辣椒上CMV株系鉴别寄主的筛选与应用

根据“基因对基因”理论和日本小室与都凡按寄主的科属关系及被害症状划分株系的方法,研究了辣椒CMV的“基因型株系”和“致病型株系”。从373个甜、辣椒品种(系)中,筛选出一套抗性不同的差别品种,编号为:LS-8501(HR)、LS-8502(R)、LS-8503(T)、LS-8504(S)、LS-8505(HS)。用这套差别品种做“基因型”株系鉴别寄主,将59个CMV分离物划分为5个株系,命名为:CMV-P0,CMV-P1,CMV-P2,CMV-P3,CMV-P4。又从7科39种不同科属寄主值物中,筛选出一套“致病型”株系的鉴别寄主谱7种,用这套鉴别寄主将59个CMV分离物划分为5个株系群,即十字花科株系群,藜科株系群,茄科、葫芦科株系群,豆科株系群,普通黄色花叶株系群。文中比较了两种方法划分的株系致病性与辣椒病症表现型之间的关系,以及各株系的分布。还讨论了“基因型”鉴别寄主谱及“基因型”株系划分方法盼学术价值和实用性,比较了5个株系与国内外已分化的CMV株系的异同点。     

马铃薯Y病毒HC-Pro中心区域在病毒协生作用中的主导地位

利用PCR方法获得了马铃薯病毒中国株系(PVY-C)HC-Pro基因的5个缺失突变体,构建了相应的植物表达载体。通过土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化了烟草品种K₃₂₆(Nicotina tabacum cv.K₃₂₆)。PCR和Southern blot分析证明了HCPro基因及其缺失突变体已整合到烟草基因组中,Western blot表明它们在转基因烟草中得到了表达。侵染性试验发现HCPro中心区域介导转基因烟草中PVY-C和黄瓜花叶病毒(CMV)、PVYC和马铃薯X病毒(PVX)之间的协生作用,从而明确了PVY-C HC-Pro中心区域为病毒协生作用的功能区域。     

黄瓜花叶病毒cDNA载体在烟草细胞中表达外源基因

为了探讨利用黄瓜花叶病毒(CMV)构建表达载体的可行性,分离了山东株(SD) CMV RNA 3的全长cDNA。测定其全序列后,采用定点突变的方法在衣壳蛋白(CP)基因起始密码子处改造出一个NsiⅠ位点,可将外源基因引入NsiⅠ位点和CP基因终止密码子上游附近的XhoⅠ或SalⅠ位点而置换掉CP基因。分别用绿色荧光蛋白(GFP)基因、β-葡糖醛酸酶(GUS)基因以及小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因3种报告基因置换CP基因。将Fny株CMV RNA 1、RNA 2和SDCMV嵌合RNA 3的cDNA分别插入pCass载体的35S启动子和终止子之间,将构建的置换型载体直接以质粒的方式转染烟草原生质体,表达了3种报告基因。     

鼠伤寒沙门氏菌PurR阻遏蛋白Trp-147, Gln-218和Gln-292氨基酸残基的功能分析

对从purR超阻遏突变体(purR^s)出发分离的purR(am)突变体进行了purR编码区DNA片段的克隆和测序,确定了6个purR(am)突变体的am突变位点,其中3个位于C⁹³³(Gln-218),2个位于G⁷²¹(Trp-147),1个位于C¹¹⁵⁵(Gln-292).进而对位于PurR辅阻遏物结合区的这3个不同am位点,通过引入tRNA抑制基因(sup),进行了5种不同氨基酸取代,并测定了对PurR阻遏蛋白功能的影响.结果显示,Cys,Glu,Gly,His和Arg5种氨基酸分别取代Trp-147,都不能明显恢复purR阻遏蛋白的调节功能,证实了Trp-147是影响PurR调节功能的重要氨基酸残基.Cys等5种氨基酸对Gln-292的取代也不能恢复PurR阻遏蛋白的调节功能,证明了Gln-292也是影响PurR阻遏蛋白调节功能的重要氨基酸.     

