0～8.0均表现稳定,当pH小于4.0和大于8.0时酶活力丧失50%以上,在pH2.0和10.0时没有活力;在30℃-80℃范围内,酶均具较高活性,最适反应温度为70℃左右,温度高于80℃后,酶稳定性下降;当底物浓度小于1.25%时,酶活力随底物浓度的增加而增加,在底物浓度大于1.25%浓度时,活力增加的趋势减缓.结果提示:也许空心莲子草的强抗逆性是因为其几丁质酶具较高的温度耐受性和较大的pH作用范围.     

棉铃虫Ⅳ型几丁质酶的基因克隆、酶学性质及表达谱

【目的】昆虫几丁质酶(chitinase, CHT)主要参与蜕皮、围食膜的降解和机体免疫防御等重要生理生长发育过程。本研究旨在对棉铃虫Helicoverpa armigera Ⅳ型(group)几丁质酶基因进行克隆和表达分析,为以该基因作为棉铃虫防控的分子靶标提供理论依据。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从棉铃虫中肠中克隆Ⅳ型几丁质酶基因,分别运用DNAMAN和MEGA软件进行多序列比对和构建系统发育树。在大肠杆菌Escherichia coli(DE3)中诱导表达其体外重组蛋白,利用Western blot进一步验证;用Ni-NTA纯化柱纯化重组蛋白,之后研究该蛋白的酶学性质。qPCR分析该基因的在棉铃虫不同发育阶段和6龄幼虫不同组织中的表达谱。【结果】克隆获得棉铃虫几丁质酶基因HaCHT4(GenBank登录号: MH500771),其cDNA长1 624 bp,ORF长1 527 bp,编码509个氨基酸,预测的分子量为55.2 kD。蛋白质序列的N末端具有信号肽,中间序列部分含有一个催化结构域(catalytic domain, CAD), C末端含有一个几丁质结合结构域(chitin binding domain, CBD)。多序列比对显示,HaCHT4具有几丁质酶的保守区域;系统发育分析表明,HaCHT4属于Ⅳ型几丁质酶。重组蛋白His-HaCHT4在大肠杆菌中成功表达。纯化的重组蛋白对胶体几丁质底物具有降解活性,最适温度和pH分别为50℃和7,动力学参数K_m和V_max值分别为1.76±0.35 mg/mL和0.0220±0.0012 μg/mL·s。qPCR分析表明,HaCHT4在1龄和2龄幼虫期的表达量显著高于其他幼虫龄期及预蛹期;主要在中肠和脂肪体中高度表达,体壁和头部中低表达。【结论】结果提示棉铃虫HaCHT4可能参与围食膜中几丁质降解过程。这些结果为深入研究HaCHT4的功能奠定了基础,并为害虫防治提供了有用的信息。     

产几丁质酶的无色杆菌ZWW8的发酵产酶及酶学性质研究

从湖北武汉地区虾壳堆积土壤中筛选得到一株分泌胞外几丁质酶菌株ZWW8,通过16S rDNA序列比对发现其属于无色杆菌属;通过碳源、氮源、温度、培养基pH、培养时间的单因素优化实验获得ZWW8菌株的最优发酵条件,该菌株在添加0.5％几丁质胶体,0.5％NH4Cl,初始pH 7.0的培养基中,于37℃培养2 d后胞外上清酶...     

几丁质酶及其研究进展

本文从几丁质酶的分布、发育调节、可诱导性、分子生物学及抗病基因工程等方面近年来的进展进行了综合论述,并对其进一步的应用提出展望。     

产气肠杆菌几丁质酶的分离纯化及性质研究

从自然罹病死亡的草原毛虫(Gynephorap ruoergnesis)体内分离到一株产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes),它在几丁质的诱导下能产生较高活性的几丁质酶。发酵液经硫酸铵盐析、DEAE纤维素柱层析和Sephadex G-100柱层析分离出几丁质酶。用SDSPAGE测得该酶的分子量为425kD。水解几丁质的Km值为2.88mg/mL-1。酶反应的最适温度为55℃,最适pH值为60,金属离子对几丁质酶活性影响较大,其中Zn2+、Ba2+、Ca2+和Mn2+对酶有较强的激活作用,而Hg2+、Co2+和Mg2+则有较强的抑制作用。     

