水稻组蛋白脱乙酰化酶基因HDA705启动子的克隆与表达特性分析

为探讨水稻(Oryza sativa)组蛋白脱乙酰化酶基因HDA705的功能和表达特性,根据NCBI上登录的水稻HDA705基因(GenBank登录号:AK111861)的序列,克隆了5′端2 kb的启动子片段proHDA705,并构建了proHDA705:GUS表达载体。通过农杆菌介导法转化水稻,并获得了转基因株系。GUS检测结果表明,proHDA705仅在水稻的根、茎、叶及部分颖壳的表皮毛等器官中表达,而在花器官中不表达,这表明HDA705具有组织表达特异性。     

人LCRG1基因启动子的鉴定与初步分析

Laryngeal carcinoma related gene 1(LCRC1)是一个喉癌候选抑瘤基因,为进一步深入研究其转录调控机制,应用5'RACE技术确定了该基因的转录起始位点,然后在对人LCRG1基因进行生物信息学分析的基础上,通过PCR定向克隆和酶切亚克隆策略,构建了11种含不同长度LCRG1启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,-169～ 127区域的启动子活性最高.研究提示,LCRG1基因转录所必需的基因启动子序列在-169～ 127范围内.     

拟南芥AtNHX2启动子的克隆及表达模式分析(英)

AtNHX2基因是拟南芥NHX基因家族的一员,编码了一种液泡膜中的Na⁺/H⁺反向运输体并对拟南芥的耐盐能力起着重要的作用.采用PCR扩增的方法克隆了拟南芥AtNHX2基因启始密码子上游约2.8 kb的DNA片段,并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1301-1中,通过基因枪轰击洋葱表皮瞬时表达的方法,初步检测启动子的活性.将重组质粒pCAMBIA1301-1/AtNHX2 promoter转化拟南芥并筛选纯合子.AtNHX2 promoter-GUS分析显示AtNHX2在所有的组织中均有表达,包括根尖.在保卫细胞中检测到了强烈的GUS表达,这一结果表明,AtNHX2对特殊细胞的pH调控和K⁺自身稳定方面起着重要的作用.AtNHX2启动子的活性可被NaCl抑制,并且抑制的强度和NaCl的浓度成正相关. 300 mmol/L KCl处理可增强启动子的活性,说明NaCl和KCl是在转录水平上调控AtNHX2的表达.在老叶中GUS活性比在新叶中GUS活性强,这说明了AtNHX2优先将有毒的离子积累在老叶中,从而有利于植物的正常发育.在根毛细胞中也观测到了强烈的GUS活性,这就暗示了AtNHX2在扩大的液泡中储存Na⁺.     

稀有鮈鲫HSP70基因启动子的克隆及功能分析

热休克蛋白70(HSP70)作为一种分子伴侣,在环境毒理学中受到广泛研究。前期研究表明稀有鮈鲫HSP70基因(GrHSP70)表达量与五氯酚(pentachlorophenol, PCP)处理的浓度和时间在肝脏中呈现剂量/时间-依赖效应。为探究启动子在热休克蛋白70表达调控中的作用,根据已知的GrHSP70 cDNA序列,采用染色体步移技术克隆了GrHSP70的5'侧翼区的核苷酸序列。生物信息学分析从预测的转录起始位点(C)起的5'侧翼区域共1 487bp,潜在的转录因子结合位点包括雌激素响应元件(ERE)、Sp1结合位点(Sp1)、糖皮质激素响应元件(GRE)、TATA结合蛋白(TBP)、CCAAT/增强子蛋白结合位点(C/EBP)、Oct-1结合位点(Oct-1)、GATA转录因子结合位点(GATA-1)等。实验构建了含有启动子缺失片段的萤火虫萤光素酶(firefly luciferase)和海肾萤光素酶(renilla luciferase)报告基因表达载体,瞬时转染HeLa细胞后,利用双荧光活性检测确定获得的GrHSP70启动子具有启动活性,其核心启动位点位于转录起始点上游-1 487~-1 093bp。同时,用不同浓度PCP暴露成功转染了重组质粒(pGL-HSP70 promoter-Luc+)的HeLa细胞,培养24h后检测双荧光活性,与对照相比,随PCP浓度的增加,荧光活性均显著增加。说明在稀有鮈鲫肝脏中PCP会通过激活GrHSP70启动子来诱导GrHSP70表达,但PCP在稀有鮈鲫体内通过何种机制来调节HSP70的合成,仍然需要进一步研究。     