药用植物柴胡病毒病病原物的分子鉴定

利用非序列依赖性扩增(Sequence-independent amplification,SIA)方法对所采柴胡病样进行分子鉴定。序列测定及分析发现,伴有花叶症状的柴胡受到黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)的复合侵染。为明确柴胡CMV分离物(CMV-SXCH)和柴胡BBWV2分离物(BBWV2-CH)的分类地位,进一步克隆CMV-SXCH的CP、MP和BBWV2-CH的LCP、SCP;序列比对发现,CMV-SXCH与CMV亚组ⅠB中株系XJ2相似性最高,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.1%、99.5%;BBWV2-CH与BBWV2中的K株系相似性最高,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.4%、99.2%。系统进化树分析表明,CMV-SXCH与大多数CMV中国分离物聚类为一簇,同属于CMV亚组ⅠB;BBWV2-CH与BBWV2韩国K株系聚类为一簇,亲缘关系最近。     

葡萄扇叶病毒外壳蛋白基因的克隆,序列分析及其在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR方法把葡萄扇叶病毒(GFLV)外壳蛋白基因(CP gene)分成两部分扩增,扩增产物克隆入pGEM-5Zf(+)载体,并通过BglⅢ位点连接成一完整的外壳蛋白基因,通过序列分析测得全长外壳蛋白基因为1512bp,编码504个AA＇s,与国外株系GFLV-F13相比,核苷酸同源性为88.4％,氨基酸同源性为95.8％。并且这一外壳蛋白基因在大肠杆菌E.coli DH-5α中得到了表达。     

侵染人参果的马铃薯M病毒基因组全序列分析

测定了侵染人参果的马铃薯M病毒(PVMCh)基因组全序列。线状、单链正义RNA全长8526bp,含6个开读框(ORF),具麝香石竹潜隐病毒属(Genus Carlavirus)典型结构特征。序列比较表明它与其他PVM分离物各基因核苷酸和编码蛋白氨基酸序列同源性分别为62.5%～9702%和60.9%～97.4%,其中CP基因最保守,而TGB3基因变异最大。系统进化树分析表明美国爱达荷州马铃薯分离物(PVMId) (AF023877)为PVM的一个远缘株系,而其他4个PVM分离物的成簇在外壳蛋白(Coat protein, CP)和核酸结合蛋白(Nucleic acid binding protein, NABP)区域略有差异。这是PVM在人参果上侵染的首次报道。     

亚位点+1处突变提高软化类芽胞杆菌环糊精糖基转移酶底物麦芽糊精特异性

通过改造来源于软化类芽胞杆菌Paenibacillus macerans的环糊精糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase,CGT酶)的+1亚位点提高其对麦芽糊精的底物特异性,并进一步提高以麦芽糊精为糖基供体催化合成2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的效率。首先对+1亚位点附近的3个氨基酸残基Leu194、Ala230和His233分别进行定点饱和突变,得到3个优势突变体L194N(亮氨酸→天冬酰胺),A230D(丙氨酸→天冬氨酸),H233E(组氨酸→谷氨酸),然后以这3个优势突变体为模板进一步进行两点和三点复合突变,获得7个复合突变体。研究结果表明,突变体L194N/A230D/H233E以麦芽糊精为底物合成AA-2G的产量最高,达到1.95 g/L,比野生型CGT酶提高了62.5%。对获得的突变体进行动力学分析,发现高浓度的底物L-AA对突变型CGT酶催化的酶促反应具有抑制作用。确定了突变体酶促反应的最适温度、pH和反应时间。模拟突变体的三维结构并进行分析,突变体底物特异性的改善可能与CGT酶第194位、230位和233位的氨基酸残基的亲水性及与底物分子间的作用力的改变有关。     

