野生罂粟RNAi表达载体的构建及遗传转化

通过PCR方法从质粒pGEM-bc中克隆野生罂粟BBE-COR融合基因片段约760 bp,以pHANNIBAL和植物表达载体pCAMBIA3300为基础,将克隆到的BBE-COR融合基因正向和反向片段分别插入pdk内含子的两边,经酶切、PCR鉴定及序列分析表明,特异性RNAi表达载体p3300-pHR构建成功.采用直接转化法,将重组子导入根癌农杆茵AGL1中.以野生罂粟茎尖生长点为转化受体,用农杆茵介导法将目的基因转入野生罂粟中.经卡那霉素和除草剂筛选后,共获得53株转基因植株,PCR检测后,其中14株表现阳性,可初步确定目的基因已经整合到野生罂粟基因组中.     

桃蚜MpAChE基因RNAi表达载体构建及转化

通过害虫取食植物表达害虫发育关键基因dsRNA的转基因植株,分析能否通过抑制害虫特定基因的表达来防控害虫。本研究利用RT-PCR技术从桃蚜中克隆乙酰胆碱酯酶基因383 bp cDNA片段,命名为MpAChE。进一步利用该MpAChE基因片段构建植物RNAi表达载体RNAi-MpAChE,并通过浸花法转化野生型拟南芥,通过卡那霉素抗性筛选转化植株,PCR及Southern杂交进一步鉴定转基因植株。结果表明:克隆的cDNA片段与桃蚜中已克隆的乙酰胆碱酯酶(GenBank登录号AY147797)cDNA序列核苷酸一致性为99%。卡那霉素抗性初步筛选和PCR进一步鉴定,获得25株阳性转基因植株。从25株中随机选择的5株阳性植株,Southern杂交均为阳性。经接种桃蚜初步鉴定,转基因植株对蚜虫的抗性效果不显著。     

白桦BpSPL9基因抑制表达载体的构建及遗传转化研究

为揭示SPL基因在白桦（Betula platyphylla）生长和发育中的功能,在克隆白桦BpSPL9基因的基础上,采用CREST技术构建BpSPL9的抑制表达载体,通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法进行白桦的遗传转化,对获得的转基因株系进行表型观测,探究BpSPL9基因的功能。结果表明：已成功获得了BpSPL9抑制表达白桦株系。转基因株系的苗高显著低于非转基因对照株系,节间距变短,叶面积变小,转基因株系的细胞分裂素（6-BA）和生长素（IAA）含量均低于对照株系。推测BpSPL9基因通过影响生长素和细胞分裂的合成,从而参与植物的生长发育过程。     

水稻OsNCED3基因的RNAi载体构建

水稻OsNCED3基因是水稻抗逆过程中重要的基因之一.以水稻中花10号幼苗为材料,提取基因组DNA.设计引物扩增区段cDNA并引入相应的酶切位点,以基因组DNA作为模板,进行RNAi-OsNCED3顺式和反式目的片段的PCR扩增.将PCR产物连接到pMD19-T载体上,经酶切和PCR检测后进行测序.测序结果表明:RNAi-OsNCED3顺式和反式目的片段均已正确的连接到pMD19-T载体上.然后将RNAi-OsNCED3顺式和反式目的片段通过酶切和连接,连接到含有发夹结构的质粒pFGC5941上.PCR及双酶切结果显示,构建的pFGC5941-OsNCED3即RNAi-OsNCED3载体结构完整.     

梅PGIP基因超表达载体的构建及遗传转化

运用已克隆的梅PGIP基因构建植物超表达载体,将PGIP插入带有启动子super-promoter和终止子nos的中间载体P-Super1300 中,酶切鉴定表明,目的基因已正确地插入载体中.用根癌农杆菌介导法将其转入烟草中,共获得25株潮霉素抗性苗,对其中的13株进行PCR检测,有12株扩增出了目的条带;进一步对其中的7株进行Southern杂交检测和RT-PCR检测,发现7个株系均有杂交带出现,且均发生了基因转录,说明已成功获得了能够表达PGIP基因的转基因烟草.     

