CRLE3泛素连接酶复合体研究进展

Cullin—Ring Ligase（CRL）是一大类E3泛素连接酶复合体的统称。它们有着相近的结构,都由cuIlin骨架蛋白、Ring结构域蛋白Rbxl或Rbx2以及底物识别亚基几个部分组成,所包含Cullin骨架蛋白的不同决定了cRL不同的构成与功能特点。经过近20年的研究,对CRL功能和调控机制的理解已取得了很大的进展,该文拟对CRL的研究现状进行简单介绍。     

泛素连接酶复合物骨架蛋白CUL4B功能研究进展

CUL4B属于Cullin家族,该家族成员作为骨架蛋白参与构成真核生物中最大的一类泛素连接酶复合物——Cullin-RING E3泛素连接酶复合物(Cullin-RING E3 ligases, CRLs).由CUL4B作为骨架蛋白构成的CRLs称为Cullin4B-RING泛素连接酶复合物,简称CRL4B复合物,通过催化底物蛋白多泛素化或单泛素化而在多种组织、病理生理过程中发挥重要作用.本实验室和英国研究组几乎同时发现CUL4B突变导致人类智力低下综合征,从此开启了研究CUL4B功能的新方向.利用细胞模型研究发现, CRL4B复合物在调控细胞增殖和DNA损伤修复等生物学过程中发挥重要作用.同时发现, CUL4B在多种实体瘤组织中高表达,通过表观转录调控多种抑癌基因表达来调控肿瘤进程.利用小鼠(Mus musculus)模型研究发现CUL4B在胚胎发育、神经系统发育、生殖细胞发育、髓系细胞分化、脂肪细胞分化、胰岛delta细胞发育等多种组织发育和细胞分化过程中发挥重要作用.本文主要介绍了以上CUL4B功能的研究进展.     

植物F-box基因家族的研究进展

F-box基因家族是植物中最大的基因家族之一,由于其数量巨多,根据其蛋白C末端结构域的不同被分为不同的亚家族。F-box基因编码的蛋白能够调节多种多样的生命活动,如延缓植物衰老、调控植物开花以及响应生物胁迫、干旱和盐等逆境胁迫。近年来,随着全基因组测序的不断完善,越来越多物种的F-box基因被分析鉴定出来。已经鉴定出功能的F-box基因编码的蛋白大多能够和结合蛋白Skp1、骨架蛋白Cullin 1及Rbx1形成SCF复合体,进而参与泛素-蛋白酶途径(UPP)而发挥作用;少部分F-box蛋白以非SCF复合体形式发挥作用。泛素-蛋白酶途径(UPP)是机体重要的调节机制之一,大多数细胞内蛋白都是经过这一途径降解。主要对其蛋白结构,作用途径以及生物学功能进行概述,探讨F-box基因参与的生命活动,旨为F-box的深入研究奠定基础。     

日本三角涡虫体内Djcullin1基因和Djtinp1基因的相互作用研究

Cullin1蛋白是细胞周期进展的重要参与者,也是泛素连接酶E3的重要骨架蛋白.TGF-β信号通路在涡虫再生中发挥着重要作用,其下游分子TGF-β诱导核蛋白(Tinp1)也参与日本三角涡虫Dugesia japonica再生.虽然 cullin1基因和tinp1基因在涡虫体内均呈阳性表达,但二者之间的关系还不清楚.本研...     

宿主细胞膜骨架蛋白在病毒感染复制中作用的研究进展

病毒与宿主细胞之间相互关系的研究不仅具有重要的理论意义,也是重大的医学实践课题.病毒可以与宿主蛋白相互作用并改变细胞的正常功能,从而促进病毒的感染与复制.宿主细胞膜骨架蛋白在病毒的生命周期中起着重要作用,研究表明细胞膜骨架蛋白参与了病毒的感染及复制,尽管许多精细机制尚不清楚,但这扩展了人们对细胞膜骨架蛋白功能的理解.本文重点介绍宿主细胞膜骨架蛋白如肌动蛋白、血影蛋白在病毒进入、细胞内运输、组装和释放等病毒感染复制过程中的作用.     

