氯化高铁血红素诱导K562细胞中β-珠蛋白基因表达的研究

以绿色荧光蛋白（EGFP）基因为报道基因,构建了在β-珠蛋白启动子驱动及HS2元件调控下的重组表达载体HG,用脂质体转染法将其转染到K562细胞中,并用RT-PCR方法及流式细胞仪检测氯化高铁血红素(Hm)对K562细胞中β-珠蛋白基因表达及重组载体HG在K562细胞中瞬时表达的影响。结果显示：用30μmol/L Hm诱导K562细胞24、48及72h后,不仅其γ-珠蛋白mRNA水平升高,其β-珠蛋白mRNA水平也明显上升,而且这种诱导作用在诱导24、48h后比较明显;Hm还可增强重组表达载体HG在K562细胞中的瞬时表达。提示Hm诱导红系分化的机理可能与γ→β-珠蛋白基因的转换机制相关。 Abstract: The recombinant plasmid HG was constructed,in which the reporter gene encoding the enhanced green fluorescent protein (EGFP) was driven by the β-globin promoter and regulated under the HS2 element.The inductive effect of hemin on the expression of the β-globin gene and transiently transfected β-globin genes in K562 cells was analysed by FACS as well as RT-PCR method.The results showed that the level of γ and β-globin gene mRNA in K562 cells increased significantly after 24,48 and 72 hours induced with 30 μmol/LHm.And this inductive effect was sronger after 24 and 48 hours.Furthermore,the transient expression of plasmid HG in K562 cells increased significantly with hemin induction.These results indicated that the mechanism of inductive erythroid differentiation with hemin may be correlated with mechanism of γ→β-globin gene.     

在Yunnanese(Aγδβ)0-地贫3′缺失端点下游鉴别到两个增强子样顺序

利用荧光酶报告基因系统搜索了Yunnanese(Aγδβ)0-地中海贫血缺失3′端点下游11.5 kb区域内的调控顺序.确定缺失3′端点立即下游区1.7 kb片段,在人红白血病细胞K562及鼠红白血病细胞MELGM979中,可使γ-珠蛋白基因启动子驱动的荧光酶基因表达增加3.8～4.0倍,而在HeLa细胞中仅增加1.5倍.位于缺失3′端点约10 kb的一个长1.4 kb片段在K562和MELGM979中,可使γ-基因启动子驱动的荧光酶基因表达增加2.4～2.9倍,而在HeLa细胞中无增加.结果说明这两段顺序均有增强子活性,并且这种活性具有一定的红细胞特异性.进一步证明1.7 kb片段内包含多个转录调节蛋白结合模体的430 bp片段包含了1.7 kb片段的大部分增强子活性.这些结果为缺失导致增强子样顺序并入到接近Gγ-基因,是Yunnanese(Aγδβ)0-地贫缺失突变体中胎儿Gγ-珠蛋白基因,在成人期持续活跃表达原因的假设提供了实验证据.     

在Yunnanese(Aγδβ)0-地贫3′缺失端点下游鉴别到两个增强子样顺序

利用荧光酶报告基因系统搜索了Yunnanese(Aγδβ)⁰-地中海贫血缺失3′端点下游11.5 kb区域内的调控顺序.确定缺失3′端点立即下游区1.7 kb片段,在人红白血病细胞K562及鼠红白血病细胞MELGM979中,可使γ-珠蛋白基因启动子驱动的荧光酶基因表达增加3.8～4.0倍,而在HeLa细胞中仅增加1.5倍.位于缺失3′端点约10 kb的一个长1.4 kb片段在K562和MELGM979中,可使γ-基因启动子驱动的荧光酶基因表达增加2.4～2.9倍,而在HeLa细胞中无增加.结果说明这两段顺序均有增强子活性,并且这种活性具有一定的红细胞特异性.进一步证明1.7 kb片段内包含多个转录调节蛋白结合模体的430 bp片段包含了1.7 kb片段的大部分增强子活性.这些结果为缺失导致增强子样顺序并入到接近Gγ-基因,是Yunnanese(Aγδβ)⁰-地贫缺失突变体中胎儿Gγ-珠蛋白基因,在成人期持续活跃表达原因的假设提供了实验证据.     

