pax2启动子的克隆及其在人胚胎肾293T细胞中的转录活性

目的:克隆paired box2(pax2)基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出pax2启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列。将重组的报告基因瞬时转染人胚胎肾293T细胞,检测pax2启动子活性。结果:测序结果显示扩增的pax2启动子序列正确;活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体α(ERα)能以剂量依赖的方式升高pax2报告基因的转录。结论:克隆了pax2启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

人PRL-3基因启动子的克隆及转录因子Snail结合位点的初步鉴定

促肝细胞再生磷酸酶-3(PRL-3)是重要的肿瘤转移相关基因,其转录调控机制一直未被阐明.应用TRED在线分析系统共获得3种可能的人PRL-3基因启动子区域.通过与人基因组序列进行比对,发现其中3号启动子序列距离人PRL-3基因距离最近,位于该基因上游约1 kb的DNA区域,与5′端非翻译区域邻接.在线Consite分析系统发现,-500 bp至-451bp之间存在Snail结合的核心寡核苷酸序列CACCTG.运用分子克隆的方法获得PRL-3基因启动子2段区域-699 bp至299bp及-642 bp至-383 bp区域,后者具有Snail结合位点核心寡核苷酸序列CACCTG.构建具有荧光素酶报告基因的pGL3载体并检测其启动子活性.-699～299 bp区域与-642～-383 bp区域的DNA片段在SW480、SW620、CNE2、293A细胞中均具有启动子活性,其中含有Snail结合位点核心寡核苷酸序列CACCTG的短片段活性强于较完整的序列.染色质免疫沉淀结合PCR扩增技术及凝胶迁移阻滞实验确定PRL-3基因启动子区域具有Snail结合位点.研究确定,PRL-3基因的启动子位于转录起始位点上游700 bp与下游300 bp的DNA区域,PRL-3基因启动子存在转录因子Snail结合元件.     

人端粒酶催化亚基基因启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体

为获得端粒酶阳性肿瘤细胞特异表达载体用于癌症的基因治疗 ,克隆并构建了人端粒酶催化亚基 (hTERT)基因启动子调控的萤光素酶报告载体 .用脂质体转染法将其分别转染肿瘤细胞和正常细胞 ,检测其在肿瘤细胞和正常细胞中的转录活性 .hTERT启动子在所检测的 4种端粒酶阳性的肿瘤细胞中具有明显的转录活性 ,平均为阳性对照的 4 4 3% ;而在端粒酶阴性的正常人胚肺成纤维细胞中则无明显的转录活性 .提示hTRET启动子的转录活性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中明显上调 ,由hTERT启动子构建的载体可能是一种新颖和有前景的肿瘤细胞特异性表达的基因治疗载体     

hTRT反义基因转染对人结肠癌细胞生长的抑制作用

利用基因重组技术,hTRT基因反向插入真核表达载体pcDNA3．0,获得重组体pcDRTRT,通过脂质体法导入人结肠癌细胞株SW-111C,获得稳定转染细胞系,即反义细胞,该细胞易脱落,出现明显生长抑制现象;失去叠落生长能力;流式细胞仪(FCM)证实导入反义hTRT后,G0/1期细胞增加,G2M和S期细胞减少,增殖指数(PI)降低;且不能在软琼脂中形成集落;并发现反义细胞中hTRT表达水平明显下降。说明反义hTRT基因体外导入结肠在细胞株SW-111C可以明显降低端粒酶活性,抑制结肠癌细胞的生长、增殖且能使其恶性表型发生逆转。     

Activity of the Human Telomerase Catalytic Subunit (hTERT) Gene Promoter Could Be Increased by the SV40 Enhancer

Telomerase is a ribonucleoprotein complex of which the function is to add telomeric repeats to chromosomal ends. Telomerase consists of two essential components, the telomerase RNA template (hTR) and the catalytic subunit (hTERT). hTERT is expressed only in cells and tissues positive for telomerase activity, i.e., tumor and fetal cells. The aim of this study is to test the increased telomerase promoter activity for cancer gene therapy in adenovirus vector. We cloned the hTERT promoter in place of the SV40 promoter in the pGL3-contol vector to be increased by the SV40 enhancer sequences, resulting in strong expression of luc+ only in telomerase positive cancer cells. Then we transfected the constructed plasmid into a normal human cell line and several cancer cell lines. Through these experiments, we identified the selective and increased expression of the luciferase gene controlled by the hTERT promoter and the SV40 enhancer in the telomerase positive cancer cell lines. To investigate the possibility of utilizing the hTERT promoter and the SV40 enhancer in targeted cancer gene therapy, we constructed an adenovirus vector expressing HSV-TK controlled by the hTERT promoter and the SV40 enhancer for the induction of specific telomerase positive cancer cell death. NSCLC cells infected by Ad-hT-TK-enh were more significantly suppressed and induced apoptosis than those infected by Ad-hT-TK. Telomerase is activated in 80～90% of cancers, so adenovirus with increasing telomerase promoter activity might be used for targeted cancer gene therapy using suicide genes. These results show that the hTERT promoter and the SV40 enhancer might be used for targeted cancer gene therapy.     