毛白杨PtoGSTF4基因克隆及相关特性鉴定

该研究从毛白杨中克隆到1个Phi类谷胱苷肽S-转移酶（GST）基因（PtoGSTF4）,编码213个氨基酸。表达模式分析发现,PtoGSTF4在正常生长、H₂O₂和莠去津处理后的茎、叶以及茎的韧皮部均表达,属于组成型表达基因。在大肠杆菌中表达并纯化了PtoGSTF4重组蛋白,酶学性质分析表明PtoGSTF4对CDNB、NBD-Cl、NBC和Cum-OOH等4种底物均有活性。动力学分析发现,PtoGSTF4对GSH具有较高的亲和力,而对CDNB的亲和力相对较低。在不同pH及温度条件下对PtoGSTF4蛋白进行活性检测,发现PtoGSTF4在pH 7.5~10.5范围内或30 ℃~60 ℃温度范围内有较高的活性。研究推测,PtoGSTF4可能在毛白杨的抗逆生理中发挥重要作用。     

LCRG1基因启动子关键顺式调节元件的鉴定

LCRG1基因( laryngeal carcinoma related gene1,LCRG1 )是一个新的喉癌候选抑瘤基因,其转录调控机制一直未被阐明．通过限制性内切酶酶切介导对LCRG1基因 (-169～+127)区域进行剪切体分析,将LCRG1基因最小启动子定位于-169～-57．应用连接体扫描突变体分析,将关键顺式作用元件确定在-137～-122．生物信息学提示该区存在SP1、E2F1/DP1、EKLF和ZF9转录因子结合位点．利用已知反式作用因子与报告基因质粒进行共转染,提示Spl为有效的反式作用因子,且能上调LCRG1基因的表达．凝胶迁移阻滞实验确定LCRG1基因关键的顺式作用元件区域具有Spl结合位点．LCRG1基因启动子-137～-122片段在该基因表达过程中可能起重要作用,为LCRG1基因功能研究提供了新的证据．     

Stage-Specific Regulation of Murine Hsp68 Gene Promoter in Preimplantation Mouse Embryos

In early mouse embryos, the major inducible heat shock gene, hsp68, is spontaneously and transiently activated at the two-cell stage and becomes heat-inducible around blastocyst stage. We have probed mouse embryo's ability to activate the promoter of this gene during preimplantation development by expression analysis of DNA constructs containing a reporter lacZ gene driven by hsp68 (hsp70A1) 5′-regulatory sequences of various length: (i) a full-length promoter (construct phsplacZ); (ii) a heat shock element (HSE)-deleted promoter (pΔ1hsplacZ); and (iii) a minimal, proximal promoter (pΔ2hsplacZ). When analyzed in transfected L-cells, phsplacZ was heat-inducible, while neither pΔ1hsplacZ nor pΔ2hsplacZ was. Developmental activity of the full-length construct was first analyzed after genome integration in transgenic embryos and found to follow endogenous hsp68 expression in terms of spontaneous activation at the 2-cell stage, down-regulation at the 4-cell stage, and acquisition of heat inducibility at the 16/32-cell stage. In transient expression experiments, injected phsplacZ, pΔ1hsplacZ, and pΔ2hsplacZ were expressed at similar levels by 2-cell embryos, independently of construct topology and injection stage. At the 4-cell stage, however, phsplacZ and pΔ1hsplacZ were expressed at similar levels, while pΔ2hsplacZ was inactive. Only phsplacZ became heat-inducible in late morulas. We conclude that in early mouse embryos, developmental activity of episomic hsp68 promoter depends on proximal sequences at the 2-cell stage and on putative enhancer sequences at the 4-cell stage, while HSEs appear dispensable during early cleavage.     