羟基脲(Hydroxyurea)对细胞周期与珠蛋白基因表达的影响(简报)

已有许多证据表明羟基脲能增加镰状细胞贫血及β-地贫病人的胎儿型血红蛋白(HbF)的合成。最近,有人报道羟基脲也能使一些患有β-地贫病人的β-珠蛋白基因表达增加。K562细胞是人红白血病细胞株,它只能表达胚胎型(ε-)与胎儿型(γ-)珠蛋白基因,而不能表达成年型(β-)珠蛋白基因。因此,K562     

氯化高铁血红素诱导K562细胞中β-珠蛋白基因表达的研究

以绿色荧光蛋白（EGFP）基因为报道基因,构建了在β－珠蛋白启动子驱动及HS2元件调控下的重组表达载体HG,用脂质体转染法将其转染到K562细胞中,并用RT－PCR方法及流式细胞仪检测氯化高铁血红素（Hm)对K562细胞中β－珠蛋白基因表达及重组载体HG在K562细胞中瞬时表达的影响。结果显示：用30μmol/L Hm诱导K562细胞24、48及72h后,不仅其γ－珠蛋白mRNA水平升高,其β－珠蛋白mRNA水平也明显上升,而且这种诱导作用在诱导24、48h后比较明显;Hm还可增强重组表达载体HG在K562细胞中的瞬时表达。提示Hm诱导红系分化的机理可能与γ→β珠蛋白基因的转换机制相关。     

人体β-珠蛋白基因5’旁侧调控元件与不同发育时期调控因子的相互作用

人β-珠蛋白基因主要在成年期的骨髓中表达,在胎儿肝,成年肝和K 562细胞中则处于关闭状态。凝胶电泳阻抑法分析发现,在人胎儿肝,成年肝及K 562细胞的核蛋白抽提物中存在着不同的与β-珠蛋白基因5'旁侧调控元件(-372到-194 bp)相结合的红系组织特异性的调控因子。竟争试验的结果表明,成年肝和K 562细胞中的调控因子与β-珠蛋白基因5'旁侧调控元件相互作用的方式具有一定的相似性,这两种细胞的调控因子既结合于负调控区(NCR 2)也结合于正调控区,说明两种细胞中β-珠蛋白基因的关闭机制可能是相似的。胎儿肝的核蛋白因子只结合于负调控区,推测在胎儿期存在独特的关闭机制。     

与人体β-珠蛋白基因5'旁侧正调控区(PCR)相结合的调控因子(简报)

β-珠蛋白基因簇是研究真核基因表达时空秩序性的理想模型,在它的5个结构基因(ε,~Aγ,~Gγ,δ和β)中,成年型的β-珠蛋白基因主要在出生后人的骨髓中表达。过去的研究表明,在β-珠蛋白基因的5′旁侧序列内至少存在三个调控元件,即两个负调控区     

用胞核切口转译法对人β型血珠蛋白基因的染色质结构研究

采用核切口转译改良法,对K 562细胞及HES细胞核中的人β型血红蛋白基因的染色质结构进行了分析。以~(32)P-三磷酸脱氧核苷酸作为底物,用E.coli DNA聚合酶对经。DNaseⅠ轻度消化的细胞核进行切口转译标记。然后从核中抽提出总DNA并以其为探针对经Sou-thern转移的β型血珠蛋白及其它一些基因的酶解片段进行杂交。结果表明,在K 562细胞核中,所有β型血珠蛋白基因(ε,γ,δ及β)以及18 S核糖体RNA基因均被选择性标记上了,而不表达基因:α-乳糖蛋白及c-sis基因则否。然而在HES细胞核中仅有18 S核糖体RNA基因被标记上。此表明活跃基因的染色质结构松弛,对DNase Ⅰ酶的消化较为敏感。     

