粉菠萝组蛋白去乙酰化酶基因AfHDI的克隆及在乙烯处理下的表达分析

组蛋白修饰在植物发育和防御反应中发挥着重要的作用。为研究组蛋白去乙酰化酶基因肋,的基本特征及其在乙烯调控凤梨科植物开花过程中的生物学功能,通过筛选粉菠萝茎尖转录组测序数据并结合RACE技术分离得到AfHDl基因cDNA全长序列。该基因的开放阅读框长为1548bp,编码516个氨基酸,其理论分子量为58．28kDa,等电点为5．23。由该基因编码的蛋白属于组蛋白去乙酰化酶RPD3／HDAl超家族成员,具有该家族特有的HDAC保守结构域,该蛋白与水稻和玉米中HDl蛋白的同源性均达到87％。实时荧光定量PCR分析表明,AfItDI基因的表达受乙烯诱导,处理后1d的表达量与0h相比,提高了4倍,推测组蛋白去乙酰化酶基因AfHDJ可能与粉菠萝的乙烯信号反应有关。     

菠萝粉蚧的生物学特性及防治

菠萝粉蚧DysmicoccusbrevipesCockerell[1],又名菠萝洁粉蚧,属同翅目、粉蚧科,是菠萝的重要害虫。国内该央主要分布于粤、桂、琼、台、闽等省（区）。1986年海南岛严重发生菠萝粉蚧为害,导致菠萝大面积凋萎。当年下半年广东湛江的湖光农场从海南购回卡因菠萝种苗,植后在1987年下半年菠萝粉蚧危害严重。湛江的金星农场农科所当时已建立的菠萝引种园,普遍发生粉蚧为害,其中以引进的卡因新品种如泰国卡因等受害严重。为此,1985～1988年笔者对菠萝粉蚧的发生与防治进行一了研究,结果如下。1生活史与习性1．1生活史菠萝粉蚧孤雌生殖,成…     

菠萝粉蚧和新菠萝灰粉蚧溴甲烷熏蒸处理研究

菠萝粉蚧Dysmicoccus brevipes (Cockerell)和新菠萝灰粉蚧Dysmicoccus neobrevipes(Beardsley)是菠萝等热带水果上的重要害虫,均属我国进出境水果贸易中需要检疫处理的对象.为了建立两种粉蚧有效的除害处理方法,本文测定了溴甲烷熏蒸2h对两种粉蚧各虫龄的致死毒力.结果表明,两种粉蚧对溴甲烷具有相似的毒力反应,1龄若虫的耐药性明显低于其它各虫龄.菠萝粉蚧LC99最大值在19.4℃和28.8℃下均为3龄若虫,分别为30.32 g/m3和18.17 g/n3;新菠萝灰粉蚧LC99最大值在19.2℃和29.4C下分别为3龄若虫和成虫,分别为29.19 g/m3和18.41 g/m3.确认实验表明,在25℃下,采用熏蒸剂量25 g/m3,在19℃下采用40 g/m3熏蒸2h可以使菠萝粉蚧和新菠萝灰粉蚧达到安全检疫处理要求.     

菠萝果实发育相关RFD1基因的克隆及表达

Blast菠萝果实不同发育时期的cDNA文库测序结果,并用信息生物学软件和相关网站进行拼接和分析,设计特异引物RT-PCR．得到一个2750bp、编码761个氨基酸的全长基因序列,命名NRFD1。预测该蛋白是一个亲水性、且具有多个磷酸化位点的分泌性蛋白,可能位于叶绿体中。半定量PCR分析发现RFD1基因表达量在果实发育期不断增加,70d达到最高：而在70d果实的不同部位并没有显著差异性,仅果实外部略有增高。     

菠萝粉蚧和新菠萝灰粉蚧γ-射线辐照处理研究

菠萝粉蚧Dysmicoccus brevipes(Cockerell)和新菠萝灰粉蚧Dysmicoccus neobrevipes(Beardsley)是菠萝等热带水果上的重要害虫,是我国进出境水果贸易中均需要检疫处理的对象。为了建立适合菠萝等水果上这两种粉蚧的检疫处理技术,本研究采用80、130、180、230和280 Gyγ-射线辐照处理了两种粉蚧的若虫和成虫。结果表明,两种粉蚧对γ射线的剂量反应基本一致,表现为随虫龄增大对辐照的耐受性增强,以雌成虫为最强。采用230Gy辐照若虫,两种粉蚧各若虫均不产生F1代活虫体,并且菠萝粉蚧1龄若虫在该剂量下不能发育至雌成虫。以230 Gy辐照成虫,两种粉蚧均产生F1代雌成虫,但不产生F2代。以240 Gy剂量大规模辐照处理3龄若虫和雌成虫,表明该剂量足以阻止两种粉蚧繁殖,该剂量可作为这两种粉蚧辐照处理的参考指标。     