长穗偃麦草EeSKOR启动子的克隆及功能分析

为了研究外整流钾通道蛋白(stelar K⁺ outward rectifier channels,SKOR)基因SKOR在长穗偃麦草中的功能,利用热不对称交错PCR(Tail PCR)技术,克隆了长穗偃麦草EeSKOR启动子,并进行启动子顺式作用元件及基因表达分析。结果表明：(1)成功获得长穗偃麦草EeSKOR基因起始密码子上游798 bp启动子序列,命名为pEeSKOR。 (2)EeSKOR启动子除必须具备的核心启动元件外,还含有特异转录因子结合位点、植物激素响应元件、光响应元件、组织特异的启动元件和胁迫响应元件。(3)成功构建植物表达载体pEeSKOR∷GUS,经农杆菌介导的瞬时转化,EeSKOR启动子驱动GUS报告基因可在拟南芥的叶、叶柄和根中表达。(4)实时定量PCR检测显示,在NaCl、PEG、ABA和SA处理下长穗偃麦草EeSKOR基因在根中呈现不同的表达模式,NaCl处理下EeSKOR的表达量呈先下调后上调趋势;PEG处理下EeSKOR的表达量呈上调趋势,且随着时间的延长显著上调;ABA处理下EeSKOR的表达受到抑制且随处理时间延长呈显著下调趋势;SA处理下EeSKOR表现出先上调后下调趋势,且在处理72 h时表达量显著低于正常表达水平。研究认为,EeSKOR基因的表达受NaCl、PEG、ABA和SA的诱导调节。该研究结果为进一步系统研究长穗偃麦草EeSKOR基因功能提供重要理论依据。     

Cloning and sequencing of the HU-2 gene of Escherichia coli

Summary The Escherichia coli HU-2 gene was cloned using a DNA fragment from the HU-1 gene as a probe. The amino acid sequence of the HU-2 protein deduced from the nucleotide sequence is in good agreement with the published sequence. The nucleotide sequence has a possible promoter and a typical ribosomal binding site upstream of the translation initiation codon (AUG) and a possible rhoindependent terminater site downstream of the termination codon (UAA) of the gene.     

pax2启动子的克隆及其在人胚胎肾293T细胞中的转录活性

目的:克隆paired box2(pax2)基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出pax2启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列。将重组的报告基因瞬时转染人胚胎肾293T细胞,检测pax2启动子活性。结果:测序结果显示扩增的pax2启动子序列正确;活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体α(ERα)能以剂量依赖的方式升高pax2报告基因的转录。结论:克隆了pax2启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

Cloning and Characterization of the Murine GPI Anchor Synthesis GenePigf,a Homologue of the HumanPIGFGene

Many eukaryotic proteins are bound to the plasma membrane via a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor. Its core backbone, which is conserved in different organisms, is synthesized in the endoplasmic reticulum by the sequential addition of glycan components to phosphatidylinositol. One of the human GPI synthesis genes,PIGF(phosphatidylinositol glycan complementation class F), which is involved late in the synthesis pathway, has been cloned. In this study, we isolated complementary and genomic clones ofPigf,a murine counterpart ofPIGF. Pigfencodes a 219 amino acid protein that complements a class F mutation. ThePigfgene consists of six exons spanning 30 kb and was mapped to chromosome 17 at 17E4–E5. These features are very similar toPIGF,thus demonstrating the interspecies conservation of structure, function, gene organization, and genetic locus between these GPI synthesis genes. The results also extend a region in murine distal chromosome 17 that is syntenic to human chromosome 2p16–p22.     