骨骼肌细胞骨架与被动刚度

骨骼肌细胞骨架按位置可分为细胞核骨架蛋白、细胞质骨架蛋白、细胞膜骨架蛋白和细胞外基质，实现维持细胞核内和细胞膜内稳态、力传导和机械信号转导等功能。近期研究表明骨骼肌细胞骨架蛋白的损伤或缺失大多都伴随被动刚度(passive stiffness, PS)的变化，影响骨骼肌工作能力。该文梳理了骨骼肌细胞骨架蛋白的结构和功能联系及其对PS的影响，这将有助于进一步理解骨骼肌结构与被动性能的关系，开发新策略改善PS，增强骨骼肌功能，并为肌营养不良症等肌病提供新的治疗思路。     

Mnk2与CBCVHL泛素连接酶E3复合物的相互作用

Mnk2即MAPK相互作用的激酶-2(MAP kinase-interacting kinase-2, Mnk2)是MAPK激活的蛋白激酶之一, 具有磷酸化真核翻译起始因子eIF4E(Eukaryotic translation initiation factor 4E)的作用, 但是eIF4E磷酸化的生理功能以及Mnk2在蛋白翻译过程中的确切地位并不清楚. 除了eIF4E外, Mnk2生理底物尚缺乏鉴定. 为了进一步寻找Mnk2新的生理底物, 揭示Mnk2的生理功能, 我们以Mnk2为“诱饵”, 运用酵母双杂交系统发现Mnk2能够与VHL(von Hippel-Lindau tumor suppressor), Rbx1(ring-box 1)和Cul2(Cullin2)相互作用, 并在哺乳动物细胞中验证了Mnk2和VHL的结合. 由于VHL, Rbx1和Cul2均为CBCVHL泛素连接酶E3复合物成分, 所以Mnk2参与了CBC^VHL泛素连接酶E3复合物的相互作用, 可能是其新的泛素化底物. 此外, 在酵母双杂交系统中, Mnk2还与VHL结合蛋白-1(von Hippel-Lindau binding protein 1, VBP1)相互作用, 由于VBP1在细胞骨架蛋白的成熟过程起重要作用并与胚胎形态的发生有关, 所以Mnk2可能还参与了细胞形状的调控.     

Interaction between Mnk2 and CBCVHL ubiquitin ligase E3 complex

MAP kinase-interacting kinase-2 (Mnk2) is one of the downstream kinases activated by MAP kinases. It phosphorylates the eukaryotic initiation factor 4E (elF4E), although the role of elF4E phosphorylation and the role of Mnk2 in the process of protein translation are not well understood. Except for elF4E, other physiological substrates of Mnk2 are still unidentified. To look for these unidentified substrates and to reveal the physiological function of Mnk2, we performed a yeast two-hybrid screening with Mnk2 as the bait. The results demonstrated Mnk2 could interact with VHL (von Hip-pel-Lindau tumor suppressor), Rbx1 (ring-box 1) and Cul2 (Cullin2) proteins in yeast cells. Furthermore, we validated the interaction between Mnk2 and VHL proteins in mammalian cells by co-immunoprecipitation analysis. Because the three proteins VHL, Rbx1 and Cul2 are all components of the CBCVHL ubiquitin ligase E3 complex, it has been shown that Mnk2 can interact with CBCVHL complex, and is probably one of the new substrates of the CBCVHL complex. Furthermore, during the interaction of Mnk2 with von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor- binding protein 1 (VBP1), it appears that Mnk2 also joins to modulate cell shape as VBP1 plays an important role in the process of the maturation of the cytoskeleton and in the process of morphogenesis.     

