BMP9对人肺腺癌AS49细胞侵袭、迁移的影响及机制的研究

BMP9属于TGF-β超家族的成员,参与多种细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭、转移过程。以人肺腺癌细胞A549作为目的细胞,采用腺病毒体外感染方式,外源性高表达BMP9。RT-PCR及Westernblot检测重组细胞中BMP9的表达,通过细胞划痕实验、Transwell侵袭实验检测AdBMP9细胞侵袭及迁移改变,RT-PCR及Westernblot检测感染BMP9腺病毒后IL-6的mRNA和蛋白表达：Westemblotg检测NPI3K／Akt信号通路中总Akt和磷酸化Akt蛋白的表达。结果显示：与对照组细胞相比,感染BMP9腺病毒后,A549中BMP9mRNA和蛋白表达明显升高;实验组划痕愈合率由对照的（85．4±2．11％与（86．5±3．4）％上升至（97．4±2．6）％（P〈0．05）;实验组穿膜细胞数由对照的（115．5±13．1）个与（123．3±14．9）个上升至（224．3±24．6）个（P〈0．05）;与对照组细胞相比,AdBMP9组IL-6的表达上调,磷酸化Akt蛋白表达上调。该研究表明,BMP9可能通过上调IL-6的表达,激活P13K／Akt信号通路,促进人肺腺癌A549的侵袭、迁移。     

骨形成蛋白9对人膀胱癌BIU-87细胞增殖和迁移的影响

目的:人骨形成蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)对人膀胱癌BIU-87细胞增殖和迁移的影响。方法:使用过表达BMP9基因的腺病毒(AdBMP9)感染BIU-87细胞,采用定量PCR检测BMP9 mRNA的表达,Western blot检测BMP9蛋白及BMP9下游相关信号通路蛋白的表达;MTT及集落形成实验检测BIU-87细胞增殖能力;划痕愈合实验及Transwell ^TM小室迁移实验检测BIU-87细胞迁移能力。结果:感染AdBMP9后,BIU-87细胞中BMP9的mRNA水平和蛋白质水平均显著增加;过表达BMP9后,BIU-87细胞的体外增殖和迁移能力明显增加;Western blot结果显示BMP9可明显激活AKT信号通路。结论:高表达BMP9可能通过激活AKT信号通路促进人膀胱癌BIU-87细胞的增殖和迁移。     

BMP9/PI3K/Akt信号通路抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞生长

探讨骨形态发生蛋白9是否可通过其它非经典BMPs/SMAD信号通路来抑制人乳腺癌癌细胞MDA-MB-231的生长。本研究采用免疫组化方法检测临床乳腺癌患者癌组织和癌旁组织中BMP9、Akt总蛋白和Akt磷酸化蛋白表达,采用Western blot检测过表达BMP9或靶向干扰BMP9后,对乳腺癌细胞中PI3K/Akt信号通路中Akt总蛋白和Akt磷酸化蛋白表达的影响,通过裸鼠异位移植瘤动物模型证实BMP9可抑制乳腺癌生长,及其对细胞增殖核抗原PCNA表达改变。结果显示,临床乳腺癌患者癌组织中BMP9表达明显低于癌旁组织,癌组织中存在BMP9表达,Akt磷酸化蛋白表达明显降低;BMP9腺病毒感染MDA-MB-231后,MDA-MB-231/BMP9组的Akt磷酸化蛋白表达明显低于MDA-MB-231/GFP,干扰掉MCF7中内源性BMP9后,MCF7/si BMP9组Akt磷酸化蛋白表达明显高于MVF7/si NC组;裸鼠移植瘤动物模型在成瘤后的第21天,MDA-MB-231/BMP9瘤体大小为(0.329±0.047)明显小于MDA-MB-231/GFP(3.102±0.027),PCNA染色显示MDA-MB-231/BMP9的PCNA阳性率为(26.3±3.1)%,明显低于MDA-MB-231/GFP(57.8±5.3)%。由此得出结论,BMP9抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞生长还可以通过抑制PI3K/Akt信号通路激活来发挥作用。     