携带不同数量增强子的嵌合型肝脏特异性启动子的构建及其体外实验研究

通过PCR手段成功获得肝细胞特异性启动子人α1-抗胰蛋白酶启动子hAATp(human α1-antitrypsin promoter,hAATp)及具有增强子功能的肝脏特异的肝调控区HCR (hepatic control region,HCR)。在此基础上,通过分子克隆手段构建获得携带有不同数量的HCR增强子的嵌合型肝脏特异性hAAT启动子,并在下游连入报告基因Luciferase,然后将重组质粒转染人肝癌细胞系HepG2、小鼠肝癌细胞系Hepa1-6、人胚肾细胞系HEK293和人脑星形胶质母细胞瘤细胞系U87-MG,通过检测Luciferase表达活性分析携带不同数量增强子的肝脏特异性启动子的启动活性及其组织特异性。结果表明,携带有3个增强子的嵌合型肝脏特异性启动子活性及特异性最好,为肝脏类疾病的靶向性治疗研究奠定了基础。     

survivin启动子驱动的shRNA在宫颈癌SiHa细胞中的特异性表达

研究survivin启动子驱动的小发夹RNA(shRNA)在宫颈癌SiHa细胞中的特异性表达.PCR扩增survivin启动子,构建以survivin启动子驱动增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达的真核表达载体pEGFP-C1/Surv,并检测survivin启动子的活性;构建针对EGFP的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6,并检测shRNA在U6启动子驱动下的干扰效果;用有活性的survivin启动子取代pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6载体中的U6启动子,从而获得新的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/Surv;将pGenesil-1-EGFP-shRNA/Surv转染到宫颈癌SiHa细胞及正常人脐静脉内皮HuVEC细胞,观察EGFP在两种细胞中的表达变化.结果表明,成功扩增survivin启动子并验证该启动子具有活性;成功构建EGFP shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6,并验证shRNA在U6启动子驱动下具有较好的干扰效果;成功构建pGenesil-1-EGFP-shRNA/Surv载体,分别转染SiHa及HuVEC细胞,在SiHa 细胞中观察到较少的绿色荧光蛋白表达,而在HuVEC细胞中观察到较多的绿色荧光蛋白表达.survivin启动子能驱动shRNA在宫颈癌SiHa细胞中特异性表达,而在正常HuVEC细胞中不表达.     

食管癌组织人端粒酶反转录酶、肿瘤转移相关蛋白1的表达与临床病理特征及预后的关系研究

摘要 目的： 探讨食管癌组织中人端粒酶反转录酶（hTERT）、肿瘤转移相关蛋白1（MTA1）的表达与临床病理特征及预后的关系。方法：选择2015年1月至2016年10月我院收治的食管癌患者80例,应用免疫组织化学染色法检测其癌组织和癌旁组织中hTERT、MTA1表达,分析食管癌组织中hTERT、MTA1表达与临床病理特征的关系及其表达的相关性。所有患者均随访36个月,观察不同hTERT、MTA1表达情况患者的生存情况并分析hTERT、MTA1的表达与患者预后的关系。结果：食管癌组织中hTERT、MTA1阳性率显著高于癌旁组织（P<0.05）。中低分化、TNM分期为III+IV期、有淋巴结转移者食管癌组织hTERT、MTA1阳性率分别高于高分化、TNM分期为I+II期、无淋巴结转移者（P<0.05）,不同性别、年龄、病灶最大直径者、肿瘤部位、病理类型食管癌组织hTERT、MTA1阳性率比较均无统计学差异（P>0.05）。Spearman相关分析显示,食管癌组织中hTERT表达与MTA1表达呈正相关（r=0.645,P=0.000）。随访36个月后,患者存活33例,存活率41.25%（33/80）,食管癌组织hTERT阴性、MTA1阴性患者生存率、中位生存期分别为64.29%（9/14）、23.6个月,60.87%（14/23）、24.9个月均显著优于hTERT阳性、MTA1阳性患者的36.36%（24/66）、19.2个月,33.33%（19/57）、18.5个月（P<0.05）。结论：食管癌组织中存在hTERT、MTA1异常高表达,其水平与食管癌的组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移相关,且其表达情况与食管癌患者预后有密切关系。