基于肌红蛋白的氧激活蛋白的理性设计

金属酶催化了生命活动及工业催化中的很多重要反应。天然金属酶的研究往往受限于蛋白质本身结构复杂、表达纯化困难等问题。通过理性设计,可以在分子量小、结构简单、易于表达的骨架蛋白中模拟天然金属酶的结构、光谱和功能,构建人工金属酶。人工酶可以为天然酶的机制研究提供新的平台。本文中,笔者探讨以肌红蛋白为骨架蛋白,通过结构特征的模拟、非天然氨基酸的引入等手段,模拟氧激活蛋白,尤其是氧化酶。综述以对理性设计得到的人工氧化酶的反应中间体进行研究的进展,发现金属酶活性中心的酪氨酸作为催化反应的关键残基,对于氧化反应的调控非常重要;而在小分子量骨架蛋白中模拟天然金属酶是一种人工金属酶分子设计的方法,可以用于研究血红素酶外的其他金属酶。     

CRL4在增殖的肝细胞系中上调乙型肝炎病毒抗原的分泌表达

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）编码的X蛋白（hepatitis B virus X protein,HBx）对HBV感染的起始和维持至关重要。HBx可能作为病毒来源的接头分子,介导Cullin-RING E3泛素连接酶4（cullin-RING ubiquitin E3 ligase 4,CRL4）复合物对染色体外DNA限制因子SMC5/6的降解。最近研究发现CRL4接头分子DNA损伤结合蛋白1（DNA damage-binding protein 1,DDB1）可不依赖与HBx的相互作用而直接上调病毒的表达和复制。本研究基于HBx基因删除（X-null）的HBV重组cccDNA（recombinant covalently closed circular DNA,rcccDNA）模型系统,在多种体外培养肝细胞系中证实上述发现。有意思的是,CRL4刺激rcccDNA^X-null转染细胞抗原分泌表达的效应能被血清饥饿实验抵消。应用尾静脉高压注射小鼠模型,同样发现CRL4并不上调rcccDNA^X-null在非增殖小鼠肝脏细胞中的表达。以上结果提示,细胞增殖特征与CRL4不依赖HBx上调病毒抗原表达的效应密切相关,有助于HBx生物学意义的准确分析和理解。     

ConA激活小鼠胸腺T淋巴细胞增殖过程中c-myc与核骨架蛋白的结合

采用DNA-蛋白质体外吸附的方法研究伴刀豆球蛋白激活小鼠胸腺T淋巴细胞增殖过程中c-myc与核骨架蛋白的结合.实验结果显示,c-myc与核骨架蛋白的结合具有特异性,在淋巴细胞激活过程中c-myc与P₃₄/P₃₆核骨架蛋白及核纤层蛋白结合,并发生动态变化.     

早期脓毒血症患者Gelsolin 与HS-1 蛋白检测及其意义

要目的：探讨脓毒血症患者血小板骨架蛋白Gelsolin和造血系细胞特异性蛋白(HS-1)及其和凝血功能的关系。方法：纳入脓毒 血症患者30 例和对照组健康人群30 例,用双抗体夹心法测定血浆中血小板骨架蛋白,用酶联免疫法测定血清中HS-1 蛋白含 量,采用免疫荧光观察血小板Gelsolin 蛋白的表达,分析Gelsolin、HS-1、血小板计数和凝血功能(PT、APTT)之间的关系。结果：对 照组Gelsolin 主要位于血小板胞浆内,观察组包浆内外及间质内均可见。观察组血小板骨架蛋白Gelsolin、HS-1 水平明显高于对 照组,差异均存在统计学意义(P<0.05)。观察组血小板计数、PT、APTT 水平均低于对照组,差异存在统计学意义(P <0.05)。Galsolin 和血小板计数呈负相关关系,相关系数r = -0.76 (P <0.05),HS-1和血小板计数间呈负相关关系相关系数r = - 0.69 (P<0.05)。结论： 早期脓毒血症患者血小板骨架蛋白Gelsolin 和HS-1表达水平明显升高,与脓毒血症患者血小板大量破坏有关。     