丹参SmIPI基因RNA干扰表达载体构建及遗传转化

[目的]构建丹参SmIPI1和SmIPI2基因的RNA干扰植株体系。[方法]利用Gateway技术分别构建SmIPI1和SmIPI2的干扰表达载体p K7GWIWG2D(Ⅱ),并借助根癌农杆菌EHA105菌株介导遗传转化,并通过抗性标记筛选、Egfp荧光和qRT-PCR检测阳性植株和转化效果。[结果]表达克隆构建后转化大肠杆菌菌液PCR检测显示阳性,遗传转化外植体并经抗性培养基继代筛选获得的转化植株根尖在荧光显微镜下呈强烈绿色荧光,且SmIPI1和SmIPI2基因的相对表达量下调幅度分别在64%~82%和23%~78%之间。[结论]成功构建丹参SmIPI1和SmIPI2基因的RNA干扰表达载体并转化丹参植株,为探索SmIPI基因家族成员各自功能问题提供了研究材料基础。     

油菜BnCr4基因RNAi载体构建及植株转化

该实验构建了含甘蓝型油菜黄化相关基因BnCr4特异片段反向重复结构的RNA干扰(RNAi)载体pFGC5941-Cr4,通过根癌农杆菌介导转化油菜,获得47株抗Basta的抗性再生油菜植株,其中10株经PCR鉴定为阳性转基因植株.随机选取3株经鉴定的转基因阳性油菜植株进行半定量RT-PCR分析,结果显示,相对于非转基因的野生型油菜,3株转基因植株中BnCr4基因的表达量分别降低了78.5%、8.5%、11.8%,表明该干扰载体转入油菜能特异引起植株BnCr4基因表达量下降.     

水稻多胺转运蛋白OsPUT1基因过表达载体构建及遗传转化

多胺(腐胺,亚精胺和精胺)不仅参与植物的生长发育调控,还与生物胁迫和非生物胁迫的抗性密切相关。由于多胺具有多重功能,细胞内多胺含量受到严格控制,例如受转运的调节。因此,在水稻中研究水稻多胺转运蛋白OsPUT1的功能至关重要。本研究以OsPUT1为研究对象,借助生物信息学分析,发现OsPUT1蛋白是一种疏水性蛋白,具有12个跨膜结构,定位于细胞核内。通过构建OsPUT1基因过表达载体,借助根癌农杆菌将目的基因转入到水稻愈伤组织的基因组中,以潮霉素进行筛选,通过PCR鉴定,成功获得了20株转基因植株。对其中的4株转基因水稻进一步作实时荧光定量PCR检测,显示全部转基因苗OsPUT1基因表达明显上调,实现了设计目标。这些水稻为进一步研究OsPUT1的功能提供了良好的材料。     

OsbHLH1基因过表达载体构建及转化水稻研究

OsbHLH1基因编码bHLH类转录因子,与水稻耐寒性相关.以pCAMBIA3300为母体,利用玉米泛素(Ubiquitin)启动子构建了能使OsbHLH1基因过表达且含有Bar基因的植物表达载体p3300-Ubi-Ω- OsbHLH1.利用基因枪法将其转化到粳稻品种东稻3号中,获得再生苗47株.选取其中9株进行PCR、Southern检测,结果表明目的基因已经整合到水稻基因组中;草铵膦叶片涂布试验结果表明,Bar基因在水稻植株中正常表达;低温处理后,除45号植株外,其余8株光合速率的变化率显著低于非转基因对照,初步证明OsbHLH1基因在水稻中过表达显著提高了水稻的耐低温能力.     

大白菜orf224基因植物表达载体的构建及遗传转化

为了创制新的大白菜雄性不育材料,双酶切重组质粒pMD18-T-CMS7311-orf224和表达载体pWR306后,将CMS7311-orf224基因与线性表达载体pWR306进行定向连接,构建了细胞质雄性不育线粒体基因CMS7311-orf224的植物表达载体pWR-CMS7311-orf224,通过酶切和PCR验证pWR-CMS7311-orf224载体构建正确.采用快速冻融法,将表达载体导入农杆菌EHA105,转化大白菜材料06J28,对转化植株的GUS、PCR和RT-PCR检测表明,获得了2个大白菜转基因植株.     