黄瓜花叶病毒CB7株系引起心叶烟坏死反应与RNA2相关

采用RT-PCR获得黄瓜花叶病毒CMV-CB7株系全长基因组cDNA,经克隆测序发现该CMV的RNA1、2和3分别为3356nt、3045nt和2218nt(序列登录号为:EF216866、DQ785470和EF216867).CMV-CB7基因组cDNA克隆体外转录RNA接种心叶烟引起坏死症状,而CMV-Fny则产生典型花叶.由CMV-CB7和CMV-Fny基因组RNA相互交换而构建6个假重组型病毒(C1C2F3、C1F2C3、F1C2C3、F1F2C3、F1C2F3和C1F2C3)活性分析表明:CMV-CB7基因组RNA2决定其在寄主上的症状反应.嵌合型RNA2(RNA2F5C3和RNA2C3F5)的寄主侵染活性测定表明:2b基因或RNA23′端非编码序列决定CMV-CB7在心叶烟坏死症状.RNA印迹分析结果显示:CMV-CB7和CMV-FnyF5C3引起寄主坏死与基因组RNA积累没有直接关系.     

翻译后修饰可能影响黄瓜花叶病毒2b 蛋白抑制子活性及稳定性

黄瓜花叶病毒 (Cucumber mosaic virus,CMV) 编码的2b蛋白具有RNA沉默抑制子功能,为了研究翻译后修饰对2b功能的影响,利用反向PCR定点突变方法对CMV-Q株系2b蛋白的1个预测的磷酸化位点 (S40) 和2个预测的泛素化/SUMO化位点 (K22,K39) 进行了点突变,同时将点突变体插入植物表达载体。通过农杆菌共注射法对3个2b突变体的抑制子活性进行了分析,结果证明,当S40突变为A (2bS40A) 后,2b抑制局部和系统沉默的活性均大幅降低;当K22突变为R (2bK2     

黄瓜花叶病毒基因沉默载体的病毒含量和症状分析

病毒诱导的基因沉默(Virus-induced Gene Silencing, VIGS)已被广泛应用于植物基因功能研究,具有操作容易、较短时间内即可观察到沉默效果、成本较低的特性.黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus, CMV) VIGS载体已经应用于沉默辣椒、烟草、大豆等植物基因,对于研究植物基因功能有重要作用.研究以CMV的Fny株系(CMV-Fny)RNA2中2b基因缺失载体CMV-F209△2b和表达2b基因N端61个氨基酸的载体CMV-F2092b61aa为对象,插入不同长度的外源基因gfp片段后,分析CMV VIGS载体在本氏烟植株上的病毒表达含量及诱导产生的病毒症状.结果表明,插入外源基因片段后,病毒外壳蛋白(Coat Protein, CP)基因RNA表达水平均明显降低.携带不同长度gfp序列的重组病毒CMVF2092b61aa-gfp₁₀₀、 CMVF2092b61aa-gfp₂₀₀和CMVF2092b61aa-gfp₃₅₀其CP RNA含量比装载最适长度gfp序列的CMVF209...     

黄瓜花叶病毒2b蛋白C末端无抑制局部RNA沉默的活性

目的:黄瓜花叶病毒 (Cucumber mosaic virus,CMV) 编码的2b蛋白具有RNA沉默抑制子的功能,其C末端氨基酸序列非常保守。为了明确2b蛋白C末端保守序列在RNA沉默抑制中的作用,构建了CMV Q株系野生型2b及其C末端缺失突变体2b^delC的植物瞬时表达载体。通过农杆菌共渗滤法对野生型2b及其C末端突变体的沉默抑制子活性进行了分析。结果与结论:烟草接种叶片中野生型2b及其C末端突变体的Western blot检测表明,野生型2b蛋白与其C末端突变体在植物中积累水平变化不大,说明2b蛋白C末端氨基酸残基在维持2b蛋白在植物细胞中的稳定性方面无作用。在整株、细胞和分子水平上分别比较了野生型2b及其突变体2b^delC对共表达GFP的表达量影响,结果表明在所有的测定结果中二者均无明显地差异,说明2b蛋白C末端94-111位氨基酸在抑制局部RNA沉默上无生物学活性,讨论推测C末端应不存在与小RNA结合的结构域。     