BMP9结合ALK2受体激活BMPs/SMAD抑制乳腺癌MDA-MB-231增殖侵袭和迁移

为探讨骨形态发生蛋白9是通过结合受体ALK1还是ALK2来抑制人乳腺癌癌细胞MDA-MB-231的增殖、侵袭和迁移,本研究采用RT-PCR检测ALK1、ALK2在MDA-MB-231中内源性表达,同时用RT-PCR检测显性负性突变ALK2腺病毒和BMP9腺病毒共感染MDA-MB-231后,DNALK2表达。采用MTT、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验检测DNALK2对BMP9作用下MDA-MB-231增殖、侵袭、迁移的影响。RT-PCR检测DNALK2和BMP9腺病毒共感染MDA-MB-231后CTGF m RNA表达,Western blot检测BMPs/SMAD信号通路中SMAD1/5/8总的蛋白和磷酸化蛋白以及CTGF表达。结果显示,MDA-MB-231只存在ALK2表达,DNALK2和BMP9腺病毒共感染MDA-MB-231后,DNALK2 m RNA表达明显升高;MDA-MB-231/GFP/DNALK2组吸光度值(0.392±0.044)较MDA-MB-231/BMP9/DNALK2组(0.433±0.045)吸光度值无明显改变(p0.05);MDA-MB-231/GFP/DNALK2组划痕愈合率(67.3±8.6)%与MDA-MB-231/BMP9/DNALK2组划痕愈合率(59.9±6.4)%无明显改变(p0.05),MDA-MB-231/GFP/DNALK2组穿膜细胞数为(21.7±3.4)个与MDA-MB-231/BMP9/DNALK2组穿膜细胞数为(17.4±5.4)个无明显改变(p0.05)。Western blot显示:DNALK2能阻断BMP9上调磷酸化SMAD1/5/8和下调人结缔组织生长因子CTGF表达。由此得出结论,BMP9可通过结合ALK2受体激活BMPs/SMAD信号通路来抑制MDA-MB-231增殖、侵袭和迁移。     

IL-8对肺腺癌A549细胞迁移的影响及其机制探讨

探讨IL-8对肺腺癌A549细胞迁移的影响及其可能机制。用MTT法选择了合适的IL-8使用浓度。分别用划痕试验及Transwell试验证明了IL-8可以促进肺腺癌A549细胞的迁移。Westernblot结果表明:(1)IL-8可以促进MMP-2蛋白的表达,而对MMP-9的表达无明显影响;(2)IL-8可促进JNK/SAPK磷酸化蛋白的表达;(3)抑制剂(SP600125)可以阻断IL-8对MMP-2蛋白表达的影响。划痕试验从反面验证了低表达的MMP-2可以抑制A549细胞的迁移。表明IL-8可通过JNK/SAPK信号通路调控MMP-2蛋白的表达,进一步促进肺腺癌A549细胞的迁移。     

基于PTEN-PI3K-AKT信号通路探讨竹节参总皂苷抑制人肺腺癌A549细胞增殖和转移的机制

目的:竹节参是人参属植物,和人参成分相似,前期研究其对肺癌具有一定的抑制作用,但作用机制不清,因此,本项目拟研究竹节参皂苷对人肺癌细胞系A549增殖、迁移和侵袭能力以及PTEN-PI3K-AKT信号通路的影响。方法:CCK8法测定不同浓度和不同作用时间的竹节参皂苷对A549存活率的影响,划痕实验测定细胞迁移能力,Transwell小室测定细胞的侵袭能力,ELISA试剂盒测定培养基上清中MMP-2和MMP-9水平的变化。Western blot测定PTEN、P-PI3K和P-Akt表达的变化。结果:竹节参皂苷对A549细胞增殖具有明显的抑制作用,呈浓度和时间依赖关系,与对照组比较具有统计学差异。同时,竹节参皂苷可以浓度依赖性的抑制细胞侵袭和转移,以及MMP-2和MMP-9细胞因子的分泌。Western blot结果表明竹节参皂苷可促进PTEN蛋白表达,抑制P-PI3K和P-Akt蛋白表达,采用PTEN的特异性抑制剂SF1670证实竹节参皂苷通过抑制PTEN发挥作用。结论:竹节参皂苷可抑制肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭,以及分泌蛋白MMP-2和MMP-9表达,其作用机制可能是通过调控PTEN抑制PI3K和Akt磷酸化,从而发挥抗癌作用。     