整合素介导小鼠卵内骨架蛋白的重组

研究整合素与卵内骨架蛋白的联系及其是否介导骨架蛋白的重组进而参与卵的激活过程. 5 ~ 8周龄雌性昆明鼠行超数排卵, 用透明质酸酶及MEM酸性液分别去除卵丘细胞及透明带. 用整合素配体的活性片段RGD肽(GLY-ARG-GLY-ASP-SER-PRO, 0.5 mg/mL)与小鼠卵在体外共培养, 以RGE肽(GLY-ARG-GLY-SER-PRO, 0.5 mg/mL)和获能小鼠精子作为对照. 用抗骨架蛋白actin抗体对实验及对照卵行免疫染色, 共聚焦显微镜观察卵内actin的变化, 并对实验及对照卵进行比较. 结果为: (ⅰ) 新鲜排出及经体外培养两小时的两个对照组小鼠卵的免疫染色呈阴性或卵周仅有很弱的荧光带; (ⅱ) RGE肽作用的小鼠卵免疫染色的征象与空白对照没有明显差别; (ⅲ) RGD肽作用不同时间组卵的荧光强度明显增强, 尤以卵周荧光带强而厚, 有的卵周荧光呈不对称分布, 此征象与精子作用后的免疫染色结果相似. 结果表明, 卵膜整合素与卵内骨架蛋白有着直接联系, 整合素配体与卵膜整合素受体结合可能介导卵内骨架蛋白的重组, 从而参与受精过程中的跨膜信号转导过程, 并诱导某些卵激活事件的发生.     

Ezrin蛋白的生物学作用及其与肿瘤转移的关系

Ezrin蛋白是ERM蛋白家族中的一员,最早被发现。人体几乎所有的组织细胞中都有Ezrin蛋白的存在。Ezrin蛋白分子通过磷酸化等方式来激活,暴露其分子上的功能位点,形成具有功能分子结构。亚细胞定位在胞浆中,细胞膜与骨架蛋白之间,通过链接细胞内骨架蛋白与膜蛋白来实现其多项复杂而又重要的功能。近年来发现Ezrin蛋白存在多种功能,包括参与细胞形态学、参与免疫突触的形成,与黏附分子作用进而来调节细胞与细胞或细胞与基质间的黏附、调节细胞运动性等。最重要的是它在多种肿瘤中高表达并促进肿瘤细胞的增殖及转移等活动,参与肿瘤的发生与发展。干扰肿瘤细胞内的Ezrin蛋白表达或抑制其磷酸化后,可以明显抑制肿瘤的转移。所以,Ezrin可能成为将来抑制肿瘤转移研究的潜在靶点。     

人工纤维小体骨架蛋白的分子设计与自组装

纤维小体是厌氧微生物分泌的能够高效降解木质纤维素的一种多酶复合体。其骨架蛋白质的大量重组合成是人工纤维小体构建的关键。为了构建全长的结构复杂的能招募大量酶亚基的骨架蛋白质,本研究对解纤维梭菌Ruminiclostridum cellulolyticum骨架蛋白CipC进行分子模块化设计,并分别与肽-蛋白质共价偶联系统SpyTag/SpyCatcher和SnoopTag/SnoopCatcher融合表达。然后分别通过非固定化和固定化组装策略对人工纤维小体骨架蛋白质进行了初步组装。结果显示,SpyTag和SpyCatcher、SnoopTag和SnoopCatcher之间自发形成稳定的共价异肽键,而且SpyTag和SnoopCatcher, SnoopTag和SpyCacther之间无交叉反应。最终成功组装出含有不同数量黏附域的骨架蛋白质,实现骨架蛋白链的延伸。本研究为构建结构更复杂、活性更高的人工纤维小体提供了新的设计思路并奠定了其技术基础。     

Cullin-RING Ubiquitin Ligase Family in Plant Abiotic Stress Pathways

The ubiquitin-proteasome system is a key mechanism that plants use to generate adaptive responses in coping with various en- vironmental stresses. Cullin-RING (CRL) complexes represent a predominant group of ubiquitin E3 ligases in this system. In this review, we focus on the CRL E3s that have been implicated in abiotic stress signaling pathways in Arabidopsis. By comparing and analyzing these cases, we hope to gain a better understanding on how CRL complexes work under various settings in an attempt to decipher the clues about the regulatory mechanism of CRL E3s.     