长豇豆种皮和种脐的发育

长豇豆的胚珠具内外两层珠被,内珠被在种子发育早期退化消失,种皮仅由外珠被发育而成。外珠被的外表皮细胞径向伸长,外壁和经向壁增厚,形成约占成熟种皮厚度一半的栅栏层;亚表皮细胞发育为骨状石细胞层。第三层细胞类似于亚表皮层但细胞壁增厚不明显,其内方的多层薄壁细胞形成海绵组织。种脐具两层栅栏细胞,外栅栏层及其以外部分由珠柄组织发育而成管胞群。本文还对脐缝和管胞群的作用以及豆科种子的吸水机制进行了讨论。     

长豇豆胚和胚乳的发育及营养物质积累

长豇豆(Vigna sesquipedalis (L.)Fruwirth)开花前7—10小时传粉,开花后8—10小时完成双受精。合子期珠孔端及合点部位胚囊的周界壁有壁内突。胚发育属柳叶菜型。胚柄的基部细胞及基部区域外层细胞的外切向壁发生壁内突。成熟胚中胚柄宿存。开花后9—16天为子叶细胞中淀粉积累期,开花后12—18天为蛋白质积累期。胚乳发育为核型,珠孔端胚乳细胞化,合点端保持游离核状态。胚乳外层细胞为传递型细胞,珠孔端的胚乳细胞形成折叠细胞群,亦有壁内突。心形胚期胚乳开始退化解体,成熟胚期胚乳完全消失。     

TRANSPORT OF CATIONS FROM COTYLEDON TO SEEDLING OF THE EMBRYONIC PLANTS OF VIGNA SESQUIPEDALIS

Decrease of dry material, water, potassium and divalent cationsin the cotyledon (catabolic organ and accumulation of thesesubstances in the seedling (anabolic organ) were traced duringthe germination stage of Vigna sesquipedalis, cultured at 15°,25° and 30° in the dark on the sand with the supplyof tap water. One half of the divalent cations finally accumulatedin the seedling came from the root, whereas most of the potassiumfrom the cotyledon. Practically all the calcium in the cotyledonremained untransported, while 90% of K stored in the cotyledonwas transported into seedling. As for divalent cations otherthan Ca, 50–60% of the total divalent cations was transportable.The concentration of K, transportable dry material and transportabledivalent cations decreased linearly with the culture age. Fromthe temperature dependency of the rate of this decrease, itwas inferred that the transport of cations from cotyledon toseedling involved at least two component processes having activationenergies of approximately 5 and 16 Kcal, respectively. The rateof transport at 30° was found to be 10–20 times greaterthan that calculated from the simple diffusion model in water.Fractionation of cell inclusions in the cotyledon by the useof a centrifuge (1,500 and 16,000 rpm) suggested that the amountsof ions in the precipitable fractions, being bound to certaincell components, precisely corresponded to the untransportablefraction. ¹Main part of this work was reported at the Annual Meeting ofthe Botanical Society of Japan held at Fukuoka on Oct. 25. 1958. (Received October 16, 1961; )     

PARTIAL PURIFICATION,CHARACTERIZATION, AND KINETIC STUDIES OF A LOW-MOLECULAR-WEIGHT,ALKALI-TOLERANT CHITINASE ENZYME FROM Bacillus subtilis JN032305, A POTENTIAL BIOCONTROL STRAIN

A new alkalophilic low-molecular-mass chitinase of 14 kD from the potent biocontrol agent Bacillus subtilis JN032305 was partially purified and enzymology of the chitinase was studied. The enzyme showed optimal pH of 9.0 and temperature of 50°C. The enzyme was found stable during the 60-min incubation at 50°C. The chitinase was inhibited by group specific agents like IAA, DAN, TLCK, and SDS and metal ions Mg²⁺, Ca²⁺, Fe²⁺, Mn²⁺, Ba²⁺, and Hg²⁺, whereas Zn²⁺ did not show significant inhibitory effect against the chitinase. PMSF partially inhibited the enzyme. Substrates specificity tests indicated that the enzyme showed 75% of relative activity on glycol chitin, 58% on carboxymethylcellulose (CMC), 33% on chitin flakes, and 166% laminarin compared to that on colloidal chitin. The enzyme also hydrolyzed 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-D-glucosaminide, indicating its chitobiase activity. The chitinase of this study has broad specificity, which could hydrolyze not only the glycosidic bond in GlcNAc–GlcNAc but also that of related carbohydrates with glycosidic linkages. The partially purified chitinase not only showed antifungal activity against Rhizoctonia solani and Colletotrichum gloeosporioides, two potent phytopathogens of chilli, but also increased the germination of chilli seeds when infected with the two potent phytopathogenic fungi.     