BMP9对人乳腺癌细胞MDA-MB-231骨转移的影响及可能机制

探讨BMP9对人乳腺癌MDA-MB-231细胞骨转移能力的影响及其可能的机制。扩增高滴度的BMP9表达腺病毒,感染MDA-MB-231细胞,制备表达BMP9的重组MDA-MB-231/ BMP9细胞,以此作为实验组;同时以含GFP的空载腺病毒感染该细胞为MDA-MB-231/GFP,联合MDA-MB-231共同作为对照组;RT-PCR及Western blot检测重组MDA-MB-231/ BMP9细胞中BMP9以及磷酸化Smad1(PSmad1)的表达;定量PCR及Western blot检测三组细胞中CTGFmRNA和蛋白水平的表达情况,最后结合X片运用免疫组织化学染色的方法检测三组标本中CTGF的表达。结果发现重组MDA-MB-231/ BMP9细胞中存在BMP9的表达;与对照组细胞相比,MDA-MB-231/ BMP9细胞中存在PSmad1的活化增强及CTGF的表达下调;X片发现实验组裸鼠胫骨溶骨性缺损减少;瘤体组织免疫组化发现实验组CTGF表达下调。所以BMP9可以在体内抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的骨转移并且这种抑制作用有可能是通过下调CTGF来实现的。     

Noggin抑制乳腺癌溶骨性骨转移的作用研究

该文主要研究头蛋白(Noggin)抑制乳腺癌溶骨性骨转移的可能作用机制。通过体外慢病毒感染的方法,将Noggin慢病毒感染乳腺癌MDA-MB-231细胞, Western blot检测Noggin表达情况,利用CCK8和流式细胞术检测细胞增殖和周期改变, Western blot检测BMPs/SMAD信号通路变化和PI3K/Akt/mTOR关键分子Akt和m TOR总的蛋白和磷酸化蛋白的改变,裸鼠胫骨贴骨注射乳腺癌细胞复制骨转移动物模型,通过X片检测Noggin对乳腺癌溶骨性骨缺损的影响,免疫组化检测乳腺癌骨转移组织中Akt总的蛋白、磷酸化蛋白以及细胞核增殖抗原PCNA的改变。Noggin组的Noggin蛋白表达明显升高, Noggin慢病毒感染MDA-MB-231细胞第3天, CCK8检测其吸光度值为(0.452±0.059),显著低于RFP组(0.683±0.064),并且将细胞周期阻滞在G1期; Western blot显示Akt和mTOR总的蛋白未发生改变、磷酸化蛋白表达明显降低;乳腺癌溶骨性骨转移动物模型中Noggin组的溶骨性缺损明显低于RFP组,免疫组化结果显示PI3K/Akt/mTOR中关键分子Akt磷酸化蛋白、PCNA表达明显降低。Noggin可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路的激活来抑制乳腺癌的溶骨性骨转移。     