菠萝花发育相关基因AcMADS1的克隆与组织表达特性分析

MADS-box转录因子在植物的发育过程特别是控制花器官的诱导与发育中起关键作用。利用同源克隆结合RACE技术, 从菠萝(Ananas comosus)花中分离出1个新的菠萝MADS-box基因, 命名为AcMADS1(GenBank登录号为KC257408)。AcMADS1基因的编码区为726 bp, 编码241个氨基酸, 蛋白质分子量为27.50 kDa, 等电点为9.26。序列比对和系统进化树分析表明, AcMADS1具有保守的MADS-box及半保守的K区, 属于AGL6亚家族MADS-box蛋白。生物信息学分析表明, AcMADS1是亲水碱性蛋白, 二级结构主要以α-螺旋、无规则卷曲和折叠延伸链为蛋白质骨架, 三级结构中蛋白核心结构符合转录因子与DNA结合的常见功能域MADS-box, 而且作为转录因子定位于细胞核中。组织特异性表达分析表明, AcMADS1基因在菠萝果肉以及花器官的雌蕊、花瓣和萼片中均有表达, 但在雄蕊以及营养器官的根、茎和叶中几乎不表达; 且在花器官早期发育过程中大量表达, 后期呈下降趋势。因此推测这个基因可能在菠萝花器官发育和开花诱导过程中起重要作用。     

茶树谷氨酰胺合成酶同源基因的克隆及表达分析

在实验室前期构建cDNA幼根文库获得谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS,EC 6.3.1.2)同源序列(contig48)的基础上设计引物,通过SMART RACE技术克隆了该基因cDNA全长序列(命名为GS1-2,GenBank登录号:JQ925873.1)。结果显示:(1)GS1-2基因全长为1 710bp,开放阅读框长1 071bp,编码356个氨基酸,预测蛋白分子质量为39.3kD,理论等电点为5.65;核酸序列分析表明,GS1-2基因与从安吉白茶中克隆的茶氨酸合成酶基因相似性为99%。(2)将GS1-2基因克隆至原核表达载体pET-32a和pMAL-c5x,转化至大肠杆菌,IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE检测结果表明,pET-32a-CsGS1-2转至Rosetta中诱导表达的蛋白与预测蛋白大小一致,主要以包涵体形式存在;而pMAL-c5x-CsGS1-2转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达可产生可溶性蛋白。(3)进一步构建茶树GS1-2酵母表达载体pYES-DEST52-CsGS1-2并转化至酿酒酵母(WAT11)菌液中,添加底物(谷氨酸钠100μmol/L和盐酸乙胺500μmol/L)震荡培养并离心,UPLC-MS测定酶反应产物结果初步表明,目的蛋白不能催化盐酸乙胺和谷氨酸钠合成茶氨酸,但可以合成谷氨酰胺。     

菠萝洁粉蚧天敌调查及香港角毛瓢虫的捕食作用研究

调查发现我国雷州半岛菠萝洁粉蚧Dysmicoccus brevipes的天敌有4科8种,其中香港角毛瓢虫Horniolus hisamatsui Miyatake、丽草蛉Chrysopa formosa Brauer及一种瘿蚊Aphidoletes sp是优势天敌。香港角毛瓢虫Hhisamatsui、细毛小瓢虫Scymnus (Pullus) syoitii Sasaji为广东新记录种。香港角毛瓢虫Hhisamatsui捕食菠萝洁粉蚧的量随猎物密度的增大而增加,且随着龄次的增加而增加,但当猎物密度达到一定程度后,其增长率就随猎物密度的增大逐渐减缓,即捕食量与猎物密度为逆密度制约关系,呈负加速曲线,以Holling(1959）圆盘方程进行模拟的结果是属于Holling-Ⅱ型。香港角毛瓢虫1龄、2龄、3龄、4龄幼虫和成虫对菠萝洁粉蚧2 龄若虫的理论最大捕食量分别为1153头/天、2611头/天、6173头/天、7042头/天、7407头/天。     