小麦TaEDR1基因dsRNAi表达载体的构建及遗传转化

从抗白粉病小麦(TriticumaestivumL.)品系99/2439中分离到一个编码促分裂原蛋白激酶激酶激酶的新基因TaEDR1。为了研究TaEDR1基因在小麦抗白粉菌(Blumeriagraminis(DC.)E.O.Speerf.sp.triticiEm.Marchal)反应中的作用,以单子叶植物高效表达载体pAHC25为基础载体,选择TaEDR1基因编码胞外结构域的、保守性低的cDNA区域作为RNA干扰的目标区段,将这个区段连接成一个反向重复序列(3′→5′//5′←3′),插入到玉米泛素高效启动子Ubi1的下游,构建成双链RNA干扰表达载体pAH-R-TER。利用花粉管通道技术,以高产小麦新品种“周麦18”为受体进行了遗传转化。T0代植株经PPT抗性鉴定、PCR扩增检测,获得了7个转基因植株,为研究小麦TaEDR1基因的功能奠定了基础。     

棉花GhAC01基因植物表达载体构建及拟南芥遗传转化

乙烯参与植物生长发育等许多生理过程,在许多植物细胞中,AcD基因通过促进乙烯合成调控着植物器官的形成发育。研究通过PCR方法从棉花基因组中克隆得到l-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶1（GhACO1）基因,并将该基因构建到植物表达载体PBI121中,其中GhACO1基因位于CaMV35S启动子和GUS报告基因之间。通过花滴法将GhACO1基因转化拟南芥,利用卡那霉素对转化植株进行初步筛选,对卡那霉素阳性植株进行进一步的PCR检测和GUS组织化学分析。结果表明：GhACO1基因已经整合到拟南芥基因组中;GUS组织化学分析显示,在转基因拟南芥叶、茎和根中都表现出GUS活性。研究结果为进一步探讨GhACO1的生物学功能和基因工程改良棉花纤维品质奠定了基础。     

番木瓜β-Gal基因RNAi双T-DNA植物表达载体的构建及其遗传转化的初步研究

克隆了番木瓜(Carica papaya L.)果肉的细胞壁水解关键酶β-半乳糖苷酶(β-GAL)基因保守区,将其反向重复插入载体pKANNIBAL,构建RNAi中间表达载体pKAN/RG,将其上的发夹结构取代经改造的载体pCAMBIA 1300上hpt II基因,构建中间表达载体p1300~-/MFRG,分离单T-DNA区段,与载体pCAMBIA 2301构建RNAi双T-DNA植物表达载体p2301/TTRG.酶切分析和PCR检测表明,p2301/TTRG已被成功导入农杆菌EHA 105.通过遗传转化,初步获得了GUS染色呈阳性且具Kan抗性的番木瓜胚性愈伤组织.     

小麦Vp-1基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化

小麦成熟期穗发芽是世界性的自然灾害,严重影响小麦的产量和品质.Viviparous-1(Vp-1)是促进胚成熟和休眠的主要转录调节因子,与小麦穗发芽抗性有着密切的关系.本实验根据小麦Vp-1基因序列,以植物表达载体pAHC25为基础,成功构建了含有反向重复序列的RNA干扰表达载体pAHC-WVpRi.采用基因枪法轰击小麦品种新春9号幼胚材料1825个,共获得34株T0再生植株.利用Bar基因引物和干扰片段特异引物对再生植株进行PCR检测,获得Bar基因和干扰片段均为阳性的植株3株,转化率为0.16%.本研究为深入分析Vp-1基因功能,进而通过分子育种进行小麦穗发芽抗性的遗传改良提供了科学依据.     