吞噬细胞运动蛋白1通过NF-κB/snail信号通路促进肺腺癌细胞A549的上皮-间质转化

吞噬细胞运动蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)在许多恶性肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用,但其在肺腺癌侵袭转移中的研究相对较少。本研究旨在探讨ELMO1在肺腺癌上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用,为临床预防肺腺癌的侵袭和转移提供理论和实验依据。Western印迹结果显示,ELMO1在人正常肺上皮细胞BEAS-2B中的蛋白质表达水平低,而在人肺腺癌细胞A549中表达水平高。si ELMO1/A549细胞组中ELMO1的表达水平明显降低。用白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)刺激肺腺癌细胞A549 24 h后,趋化运动实验结果显示,IL-8浓度为100 ng/m L时为最适刺激浓度,此时肺腺癌细胞A549具有最强的趋化运动能力,增高或降低IL-8的浓度时细胞的趋化运动能力均下降。Transwell侵袭实验结果显示,用IL-8刺激24 h后,si ELMO1/A549细胞相比于Scr/A549细胞组的侵袭转移能力明显减弱。Western印迹结果显示,与未用IL-8刺激或用IL-8和抑制剂BAY11-7082同时刺激的相比,si ELMO1/A549细胞较Scr/ELMO1A549细胞组E-cadherin蛋白的表达上调,Vimentin蛋白的表达下调,p-IκBα、细胞核中snail的蛋白质表达水平均降低。综上所述,ELMO1可以通过NF-κB信号通路影响snail的转核,从而促进肺腺癌细胞A549的上皮-间质转化。     

谷氨酰胺激活PI3K/Akt信号通路促进痘苗病毒复制

谷氨酰胺(glutamine,Gln)在细胞生长和代谢过程中起重要作用,能够激活磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳动物雷帕霉素蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)信号通路。多种病毒能通过PI3K/Akt信号通路维持细胞生存和抑制细胞凋亡,维持病毒的感染。为了探讨Gln在痘苗病毒(vaccinia virus strain western reserve,WR)感染人肺癌细胞A549过程中的调控作用及其潜在机制,该文通过蛋白免疫印迹(Western blot)检测PI3K/Akt信号通路蛋白质磷酸化水平,流式细胞术检测细胞阳性率,结晶紫染色检测WR滴度,实时定量PCR(quantitative Real-time PCR,q PCR)检测WR基因E3L和A46R m RNA水平。结果显示,Gln处理后PI3K/Akt信号通路蛋白质磷酸化水平显著升高。抑制PI3K/Akt信号通路后,细胞阳性率显著降低(P0.05),WR滴度显著降低(P0.05),WR基因E3L和A46R m RNA水平显著降低(P0.05)。该研究结果表明,Gln通过激活PI3K/Akt信号通路从而促进A549细胞中WR的复制。     

TRBP2基因过表达对肺腺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭的影响及可能机制

该文探讨了TAR RNA结合蛋白2(TAR RNA binding protein 2,TRBP2)基因对肺腺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭的影响及可能机制。构建TRBP2慢病毒过表达载体,以不同感染复数(MOI)感染A549细胞,根据绿色荧光强度选择最适MOI值。荧光定量PCR(FQ-PCR)检测TRBP2、MMP-2(matrix metalloproteinase-2)、PKR(double-stranded RNA-dependent protein kinase)m RNA的表达量。免疫蛋白印记(Western blot)法检测TRBP2、MMP-2、PKR、p-PKR的表达。采用MTT法、平板克隆实验检测TRBP2基因对A549细胞增殖的影响,Transwell迁移及侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力,黏附实验检测同种细胞和异种细胞间黏附情况。结果发现,成功构建了TRBP2基因过表达的A549细胞株,与空载体组和对照组比较,TRBP2基因过表达组细胞侵袭、迁移能力明显增强(P0.05),同种细胞间黏附力减弱(P0.05)而异种细胞间黏附力增强(P0.05),增殖速度加快(P0.05)及克隆形成率增加(P0.05)。此外,MMP-2、TRBP2蛋白及m RNA表达量明显升高(P0.05);p-PKR蛋白表达量降低(P0.05);PKR蛋白及m RNA表达量无差异。对照组与空载体组之间比较,以上各项指标均没有明显差异(P0.05)。该研究表明,过表达TRBP2基因可能通过促进MMP-2的表达同时抑制PKR磷酸化来促进肺腺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭。     