基于RNA-Seq高通量测序技术的菠萝洁粉蚧转录组研究

为了探索调节昆虫世代历期的相关基因,研究了菠萝洁粉蚧在转录水平上对温度的响应。组装后获得49 898个Unigenes,其平均长度为1 007 bp;其中有15 015 (30.10%)个Unigenes被成功注释到Nr、SwissProt、KOG和KO等功能数据库中。DEG分析表明,7 960个Unigenes被诱导差异表达,其中MIX21相对于MIX27表达量上调的有5 080个,下调的有2 880个。差异基因代谢通路分析表明,差异表达基因中涉及长寿调节途径(Longevity regulating pathway)的有3个通路,其中21℃饲养下的菠萝洁粉蚧种群胰岛素/IFG-1信号通路关键因子DAF-2、雷帕霉素靶标TOR信号通路关键因子RSK-1和S6K显著下调,相关因子被抑制表达,很好地解释了其世代发育历期比27℃饲养下长的现象。21℃饲养下的菠萝洁粉蚧种群HSP60较27℃饲养下的显著上调,而HSPs有上调也有下调,显示热休克蛋白HSP对温度的反应呈现一定的多样性、复杂性。这些发现将有助于今后昆虫寿命分子调节机制的研究,DAF-2、S6K、RSK-1等相关基因未来或将应用于调节一些经济昆虫的生长周期。     

棉花粉蚧化学感受蛋白基因PsCSP10的克隆及表达谱分析

本研究克隆出了棉花粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley化学感受蛋白(CSPs)基因Ps CSP10的全长c DNA(Gen Bank登录号:KT958555),其核苷酸序列长640 bp,编码128个氨基酸,预测其成熟蛋白分子量14.99 k D,等电点6.61,且含有4个保守的半胱氨酸,符合昆虫CSPs的典型特征。该基因编码的氨基酸序列和其他昆虫化学感受蛋白基因编码的氨基酸序列相似性为50%-56%。应用Real-time PCR测定的结果表明棉花粉蚧各发育阶段中Ps CSP10均有表达,但在雄成虫中的相对表达量显著高于其他发育阶段。在分别用扶桑Hibiscus rosa-sinensis L.、棉花Gossypium hirsutum L.、马缨丹Lantana camara L.饲养获得的雄成虫中Ps CSP10相对表达量不存在差异。研究结果为进一步明确棉花粉蚧中Ps CSP10的功能奠定了基础。     

蜻蜓凤梨开花相关基因AfFPF1初步研究

FPF1 (flowering-promoting factor 1)是参与植物开花期遗传控制的重要家族之一。迄今为止,人们对蜻蜓凤梨中FPF1家族了解有限。本研究以热带花卉蜻蜓凤梨为材料,基于转录组测序数据,克隆获得AfFPF1基因。该基因编码的蛋白含103个氨基酸,分子质量为12.06 kD。AfFPF1转录本在蜻蜓凤梨的根中显著高表达,此外其表达量受外源乙烯强诱导,且响应赤霉素。AfFPF1基因在拟南芥中异位表达使其开花时间提前,莲座叶数目减少,促进其根系生长。对转基因拟南芥内源开花基因进行表达量检测,发现转基因植株中,一些开花促进基因如AtFT、AtAP1、AtLFY、AtFUL、AtSOC1表达量显著升高,而抑制开花基因AtFLC表达量下调,进一步证实AfFPF1能正调控拟南芥的开花时间,且可能与这些基因相互作用。研究结果初步证实AfFPF1可能参与调控蜻蜓凤梨开花过程,为进一步研究AfFPF1功能、通过基因工程调控蜻蜓凤梨开花以及乙烯诱导蜻蜓凤梨开花分子机制提供了理论依据。     

蜻蜓凤梨花发育相关B类MADS-box基因克隆及表达分析

为探索MADS-box基因在凤梨花发育过程中的调控机制,通过设计简并引物,利用RACE技术,从蜻蜓凤梨花蕾中分离得到2个花发育相关B类MADS-box基因,分别命名为AfAP3和AfPI;AfAP3cDNA全长957bp,编码区编码226个氨基酸;AfPI cDNA全长808bp,编码区编码198个氨基酸,二者均具有典型的植物MADS-box蛋白结构.RT-PCR分析结果表明,AfAP3和AfPI基因主要在花器官中表达,在根系中也有微量表达;乙烯诱导后7d,AfPI基因在茎尖处开始有表达,表明此时蜻蜓凤梨花芽分化可能已经完成,AfAP3基因表达晚于AfPI.     

建兰Actin基因cDNA全长的克隆及其表达分析

根据单子叶植物的肌动蛋白基因(Actin)的保守区序列设计引物,采用RT-PCR和RACE技术从建兰(Cymbidium ensifolium)中分离出Actin基因cDNA全长.序列分析结果表明,建兰Actin基因长度为1 434 bp,编码区长度为1 134 bp,编码377个氨基酸,将其命名为CeActin,GenBank登录号为JN613147.CeActin推导的氨基酸序列与其他植物的同源性都较高,具有高度的保守性.采用半定量RT-PCR技术分析CeActin在建兰各组织及花不同发育时期的表达情况,结果表明,表达量没有明显差异,表明CeActin基因可作为内参基因.     