侵染花生的黄瓜花叶病毒CA株核酸全序列分析

对侵染花生的黄瓜花叶病毒CA(CMV-CA)株系进行克隆和序列分析.CMV-CA RNA1全长3 356个核苷酸(nt),编码分子量为111kDa 的1a 蛋白;RNA2全长3045nt,编码分子量为96.7kDa 的2a蛋白和13.1kDa的2b蛋白;RNA3全长2219nt,编码分子量为30.5kDa的3a蛋白和分子量为24kDa的外壳蛋白(CP).序列同源性比较表明,CMV-CA RNA1、2、3与CMV亚组IA CMV-Fny、亚组IB CMV-SD、亚组II CMV-Q 株系序列同源性,RNA1分别为91.3%、91.1%和76.5%,RNA2分别为92.1%、90%和71.2%,RNA3分别为96.1%、92.6%和74.5%;与同属花生矮化病毒(Peanut stunt virus,PSV) RNA1、2、3序列同源性分别为67.1%、58.2%和55.7%.上述研究未发现CMV-CA基因组与PSV RNA链的重组,CMV-CA对花生的侵染应是该株系适应于花生的遗传变异、长期进化的结果;对RNA3 5′NTR结构分析以及RNA3 5′NTR和 CP 系统进化树分析表明,CMV-CA属CMV IB亚组.     

豆科植物早期共生信号转导的研究进展北大核心CSCD

豆科植物与根瘤菌建立特异的共生关系,在寄主根部产生固氮根瘤。此过程包含了共生信号识别与传递、根瘤菌侵染、根瘤形成以及固氮功能实现等生物学事件。研究人员已经从2种豆科模式植物蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)和百脉根(Lotus japonicus)的共生固氮体系中,筛选到许多与根瘤菌共生相关的突变体及其相对应的功能基因,建立起包含结瘤因子识别、共生信号传递和转录响应在内的早期共生信号途径。该文对豆科植物早期共生信号途径的新进展进行了综述。     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004菌株wxcA基因与EPS的产量有关

在以前的工作中,采用转座子Tn5gusA5对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc) 8004菌株进行诱变,获得一批胞外多糖(EPS)合成减少的突变体,对这些突变体的Tn5gusA5的插入位点进行分析后,发现有两株突变体是wxcA基因不同插入位点的突变体。以前认为wxcA基因与脂多糖(LPS)的O抗原合成有关而与EPS的合成无关。为明确wxcA基因的功能,对8004菌株的wxcA基因进行缺失,获得的ΔwxcA突变体的EPS产量与野生型菌株相比,减少了50%,并且一段PCR合成的包含wxcA基因的DNA片段能反式互补ΔwxcA突变体,恢复突变体的EPS产量。这证实了8004菌株的wxcA基因与EPS的合成产量有关。     

芒果炭疽病菌β-微管蛋白基因的克隆及其与多菌灵抗药性发生的关系

参照豆科合萌属（Aeschynomene）作物炭疽病菌的tub1和tub2基因序列设计了2对引物,分别从芒果（Mangifera）炭疽病菌对多菌灵(MBC)田间抗药性（MBCR）和敏感（MBCS）的菌株中扩增β_微管蛋白基因。结果只有以tub2为参照设计的引物扩增到了特异片段。进一步对全基因进行了克隆和测序。该基因序列全长1344bp,编码447aa,其核苷酸和氨基酸序列与豆科合萌属炭疽病菌的tub2基因高度同源。对芒果炭疽病菌抗、感菌株β_微管蛋白氨基酸序列进行比较分析,发现第181、237和363位氨基酸发生了突变,而其它位置（如第198位或200位）均不变。     

表达黄瓜花叶病毒外壳蛋白的转基因番茄抗黄瓜花叶病毒侵染

通过土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将黄瓜花叶病毒外壳蛋白(CMV CP)的cDNA成功地引入番茄(Lycopersicon esculentum)植株中,并得到转基因植株。用强致病力CMV株系接种后,表达CMV外壳蛋白的转基因植株表现出对CMV侵染的抗性。转基因植株RI代的抗性基因以接近3:1比例分离。对R_1代接种CMV后,表达CMV CP的植株病症减轻,发病率、病情指数及病毒积累量明显低于对照。病症出现推迟1个多月。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒湖南邵阳株系基因组MP片段的测定及生物信息学分析