碱性Krueppel样因子对和珠蛋白基因的转录调控作用

为探索碱性Kruppel样因子（basic Krueppel-like factor,BKLF)对γ-和ε珠蛋白基因的转录调控作用,构建了人类BKLF(hBKLF)基因全长及N端缺失40个氨基酸的真核表达载体,并将其瞬时转染到COS7细胞中做报告实验。结果表明,hBKLF能够抑制γ-和ε-珠蛋白基因启动子的活性,而hBKLF特异的反义核酸则激活这两种基因的启动子。N端缺失40个氨基酸不影响这种转录抑制功能。hBKLF强烈抑制FKLF(embryonic/fetalβ-like globin gene-activating Krueppel-like factor)引起的对γ-和ε-珠蛋白基因的转录激活作用。另外BKLF基因能够与SHP1（SH2-containing protein tyrosine phosphatase1)基因启动子区的CACCC元件结合。这些结果提示γ-和ε-珠蛋白基因可能是BKLF的转录调控对象,为研究BKLF参与血细胞特异表达基因的调控提供了依据。     

基因座控制区元件HS2、HS3对β-珠蛋白基因表达的调控

用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报道基因,通过构建不同的真核表达载体,并用脂质体转染法将其转染到K562及MEL细胞中,经流式细胞仪检测、半定量RT-PCR及荧光倒置显微镜下观察荧光表达情况,以研究HS2、HS3、HS2-HS3及近侧元件在瞬时表达中对β-珠蛋白基因启动子驱动下的EGFP表达调控情况.结果显示,3.2kb的HS2元件在K562及MEL细胞中均可增强β-启动子活性,而3kb的HS3仅在MEL细胞中有增强作用,且两者在两种细胞中均无明显协同作用.     

人类原钙粘蛋白基因簇调控元件的克隆及对其启动子活性的影响

人类原钙粘蛋白(Protocadherin,Pcdh)基因簇包含53个成串排列非常相似的基因,组成3个紧密相连的基因簇(α,β和γ)。原钙粘蛋白基因簇γ通过启动子选择性表达产生神经元细胞膜表面的分子多样性,但是,该多样性产生的分子机制还不清楚。调控元件HS7L和HS5-1aL作为候选的增强子可能具有调控Pcdhγ基因表达的作用。利用分子克隆的方法,将调控元件HS7L和HS5-1aL分别克隆至包含γa9、γa10、γb3、γb7和γc3启动子的荧光素酶报告基因的下游。通过荧光素酶报告基因试验检测其对该5种Pcdhγ启动子活性的影响,发现HS7L对5种启动子活性具有增强作用,HS5-1aL对γa10启动子活性具有增强作用。之后,通过基因沉默绝缘子CTCF,发现下调CTCF不仅降低γb1基因表达,而且能够显著降低γb1启动子报告基因活性。试验结果表明调控元件HS7L和HS5-1aL能够增强Pcdhγ启动子活性,推测可能通过CTCF介导的增强子-启动子相互作用调控Pcdhγ的细胞特异性基因表达。     

位点控制区(LCR)调控基因表达的研究进展

最早在人类β珠蛋白基因座中发现的位点控制区(locus control regions,LCR)对于珠蛋白基因在红细胞分化和发育过程中的特异性表达起着重要作用。LCR位于珠蛋白基因上游6～25 kb,由至少7个DNaseⅠ超敏感位点所组成,具有很强的增强子活性,可以激活和促进珠蛋白基因的转录。LCR增强子活性具有组织特异性,并与拷贝数成正比。此外,LCR还参与基因在细胞核内的定位、组蛋白修饰、染色质开放、边界结构域形成,以及DNA复制起始等精细调控过程。有多个模型阐述LCR远程调控基因表达的分子机制,被普遍接受的是成环模型(looping model)。在生长激素(GH)、T_H2细胞因子、MHCⅡ等基因区域也发现有类似珠蛋白的LCR结构,都在深入研究之中。     