沙棘总黄酮抑制肺癌A549增殖和迁移作用及机理

为探究三种沙棘总黄酮(TFH)对非小细胞肺癌A549细胞增殖及迁移的影响,并探讨其分子作用机制,选择不同浓度的西藏沙棘(Hippophae tibetana Schlecht)、中国沙棘(H.rhamnoides L.subsp.sinensis Rousi)、肋果沙棘(H.neurocarpa)总黄酮作用于A549细胞。通过MTT检测细胞相对活力,平板克隆形成实验及软琼脂克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞仪AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡比例。选择效果最佳的西藏沙棘总黄酮应用细胞划痕实验及Transwell实验分析该化合物对肺癌细胞迁移侵袭能力的影响。Western blot检测MMP9、E-cadherin等侵袭迁移相关蛋白表达。敲低E-cadherin基因检测沙棘总黄酮对细胞迁移能力的影响。结果显示,三种沙棘总黄酮均对A549细胞系具有增殖抑制作用,抑制作用依次为:西藏沙棘中国沙棘肋果沙棘。西藏沙棘总黄酮可显著性抑制非小细胞肺癌A549细胞侵袭迁移能力(P0.05)。实验组中MMP9、MMP2、TGF-β、N-cadherin表达水平显著降低,E-cadherin表达水平上调。我们发现在A549细胞中敲低E-cadherin,西藏沙棘总黄酮可逆转迁移增加。以上研究表明西藏沙棘总黄酮对肺癌A549增殖抑制作用具有明显的优势,且西藏沙棘总黄酮可明显抑制肺癌A549细胞的侵袭迁移能力,并可能与下调细胞中的TGF-β抑制MMP9表达并阻止肺癌EMT有关。     

高糖和LY294002干预影响足细胞内Ⅳ型胶原表达

探讨高糖和PI3K/Akt通路对足细胞内Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)表达的影响。体外培养小鼠足细胞,给予高糖(30mmol/L)处理后,分别于0,12,24,48h收集细胞,采用免疫细胞化学染色法和Western blot技术检测Col Ⅳ的表达;Western blot技术检测Akt的活化及LY294002对Col Ⅳ表达的抑制效应。结果表明,高糖诱导足细胞内Col Ⅳ蛋白表达增多,24h明显,各时间点与高糖刺激前相比均有统计学差异(P<0.05);高糖激活Akt蛋白磷酸化,p-Akt随刺激时间延长表达增多。PI3K/Akt通路抑制剂LY294002孵育细胞24h后,可减弱高糖诱导的足细胞内Col Ⅳ的表达(P<0.05)。因此,高糖可能通过激活PI3K/Akt通路上调足细胞内Ⅳ型胶原表达。     

在体内外模拟的乳腺脂肪微环境中研究BMP9对乳腺癌细胞生长的影响

骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins,BMP9)是骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)家族的一员,具有多种生物学功能。本实验主要是从体内、外两个层面模拟的脂肪微环境中,研究BMP9对乳腺癌细胞生长的影响。将前脂肪细胞3T3-L1诱导为成熟脂肪细胞后,利用Transwell小室共培养技术,将其分别与MDA-MB-231细胞、感染腺病毒AdGFP的对照MDA-MB-231/AdGFP细胞、感染腺病毒AdBMP9的MDA-MB-231/AdBMP9细胞进行共培养。针对共培养体系中的肿瘤细胞,采用EdU实验检测增殖能力的变化;流式细胞术检测细胞周期变化;Western blot检测cyclin D1、c-myc蛋白水平的变化。将乳腺癌细胞与脂肪细胞以1:5的比例混合后,注射到裸鼠皮下,监测瘤体的生长并绘制生长曲线;取离体肿瘤组织进行免疫组化染色,检测瘤体中ki67、cyclin D1和c-myc的表达情况。结果显示,显微镜下可以观察到诱导后的3T3-L1细胞出现明显脂滴,能被油红O染色,证明成熟脂肪细胞诱导成功;AT-PCR及Western blot证实BMP9过表达成功;BMP9可以抑制共培养体系中肿瘤细胞的增殖(p0.05),使其周期阻滞在G_2/M期(p0.05),并降低cyclin D1和c-myc的蛋白水平(p0.05)。动物移植瘤实验发现,BMP9高表达实验组的瘤体明显小于空白组和载体感染对照组;瘤体免疫组化结果显示,实验组ki67、cyclin D1和c-myc的表达均明显下调。本研究证明在体内、外模拟的脂肪微环境中,BMP9可以抑制乳腺癌细胞的增殖,且这种作用可能是通过下调cyclin D1和c-myc来实现的。     