拟南芥AtNHX6基因启动子的克隆及表达分析

为了探明拟南芥内膜反向转运体AtNHX6基因的组织表达模式,从基因组中克隆了AtNHX6基因开放阅读框(ORF)上游侧翼调控区1 922bp序列,并成功构建AtNHX6基因启动子与GUS融合表达载体pCAM-BIA1381-proNHX6-GUS,通过农杆菌花序浸染法转化野生型拟南芥获得T3代纯合转基因拟南芥株系,经PCR检测扩增得到2 187bp目的条带。利用组织染色法鉴定转基因拟南芥的GUS表达模式发现,在子叶、下胚轴和花中GUS活性显著。在这些广泛表达的部位中,微管系统中的表达最为显著,真叶中只有局部检测到GUS表达;在根中GUS在根毛和侧根生长部位表达;在未成熟果荚中只有在果荚顶端和基部存在GUS活性,成熟果荚中只在果柄检测到GUS表达;在花中,雄蕊的花丝和花粉粒及雌蕊的柱头中检测到GUS表达。GUS染色分析结果表明,AtNHX6基因启动子与GUS的融合表达载体成功构建并正常启动GUS基因表达,且AtNHX6基因主要在拟南芥的子叶、下胚轴、根、花、果荚中的微管系统、根毛和侧根生长部位以及花丝、花粉、柱头中表达。     

赤桉ACT1和ACT2基因的克隆与生物信息学分析

为了解赤桉(Eucalyptus camaldulensis)肌动蛋白(Actin)在生长发育过程中的功能,根据赤桉幼苗转录组数据库中的肌动蛋白基因序列,从赤桉嫩叶中克隆了2条Actin基因片段,并利用RACE技术获得Actin基因的全长cDNA,分别命名为ECACT1和EC-ACT2基因。生物信息学分析表明,这两条基因的全长cDNA分别为1533 bp和1387 bp,均含有1个编码377个氨基酸的开放阅读框。经比对分析,赤桉Actin蛋白的氨基酸序列与其他植物Actin蛋白的具有较高的相似性,并且具有Actin蛋白特有的保守序列和相关特征。因此推测这两条基因对桉树的生长发育具有一定的调控作用。     

荔枝古树胚性愈伤组织LcCu/Zn-SOD3基因启动子的克隆及功能验证

以荔枝古树"宋荔"胚性愈伤组织为材料,采用接头染色体步移法,分离获得LcCu/Zn-SOD3启动子片段长度为1 426bp,命名为ProLcCSD3(GenBank登录号:KF672186.1)。生物信息学分析表明,该启动子含有多个逆境应答元件、激素应答元件、胚乳特异表达元件,且可能受WRKY和MYB等转录因子调控。通过双酶切方法,以ProLcCSD3替换载体pCAMBIA1301上的CaMv35S启动子,构建了重组质粒p1301-proLcCSD3-GUS,并成功转化农杆菌EHA105和GV3101。注射烟草的瞬时表达分析表明,该启动子片段可以驱动下游报告基因表达。转化拟南芥分析表明,该启动子驱动的下游GUS可以在拟南芥的根、茎、叶中表达,且可响应NaCl、PEG-6000、ABA、MeJA和损伤等非生物胁迫。研究表明,荔枝古树LcCu/Zn-SOD3可能参与多种非生物胁迫应答和激素信号转导途径。     

Characterization of the cyrl-2 UGA mutation in Saccharomyces cerevisiae

Summary cyrl-2 is a temperature-sensitive mutation of the yeast adenylate cyclase structural gene, CYR1. The cyrl-2 mutation has been suggested to be a UGA mutation since a UGA suppressor SUP201 has been isolated as a suppressor of the cyrl-2 mutation. Construction of chimeric genes restricted the region containing the cyrl-2 mutation, and the cyrl-2 UGA mutation was identified at codon 1282, which lies upstream of the region coding for the catalytic domain of adenylate cyclase. Alterations in the region upstream of the cyrl-2 mutation site result in null mutations. The complete open reading frame of the cyrl-2 gene expressed under the control of the GAL1 promoter complemented cyrl-dl in a galactose-dependent manner. These results suggest that at the permissive temperature weak readthrough occurs at the cyrl-2 mutation site to produce low levels of active adenylate cyclase. An endogenous suppressor in yeast cells is assumed to be responsible for this readthrough.     