本文运用RT-PCR方法克隆了黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)湖南邵阳株系的基因组MP(CGMMV-HuNSY movement protein)片段,测序并进行了分析。结果显示,片段全长共有803bp(KC684977),编码由264个氨基酸组成的蛋白质,推测分子量约28.87kD,理论等电点pI为9.06,ProtParam预测显示为不稳定蛋白,与已报道的辽宁分离物病毒的MP作比较,核苷酸相似性为99.6%,氨基酸相似性为98.9%;湖南邵阳株系CGMMVMP蛋白无高度卷曲螺旋部位,有跨膜结构区域,该部位表现为疏水性,可能为蛋白互作位点;磷酸化位点均匀分布于整个多肽链中,存在5个主要的B细胞抗原表位预测位点;对烟草花叶病毒属病毒MP氨基酸序列进行了motif查找,发现了该属病毒氨基酸序列的3个保守区段,还进行了密码子偏向性分析。此外,发现了1个酰胺化位点和1个依赖于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点,可能与病毒的侵染机制有关。     

插入到细胞膜上的葡萄糖转运子4可不暴露其被光化学法标记的活性位点

胰岛素刺激骨胳肌产生磷脂酰肌醇3, 4, 5三磷酸(PI(3,4,5)P₃), 它是促进葡萄糖转运子4(GLUT4)与细胞膜融合的必要条件. 向肌肉细胞内导入PI(3,4,5)P₃可以模拟胰岛素刺激GLUT4与细胞膜融合的作用, 但不足以增加细胞摄取葡萄糖的量. 本研究目的是探讨PI(3,4,5)P₃与胰岛素作用不同的机制. 在骨骼肌细胞株(L6-GLUT4myc)中, 应用免疫反应方法检测细胞膜片上与特异性抗体反应的GLUT4的胞浆区羧基末端表位和胞外区myc表位的可用性; 使用不能渗透到细胞内的甘露糖-生物素衍生物Bio-LC-ATB-BMPA, 结合亲和光化学标记法检测GLUT4胞外区的活性位点. 相对于基础组, 100 nmol/L胰岛素和10 mmol/L PI(3,4,5)P₃分别使与myc结合的抗体量增加1.64倍和1.58倍. 胰岛素还使细胞膜上GLUT4的光化学标记量和细胞膜片上与羧基末端表位结合的抗体量分别增加了2.47倍和2.04倍, 而PI(3,4,5)P₃则无此作用. 在胰岛素作用下, 细胞膜片上与羧基末端表位结合的抗体量大于与myc表位结合的抗体量(分别为2.04和1.64倍). 结果表明: (i) 尽管PI(3,4,5)P₃能使GLUT4与细胞膜融合, 但不能使GLUT4胞外区的活性位点暴露; (ii) GLUT4胞外区活性位点的可用性与胞浆区羧基末端的可用性相关; (iii) 除了能刺激GLUT4与细胞膜融合, 胰岛素还使封闭GLUT4羧基末端的蛋白脱离. 推论胞浆内某种蛋白封闭羧基末端, 同样阻止甘露糖-生物素衍生物对GLUT4活性位点的标记, 并可能妨碍GLUT4转运葡萄糖.     

南京市2011年乙型流感血凝素基因分子特征分析

[目的]分析2011年南京市乙型流感病毒的血凝素(HA)分子学特征.[方法]选择7株2011年南京市不同时间段有代表性的乙型流感毒株进行HA基因序列测定,通过生物信息学方法对HA分子学特征进行分析.[结果]7株乙型流感毒株分为两个系,4株为Victoria,3株为Yamagata;与2011年度疫苗株相比,Victoria和Yamagata系毒株分别在抗原位点146、197和116、198发生了氨基酸替换;其中197和198位点分别是Victoria和Yamagata毒株的受体结合位点,由于上述位点的替换使得Victoria系/Yamagata系毒株分别在197/196位增加了一个潜在的糖基化位点.[结论]2011年南京市乙型流感Victoria 系和Yamagata系病毒同时存在,Victoria/Yamagata毒株197/198位点的氨基酸替换,值得做进一步的探讨.