缺氧条件下人脐带源性间充质干细胞增强缺氧诱导因子-1α表达促进肺腺癌细胞增殖

目的探讨缺氧条件下缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)在人脐带源性间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, hucMSCs)促进肺腺癌A549细胞增殖过程中的可能机制。方法分离培养和鉴定hucMSCs,分别与肺腺癌A549细胞、干扰了HIF-1α基因的A549细胞在常氧或缺氧条件下进行共培养,荧光定量PCR和Western blot法分别检测HIF-1α和生存素(survivin)表达水平,MTT法检测细胞增殖力,划痕实验分析细胞迁移力。结果 MTT和划痕实验检测显示,常氧条件下,hucMSCs共培养的A549 细胞增殖能力、迁移能力较无hucMSCs共培养的细胞明显减弱;缺氧条件下,A549 细胞增殖力和迁移力较常氧培养的A549 细胞明显增强,hucMSCs共培养使二者进一步增强,沉默HIF-1α则使二者减弱,hucMSCs共培养不改变沉默HIF-1α对细胞增殖力和迁移力的影响。荧光定量PCR和Western blot检测显示,缺氧培养时,A549 细胞内HIF-1α和survivin表达明显上调,hucMSCs共培养明显增强缺氧对HIF-1α和survivin表达的上调作用;沉默HIF-1α抑制缺氧对A549细胞HIF-1α和survivin表达的上调,hucMSCs共培养不改变沉默HIF-1α对HIF-1α和survivin表达上调的抑制。结论缺氧条件下,hucMSCs共培养导致肺腺癌A549细胞HIF-1α和survivin表达上调,从而使A549细胞的增殖和迁移能力增强。     

Myostatin通过PI3K-Akt-c-Jun信号通路调节VEGFA在MG-63细胞中的表达

类风湿关节炎患者高表达肌抑素(myostatin)和血管内皮生长因子A(VEGFA),但两者之间的关系尚不明确。该研究采用Western blot技术和RT-qPCR技术分析了myostatin刺激MG-63细胞后VEGFA蛋白和mRNA表达量的变化,采用PI3K、Akt、c-Jun的抑制剂或siRNA处理细胞后分别检测相应蛋白的磷酸化程度以及VEGFA的表达水平。结果表明,myostatin促进VEGFA蛋白和mRNA的表达,且浓度为3 ng/mL时表达量最高;myostatin处理后,PI3K、Akt、c-Jun蛋白的磷酸化程度增加,相应的抑制剂处理细胞后myostatin促进VEGFA蛋白上调的作用减弱。该研究表明,在MG-63细胞中,myostatin通过激活PI3K-Akt-c-Jun信号通路促进VEGFA的表达。     

SATB2促进BMP9诱导C2C12细胞的成骨分化

目的:研究特异AT序列结合蛋白2(Special AT-rich sequence-binding protein 2,SATB2)在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)C2C12成骨分化中的作用。方法:首先用Ad-BMP9感染C2C12细胞,RT-PCR检测SATB2在基因水平上的表达变化,Western blot检测SATB2在蛋白水平上的变化;构建过表达SATB2重组腺病毒Ad-SATB2,感染C2C12细胞后,Western blot验证Ad-SATB2表达情况;用AdSATB2处理BMP9诱导的C2C12细胞,碱性磷酸酶(ALP)活性和染色检测成骨早期ALP的变化,茜素红S染色检测成骨晚期指标钙盐沉积的变化。结果:Ad-BMP9处理C2C12细胞后,比对照组SATB2在基因水平和蛋白水平上表达量上调;Ad-SATB2可以在细胞中成功表达SATB2蛋白;用Ad-SATB2处理BMP9诱导的C2C12细胞后,ALP以及钙盐的沉积与对照比较均上调。结论:SATB2可以促进BMP9诱导的间充质干细胞C2C12的成骨分化。     