鸡akirin同源基因的克隆与组织表达分析

Akirin是最近被发现的,在果蝇和小鼠的免疫炎症反应和调控肌肉 发生再生中起着重要作用的新基因．本实验采用电子克隆技术成功克隆获 得了海兰褐鸡Akirin基因的全长编码序列.利用生物信息学方法对Akirin 基因进行序列分析和预测,并利用半定量RT-PCR技术对雏鸡和成鸡的 Akirin基因进行组织表达谱分析．结果表明,鸡Akirin同源基因可读框长 576 bp,进化保守高,编码蛋白的氨基酸序列存在PFAM、RGS、TOP1Bc、 UTG、HMG和low complexity sequence几种结构域,和蛋白激酶C磷酸化位 点、酪氨酸激酶磷酸化位点和 N端豆蔻酰化位点3个功能位点,同时在鸡 Akirin的3′ 非翻译区预测到1个microRNA靶位点．Akirin在鸡的心、脾、 脑等多种组织中广泛表达,推测鸡Akirin基因是一个可能具有多种功能作 用的新基因．本研究将为深入研究鸡Akirin基因功能作用奠定基础．     

野生马铃薯ANS同源基因的克隆与表达分析

采用PCR和RT-PCR方法从野生马铃薯（Solanum cardiphyllum）分离得到了一个花色素合成酶（anthocyanidin synthase）同源基因ScANS的cDNA（GenBank登录号HQ701726）和DNA序列（GenBank登录号HQ701727）。序列分析表明,ScA册基因全长为1583bp,由一个内含子和两个外显子组成,开放阅读框长度为1365bp,编码一个由454个氨基酸残基组成的蛋白。该蛋白分子量为51．10kDa,理论等电点为5．24。ScANS含有典型的20G—FeII-Oxy保守功能域,属于2-OOD酶家族,其氨基酸序列与茄子的同源蛋白序列一致性最高,达82．86％。组织表达分析表明,SScANS在马铃薯植株的茎、叶和顶芽中有较高水平的转录表达,在根中有微量表达,在匍匐茎和块茎中检测不到。     

甘蓝中BcpLH同源基因的克隆及其表达分析

根据大白菜BcpLH基因设计引物 ,用PCR方法从甘蓝结球期的茎尖组织中克隆到了大白菜BcpLH基因的同源基因BoLH1。序列分析表明 ,BoLH1基因含有 3个内含子 ,cDNA编码 2 45个氨基酸 ,编码的蛋白中存在两个双链RNA结合蛋白结构域 ;Southern杂交结果显示在甘蓝基因组有 1个以上的BoLH1基因拷贝。PCR表达分析表明 ,甘蓝BoLH1同源基因主要在结球期的茎尖组织、球叶和包叶中表达。推测BoLH1基因同BcpLH基因一样以双链RNA结合蛋白的形式在包叶的形成和球叶的发育过程中起作用     

光萼荷属植物SSR反应体系确立与指纹图谱构建

利用正交试验设计优化并确立光萼荷属（Aechmea）植物SSR反应体系,构建部分光萼荷属植物的SSR分子指纹图谱。结果表明：光萼荷属植物的最佳SSR反应体系为10 μL总体积包括1×PCR buffer、Mg²⁺ 2.0 mmol·L^-1、dNTPs 200 μmol·L^-1、引物2.5 μmol·L^-1、模板DNA 90 ng和Taq DNA聚合酶1.5 U。利用该体系和6对SSR引物对15份光萼荷属植物进行扩增反应和电泳检测,其中M1、M3、M4等3对SSR引物扩增图谱清晰、多态性较高,均能将该15份光萼荷属植物鉴别出来,初步建立了15份光萼荷属植物的SSR分子指纹图谱,进一步证明该SSR反应体系稳定可靠,可以有效用于光萼荷属植物种质资源鉴定。     

鸡Tmem9B同源基因的克隆与序列分析

溶酶体跨膜蛋白9B (TMEM9B,c11orf15)是最近被发现的炎症信号通路中的关键因子,在NF-κB和MAPK信号途径起重要调控作用.本实验采用克隆技术成功获得了海兰褐鸡Tmem9B基因的全长编码序列,并利用生物信息学方法对Tmem9B进行序列分析和测序.结果表明,鸡Tmem9B同源基因编码序列全长570bp,进化高度保守,编码189个氨基酸的蛋白,序列上存在信号肽、Tmemb_9和跨膜序列等几种结构域,并含N端豆蔻酰化位点、N端糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点等3种修饰位点.同时,在鸡Tmem9B基因的开放阅读框内预测到5个microRNA靶位点,Tmem9B在鸡的骨骼肌、肾、脑等多种组织中广泛表达,推测鸡Tmem9B基因可能具有多种功能.本研究将为深入研究鸡Tmem9B基因的功能奠定基础.