西瓜GGPS基因果实特异性表达载体构建与遗传转化

[目的]将牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPS)基因转化西瓜。[方法]利用RT-PCR技术克隆西瓜果实GGPS基因CDS区;构建由果实特异性启动子AGPL1调控GGPS基因、以nptⅡ为筛选标记基因的植物表达载体,并转入农杆菌EHA105;通过农杆菌介导法对西瓜品种"红一号"进行遗传转化。[结果]经过卡那霉素筛选和PCR初步鉴定,获得4株转基因阳性植株。[结论]构建了GGPS基因果实特异性表达载体,并将其转入西瓜品种"红一号"中,转化效率为0.13%。     

RNAi载体导入黄瓜的遗传转化体系

以黄瓜(Cucumis sativus)子叶和子叶节为外植体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法建立黄瓜遗传转化体系并进行优化,将南方根结线虫(Meloidogyme incognita)寄生相关基因的RNA干扰载体导入黄瓜,通过潮霉素(Hyg)浓度梯度筛选得到99株潮霉素抗性植株。经PCR和Southern-blot检测,获得10株目的基因以单拷贝形式整合的转基因黄瓜,子叶和子叶节的Southern-blot阳性率分别为13.9%和6.9%。该研究建立并优化了RNA干扰载体导入黄瓜的高效遗传转化体系,成功获得了转基因黄瓜植株。     

丹参SmIPI基因RNA干扰表达载体构建及遗传转化北大核心

[目的]构建丹参SmIPI1和SmIPI2基因的RNA干扰植株体系。[方法]利用Gateway技术分别构建SmIPI1和SmIPI2的干扰表达载体p K7GWIWG2D(Ⅱ),并借助根癌农杆菌EHA105菌株介导遗传转化,并通过抗性标记筛选、Egfp荧光和qRT-PCR检测阳性植株和转化效果。[结果]表达克隆构建后转化大肠杆菌菌液PCR检测显示阳性,遗传转化外植体并经抗性培养基继代筛选获得的转化植株根尖在荧光显微镜下呈强烈绿色荧光,且SmIPI1和SmIPI2基因的相对表达量下调幅度分别在64%~82%和23%~78%之间。[结论]成功构建丹参SmIPI1和SmIPI2基因的RNA干扰表达载体并转化丹参植株,为探索SmIPI基因家族成员各自功能问题提供了研究材料基础。     

AtAAPT1基因RNAi的植物表达载体的构建

以拟南芥中氨基乙醇磷酸转移酶基因AAPT1作为RNA i的靶向序列,采用RT-PCR的方法获得目的DNA片段。然后以pBS-T-AAPT1载体为基础,构建了由35 s启动子调控的AAPT1基因RNA i的植物表达载体pART27-AAPT1(1,2),并通过电击法将重组质粒导入根癌农杆菌C58中。AtAAPT1基因RNA i的植物表达载体的构建对于研究AAPT1基因的功能和应用具有重要的理论价值。     

大花杓兰钙依赖蛋白激酶基因克隆及植物表达载体构建

RT-PCR结合RACE技术,克隆到1个全长2079 bp的大花杓兰钙依赖蛋白激酶基因CmCDPK,cDNA为1491 bp,编码496个氨基酸。CmCDPK是1个具有CDPKs典型的Ser/Thr蛋白激酶保守结构域、含1个跨膜结构域、无信号肽、稳定的亲水性蛋白。CmCDPK二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲构成。相对于其他植物CDPKs,CmCDPK与小兰屿蝴蝶兰和铁皮石斛的亲缘关系更近。通过DNA重组技术将CmCDPK片段克隆到pBI121质粒上。PCR、酶切及DNA测序的结果表明,重组质粒pBI-CmCDPK包含1个1491 bp的CmCDPK片段,且核苷酸序列及插入方向完全正确。本研究首次克隆了大花杓兰CmCDPK基因,并成功构建了植物过表达载体pBI-CmCDPK,为CmCDPK基因在烟草中实现遗传转化和功能研究奠定基础。