Candida rugosa脂肪酶同工酶的分离及选择固定化

采用"界面亲和层析",从商品Candida rugosa脂肪酶(CRL)中分离到三个同工酶(CRL-1、CRL-2和CRL-3),它们在水-有机溶剂双液相体系中催化(R,S)-萘普生甲酯的不对称水解反应,具有不同的立体选择性.分析表明:CRL-1和CRL-2上不同程度地非共价结合有小分子的酸性化合物,阻碍了其活性位点处疏水腔的完全开放;CRL-3上不含有该小分子酸性化合物,活性位点处疏水腔可处于完全开放构象.据此分别将CRL同工酶选择性地固定在不同的载体(GDX101和YWG-NH2)上.通过简单易行的选择吸附步骤,可同时达到同工酶的分离及固定化目的,提出了一种对结构上相差不大同工酶分离的便利方法.     

交联酶晶体制备及其稳定性的研究*

酶制剂已经广泛应用在化学工艺、医学、农业、食品工业和化学分析等各个领域中,但酶的明显弱点是稳定性差,特别是应用于有机合成的酶还要耐受有机溶剂的变性作用等,所以酶的稳定化研究越来越引起重视。肪酶由于其在疏水环境的特殊催化作用,被广泛应用于有机合成中。本研究所采用Candida ru-gosa脂肪酶(CRL)是目前应用最为广泛的脂肪酶,它不仅能在水和有机介质催化酯、酸、醇的拆分,而且还能催化转酯、酰化、脱酰化等立体异构化反应和酯的水解。但是目前CRL的商业化产品是含有多种水解酶的混合物。其立体异构的专一性低,而纯化的CRL的立体异构的专一性提高,但是操作稳定性差。本文采用酶结晶技术与化学交联技术相结合的方法,制备出一种新型实用的交联酶晶体催化剂,并对它的温度、pH和在有机溶液中的稳定性进行了研究。     

大鼠皮层神经干细胞分化为胆碱能神经元过程中骨架蛋白的表达

目的对皮层神经干细胞向胆碱能神经元定向分化及骨架蛋白(β-tubulin)进行探讨研究.方法采用细胞培养技术、免疫细胞化学方法观察皮层神经干细胞向胆碱能神经元定向分化及其过程中骨架蛋白表达变化.结果皮层神经干细胞在去除丝裂原后开始进行分化,至第7d可分化为成熟神经元,NSE、Ach E反应明显阳性,随着分化神经元的逐渐成熟,β-tublin在细胞内的分布亦发生变化,由核周集中分布变化为广泛分布于细胞质内,形成细网状,构成细胞骨架.结论皮层神经干细胞定向分化为胆碱能神经元的过程中伴随有骨架蛋白的时空变化,随神经元的成熟而构成细胞骨架.     

剪切力对脑微血管内皮细胞骨架蛋白的影响

利用自行研制的细胞流动小室对大鼠脑微血管内皮细胞在剪切力作用下细胞骨架蛋白的结构改变进行了初步研究,结果提示脑微血管内皮细胞在剪切力作用下,细胞形态学发生明显改变,细胞间隙增大、皱缩、脱落,细胞骨架蛋白的结构也有类似的变化,骨架蛋白沿流动方向重新排列,微丝中Ｆ－Ａｃｔｉｎ的数量增加、变粗。这些改变的直接后果是内皮细胞通透性的增加。该工作为进一步开展剪切力对微血管内皮细胞功能、代谢等方面的影响提供了实验数据