HMG蛋白质与人β-类珠蛋白基因5′上游LCR内HS2core DNA相互作用

HMG蛋白质是真核细胞核内一组含量丰富的非组蛋白,它们在染色质的结构与功能及基因表达调控过程中均起着重要作用.应用体外核小体重组技术和凝胶电泳阻抑法,分析了HMG蛋白质与人β-类珠蛋白基因5′上游LCR内的DNaseⅠ超敏感点2核心DNA序列(HS2core sequence,-10681～-10970 bp)之间的作用模式.实验结果表明,HMG蛋白质(1/2)能与HS2core DNA序列相结合,但HMG蛋白质(14/17)不能与它结合.将HS2core DNA在体外组装成核小体之后,HMG蛋白质(1/2)则不能与组装成核小体形式的HS2core DNA序列结合,而HMG蛋白质(14/17)却能与它结合.结果提示当HS2core DNA序列处于不同状态时,它与HMG蛋白质的结合模式是不同的,HMG蛋白质可能通过这一途径积极参与了人体β-类珠蛋白基因的表达调控.     

在Yunnanese(Aγδβ)~0-地贫3′缺失端点下游鉴别到两个增强子样顺序

利用荧光酶报告基因系统搜索了Yunnanese (Aγδβ) 0 地中海贫血缺失 3′端点下游 11 5kb区域内的调控顺序 .确定缺失 3′端点立即下游区 1 7kb片段 ,在人红白血病细胞K5 6 2及鼠红白血病细胞MELGM979中 ,可使γ 珠蛋白基因启动子驱动的荧光酶基因表达增加 3 8～ 4 0倍 ,而在HeLa细胞中仅增加 1 5倍 .位于缺失 3′端点约 10kb的一个长 1 4kb片段在K5 6 2和MELGM979中 ,可使γ 基因启动子驱动的荧光酶基因表达增加 2 4～2 9倍 ,而在HeLa细胞中无增加 .结果说明这两段顺序均有增强子活性 ,并且这种活性具有一定的红细胞特异性 .进一步证明 1 7kb片段内包含多个转录调节蛋白结合模体的 430bp片段包含了 1 7kb片段的大部分增强子活性 .这些结果为缺失导致增强子样顺序并入到接近Gγ 基因 ,是Yunnanese (Aγδβ) 0 地贫缺失突变体中胎儿Gγ 珠蛋白基因 ,在成人期持续活跃表达原因的假设提供了实验证据 .     

miR-24通过靶基因Sp1调控β-类珠蛋白表达

为了研究miR-24对于珠蛋白表达的调控作用,并明确其作用机制.首先采用定量PCR的方法确定miR-24在红系分化过程中的表达变化情况,以及miR-24过表达后珠蛋白的表达变化情况.进而通过报告基因实验以及Western blotting的方法确定miR-24的靶基因.通过表型回复实验证明miR-24是否通过靶基因调控珠蛋白的表达.结果发现在hemin诱导的K562细胞以及EPO诱导的造血干/祖细胞向红系分化过程中,miR-24表达上调,在K562细胞中过表达miR-24可以促进红系分化过程中ε-和γ-珠蛋白的表达上调,进一步的研究表明miR-24是通过靶基因Sp1来行使对珠蛋白的调控作用的.以上结果表明miR-24通过负调节其靶基因Sp1促进红系分化过程中珠蛋白的表达上调.     

基因座控制元件HS2、HS3对β—珠蛋白基因表达的调控

用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为报道基因,通过构建不同的真核表达载体,并用脂质体杂法将其转染到K562及MEL细胞中,经流式细胞仪检测、半定量RT－PCR及荧光倒置显微镜下观察荧光表达情况,以研究HS2、HS3、HS2－HS3及近侧元件瞬时表达中对β－珠蛋白基因启动子驱动下的EGFP表达调控情况。结果显示,3．2kb的HS2元件在K562及MEL细胞中均可增强β－启动子活性,而3kb的HS3仅在MEL细胞中有增强作用,且两者在两种细胞中均无协同作用。     