长豇豆花药和花粉的发育

长豇豆花药壁的发育为基本型。绒毡层周原质团型,小孢子母细胞减数分裂粗线期至末期Ⅱ,相邻小孢子母细胞间存在胞质通道。四分体多为四面体型,少数为左右对称型。生殖细胞刚形成时,壁呈ＰＡＳ负反应,以后为ＰＡＳ正反应。生殖细胞游离在营养细胞质内后,壁消失。成熟花粉为２细胞型。在小孢子早期,首次观察到在周原质团型绒毡层细胞外切向壁的外方,有很多直径约２－４μｍ,含不溶性多糖、蛋白质和抗乙酰解物质的球形颗粒,以后这些颗粒沿绒毡层细胞的径向壁进入药室,同时在小孢子壁和原生质体之间也出现了同样的颗粒。小孢子外壁增厚的同时,颗粒消失。关于这些颗粒的作用,有待进一步深入探讨。     

球孢白僵菌胞内几丁质酶的分离纯化及性质

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)突变株CH-1316细胞裂解液经(NH_4)_2SO_4沉淀,DEAE-纤维素层析及凝胶过滤,分离出一种几丁质酶,该酶的分子量为32000;最适pH为5.0;最适温度为40℃;最适离子强度为0.2mol/L NaCl;Hg²⁺、Fe²⁺是该酶的强抑制剂;该几丁质酶完全不水解纯的片状几丁质,脱矿几丁质也不是该酶的良好底物;该几丁质酶水解几丁寡糖,但不水解几丁二糖;对几丁五糖以上的寡糖水解速度较快,而对几丁三糖和四糖水解速度则慢得多。     

甲壳酶特性与应用研究

本文阐明了甲壳酶(甲壳素酶和壳聚糖酶)的物理化学酶学性质,并着重对甲壳酶的结构、催化机制和其多方面应用进行了论述,同时还简介了相关甲壳素脱乙酰酶和溶菌酶等的概况。     

绿豆幼苗中细胞色素氧化酶与酯酶同工酶的调控研究

以转录抑制剂放线菌素Ｄ和转译抑制剂环己亚胺为工具的实验表明,４－氯苯氧乙酸（ＣＰＡ）与２,４－Ｄ促进绿豆幼苗中的细胞色素氧化酶同工酶的活性,是由于刺激了种子中预存ｍＲＮＡ转译的结果。此外,发现环己亚胺对酯酶同工酶的活性有非常明显的刺激作用,其原因尚待进一步研究。     

红栓菌胞外漆酶的诱导,纯化及部分特性研究

红栓菌(pycnoporus cinnabarius)在发酵培养3d后出现胞外漆酶活性峰。木素类似物对红栓菌胞外漆酶活性有诱导作用,阿魏酸、香兰素,愈创木酚和DL-β-苯丙氨酸诱导24h后,发酵液中漆酶活性分别是对照的2.8、4.3、3.5和1.7倍。发酵液经(NH_4)_2S0_4沉淀,Sephadex G-150、DEAE-Sephadex A-25、Sephadex G-25柱层析纯化后,冷冻干燥。高效液相色谱(HPLC)检测为一单峰,分子量为26000,含17种氨基酸,氨基酸总量占酶组成的64.27％。等离子光谱(ICP)分析表明漆酶含有铜。该酶反应的最适温度为30℃,与邻联苯甲胺反应最适pH为4.0,Km值为385μmol/L;与丁香醛连氮反应最适pH为5.8,Km值为833μmol/L。