中间锦鸡儿CibHLH027基因的克隆和功能研究

叶片衰老是植物生长发育的最后阶段,黑暗、干旱和极端温度等会加速叶片衰老过程,严重影响植物的生长发育和作物产量。bHLH(basic helix-loop-helix)属于转录调控因子中的一个大家族,因具有保守性较高的bHLH结构域而得名,广泛存在于真核生物界。在中间锦鸡儿(Caragana intermedia)转录组数据库中得到一条候选bHLH基因全长序列,将其命名为Cib HLH027。正常和黑暗诱导的情况下,CibHLH027-OE株系较WT相比叶片衰老明显,并且黑暗处理后叶绿素含量下降、离子渗透率增大、细胞膜受损严重,说明CibHLH027参与了叶片衰老调控过程。     

Cloning and mapping of murine Nfe2l1

The murine homologue of the human NFE2L1 basic leucine-zipper gene was isolated from an early embryo library. The deduced amino acid sequence shows 97% identity between the two proteins. Significant sequence similarity is also seen with the p45 subunit of NF-E2 and with the Drosophila CNC protein. Murine Nfe2l1 maps to chromosome 11DE with similar sequences at 7D1–7F1 and 2E4–2G.     

基于Tail-PCR分析AN2基因上游启动子活性

黑果枸杞(Lycium ruthenicum)富含花青素,AN2基因是调控黑果枸杞花青素合成代谢的主效基因。为解析AN2基因启动子的活性差异,采用Tail-PCR方法分别克隆了黑果枸杞和红果枸杞(L. barbarum) AN2基因起始密码子上游约1 686 bp (LrAN2p)和1 495 bp (LbAN2p)的序列。Plant CARE预测表明,LbAN2p和LrAN2p中分别有133和137个的顺式作用元件, 其中,参与光调控的顺式元件分别有11和15个;参与激素响应相关的顺式元件分别有13和16个。构建AN2启动子植物表达载体pKGWFS7:LbAN2p和pKGWFS7:LrAN2p,利用农杆菌介导的烟草遗传转化体系获得转基因烟草。GUS染色结果表明,LrAN2p能够驱动GUS在烟草中的表达,叶片呈现蓝色,具有较LbAN2p更强的启动活性,qRT-PCR结果表明,LrAN2p转基因烟草中GUS基因具有更高的转录水平,这可能会使AN2基因在黑果枸杞中具有更高的表达,激活黑果枸杞花青素合成代谢通路。这为解析枸杞果色形成及AN2基因的表达调控机制奠定了理论基础。     

厚藤脱水素基因IpDHN启动子IpDHN-Pro的克隆和调控转录活性分析

为了解厚藤(Ipomoea pes-caprae)脱水素基因IpDHN (GenBank登录号:KX426069)启动子的转录活性和对非生物胁迫和植物激素ABA的响应,通过染色体步移法克隆了IpDHN的上游启动子序列IpDHN-Pro,长度为974 bp。构建IpDHN-Pro调控下GUS转基因载体,转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株获得IpDHN-Pro::GUS转基因植株并进行GUS染色,验证IpDHN-Pro启动转录活性以及在氯化钠、甘露醇、ABA处理后拟南芥GUS基因表达变化。结果表明,扩增获得的IpDHN-Pro序列包含多个顺式作用元件,包括1个ABRE、3个Myb转录因子结合位点、富含TC的重复序列以及Skn-1基序等。转基因拟南芥GUS染色及qRT-PCR表明该序列可驱动GUS基因在拟南芥稳定表达,且表达受高盐、渗透压及ABA的诱导。这表明IpDHN-Pro是一个盐旱、ABA诱导的启动子序列,可应用于相关的植物抗逆遗传工程研究。