hhlim基因转录调控区域鉴定及表达调控的初步研究

为了研究hhlim基因表达调控机制,对该基因5′上游－2 537 bp序列从5′端依次进行缺失后,利用荧光素酶报告基因检测各种不同长度片段在C2C12细胞中驱动荧光素酶表达的活性.结果表明,在hhlim基因5′上游－2 537～－1 537 bp之间存在负调控元件,在－253～－157 bp之间含有增强子样序列.用含有增强子样序列的DNA片段做探针,对未分化型和分化型C2C12细胞的核蛋白进行电泳迁移率改变分析(electrophoretic mopility shift assay, EMSA).分析的结果显示,两种表型细胞中的核蛋白与探针结合所形成滞后带的谱型明显不同.结果还发现内皮素-1(ET-1)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)既能显著诱导C2C12细胞对hhlim的表达,也能刺激含增强子样序列的调控区域所驱动的报告基因表达.提示hhlim基因转录起始点至－2 537 bp的区域内含有负调控元件及增强子样序列,该基因的表达受ET-1和bFGF的调节.     

腺相关病毒介导基因组来源的基因转移与整合

构建一个带β-珠蛋白基因组序列的腺相关病毒载体AV53HS2Δβ2Neo.经包装成重组腺相关病毒后,转导红系细胞.DNA印迹证实包含红系增强子、β-珠蛋白基因和筛选标志基因的前病毒基因组完整整合于红系细胞基因组中.结果说明腺相关病毒载体能介导基因组序列来源的目的基因稳定整合于受体细胞基因组中.     

SOCS-3过表达对红系基因表达的影响

目的:建立能稳定、高效表达细胞因子信号转导抑制因子-3(SOCS-3)的细胞株SOCS-3-K562,为探讨SOCS-3在造血发育中的作用奠定基础。方法:通过重组慢病毒系统感染人红白血病细胞K562,采用流式细胞分选术,根据绿色荧光蛋白表达情况,获得稳定高表达SOCS-3的K562细胞;利用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹实验,比较分选获得的细胞与对照细胞的SOCS-3表达差异;利用半定量PCR检测SOCS-3表达升高对K562红系发育相关基因GATA-1、β-globin表达水平的影响。结果:构建了人SOCS-3慢病毒表达载体;与对照组相比,通过流式细胞分选获得的K562细胞的SOCS-3基因表达水平升高8.05倍,蛋白表达水平升高3倍;SOCS-3表达升高后,K562细胞的GATA-1、β-globin基因表达受到明显抑制。结论:SOCS-3在造血发育中有重要的调控作用,而对其表达进行改变将在规模化的造血细胞定向诱导研究中发挥重要作用。     

人β-簇珠蛋白基因LCR调控元件中HS3与反式调控因子相互作用的研究

人β-簇珠蛋白基因LCR调控元件位于ε-珠蛋白基因5’上游20Kb内,由四个DNase-Ⅰ超敏感点(HS1-HS4)组成。已有转基因实验表明,HS3可能与发育早期的胚胎型ε-珠蛋白基因表达调控相关。基因调控是通过调控元件与调控因子的相互作用而完成的。为了揭示HS3的调控作用,我们选用了发育不同时期的小鼠胚胎造血组织作为材料,用凝胶电泳阻抑法,分析了调控因子与HS3的结合。我们的实验结果表明,怀孕13天和18天的小鼠胚胎造血组织的核蛋白因子与HS3的结合模式完全不同;同时我们用Southwestern Blot的方法进一步证明了这种差异性的存在。现已知HS3中有GA-TA和CACCC两类转录因子结合的motif,采用竞争实验分析,发现CACCC motif对结合区带没有竞争作用,而GATA有竞争作用;另外还存在没有被竞争的条带,我们推测它们可能是一类新的、发育时期专一性的核蛋白因子。Western Blot的实验结果表明,在基因调控过程中起到重要作用的红系转录因子GATA家族中的GATA-1和GATA-2的表达也具有时期专一性:即怀孕13天的小鼠造血组织中表达GATA-2,不表达GATA-1;而怀孕18天的小鼠造血组织中则表达GATA-1,不表达GA-TA-2。因此,我们推测,HS3很可能参与时期专一性的基因表达调控,其中时期专一性的蛋白因子可能起到了重要作用。