Runx1促进BMP9诱导的间充质干细胞MEFs的成骨分化

目的:研究Runx1在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)成骨分化中的作用。方法:用BMP9腺病毒感染MEFs细胞,利用RT-PCR和Western blot分别在mRNA和蛋白质水平检测Runx1的内源性表达;构建过表达Runx1的重组腺病毒Ad-Runx1,并在mRNA和蛋白质水平验证Ad-Runx1的效果;用Ad-Runx1和BMP9条件培养基共处理MEFs,检测成骨早期指标碱性磷酸酶(ALP)染色和活性,茜素红S染色检测成骨晚期指标钙盐沉积;RT-PCR和Western blot分别检测成骨关键转录因子Runx2在mRNA和蛋白质水平的变化。结果:Ad-BMP9处理MEFs细胞后,可使Runx1在mRNA和蛋白质水平表达上调;构建的Ad-Runx1处理MEFs后,可使Runx1在mRNA和蛋白质水平表达上调;Ad-Runx1处理BMP9诱导的MEFs细胞后,增强了ALP活性和钙盐沉积以及Runx2在mRNA和蛋白质水平的表达。结论:Runx1可以促进BMP9诱导的间充质干细胞MEFs的成骨分化。     

基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建敲除TSPAN4基因的非小细胞肺癌细胞系

利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除TSPAN4基因,构建TSPAN4基因稳定敲除的非小细胞肺癌A549细胞株,并检测其对A549细胞迁移、侵袭能力的影响,为后期探讨迁移体在非小细胞肺癌转移过程中的作用提供实验基础。以质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro(px459)为载体,与设计好的引物连接后得到敲除载体px459-sgRNA-TSPAN4。以jetPRIME?为转染试剂,将构建好的质粒转染至A549细胞系,嘌呤霉素筛选单克隆细胞株并使用Western blot实验鉴定A549细胞系中TSPAN4基因的敲除效果,细胞划痕实验和Transwell实验检测敲除TSPAN4基因对A549细胞迁移、侵袭能力的影响。该研究成功构建了TSPAN4基因编辑质粒px459-sgRNA-TSPAN4。Western blot结果显示敲除TSPAN4基因能够显著降低A549细胞株中TSPAN4蛋白表达量;敲除TSPAN4基因对A549细胞迁移、侵袭能力的影响在统计学上无显著性差异,降低了N-cadherin的表达,对E-cadherin表达的影响不大。以上研究表明,使用CRISPR/Cas9...     

UCHL1基因缺失突变A549肿瘤细胞单克隆株的建立与特性分析

本研究旨在探索泛素羧基末端水解酶L1(ubiquitin C-terminal hydrolase-L1,UCHL1)对非小细胞肺癌细胞系A549细胞的作用。用CRISPR-CAS9基因编辑技术构建UCHL1基因敲除的A549细胞株,用RT-PCR和Western blot检测A549细胞中UCHL1基因敲除情况,用CCK-8检测细胞增殖能力的变化,用流式细胞仪检测细胞周期的变化,用CCK-8检测A549细胞对顺铂药物敏感性的改变,用划痕与Transwell实验检测A549细胞迁移能力的变化,用Western blot检测与A549细胞迁移有关的蛋白表达变化。结果显示,使用CRISPR-CAS9技术构建的基因移码突变导致A549细胞株UCHL1 mRNA和蛋白缺失,UCHL1基因功能缺失后A549细胞增殖和各细胞周期比例没有明显变化,但对顺铂的药物敏感性降低,迁移能力下降,Erk1/2蛋白磷酸化水平升高。以上结果提示,UCHL1基因功能缺失可导致A549细胞顺铂耐药性提高,细胞迁移能力降低,其机制可能涉及Erk1/2信号通路的激活。