《干细胞》:应用干细胞疗法治疗眼疾

<正>为帮助因病或外伤导致单眼视力丧失的病患,英国科学家用干细胞疗法展开试验,取得较好效果。这一试验结果发表于最新一期《干细胞》(Stem Cell)杂志。     

Microdystrophin基因重组腺病毒的构建及转染mdx骨髓间充质干细胞的表达

构建含有人microdystrophin基因的重组腺病毒,来感染dystrophin基因敲除小鼠mdx的骨髓间充质干细胞(MSC)进行基因修饰,为同种异体基因修饰的干细胞移植治疗DMD疾病奠定基础。用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因。片段回收后定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttle-CMV-MICRO。PmeⅠ线性化重组质粒pShuttle-CMV-MICRO,去磷酸化后回收后与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。然后将病毒上清转染DMD模型鼠mdx小鼠的骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达。成功构建了含有microdystrophin基因的重组腺病毒,病毒滴度为5·58×1012vp/mL。间接免疫荧光检测可见microdystrophin蛋白在mdx小鼠MSCs中高效表达。该重组腺病毒载体的构建及成功转染到mdxMSCs内表达为下一步用microdystrophin基因修饰的mdxMSCs进行同种异体移植治疗DMD疾病奠定了基础。     

干细胞对皮肤瘢痕的治疗作用

皮肤瘢痕的治疗是临床难题,近年开展的干细胞移植为皮肤瘢痕的治疗开辟了一种新的治疗方法。为评估干细胞对皮肤瘢痕的治疗作用,探索皮肤疤痕的有效治疗方法,本文对干细胞对皮肤瘢痕的治疗作用进行了综述。已报道的临床多种干细胞治疗皮肤疤痕,均取得了较为肯定的治疗效果,但从整体水平观察,还处于初步探索阶段,积极开展不同种类干细胞对不同种类皮肤瘢痕类型的治疗效果,给药途径、干细胞浓度、剂量和安全性等多中心系统的规范研究,及治疗机制的深入探讨,将有力促进干细胞治疗皮肤瘢痕的广泛临床应用。     

腺病毒载体介导PDX-1在骨髓间充质干细胞中的表达

为研究PDX-1基因在骨髓间充质干细胞中的表达情况及生物学功能的发挥,构建了含PDX-1基因的重组腺病毒载体.酶切PDX-1基因并连入穿梭质粒pAdTrack-CMV.用电穿孔法使穿梭质粒pAdTrack-CMV-PDX-1与病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组.利用脂质体介导重组腺病毒载体转染293细胞,包装出完整的腺病毒.分离、培养、扩增骨髓间充质干细胞.用重组腺病毒感染间充质干细胞.用荧光显微镜、RT-PCR、免疫荧光染色等方法检测PDX-1、胰岛素基因及蛋白质的表达,用放射免疫分析法检测转基因细胞分泌胰岛素情况.结果表明:通过测序、PCR、酶切等鉴定PDX-1基因已正确插入穿梭质粒中,并与病毒骨架质粒重组.重组腺病毒滴度为6.3×107PFU/ml.通过荧光显微镜观察证实重组腺病毒可高效感染骨髓间充质干细胞,经RT-PCR、免疫荧光染色证实转染pAd-PDX-1后培养7天的细胞中有PDX-1及胰岛素基因的表达.这些转基因的细胞向胞外分泌的胰岛素量为(15.21±3.50)mIU/L.     

成体骨髓源多能间充质干细胞体内分化皮肤干细胞和皮肤组织

近年来,因在退行性或遗传性等疾病中潜在的治疗前景,成体干细胞可塑性引起众多学者的广泛兴趣。有许多报道显示骨髓源干细胞植入体内可生成多种组织细胞,但到目前为止,成体干细胞可塑性尚存争议,尤其是关于成体干细胞体内分化成皮肤组织的报道较少且意见不一。本工作,自成年BALB／C小鼠的骨髓中分离获得并体外培养扩增多能间充质干细胞,将适量的供体BALB／C小鼠骨髓源多能间充质干细胞和一定量的C57BL／6小鼠骨髓细胞经尾静脉共同植入经致死量照射的成年C57BL／6小鼠。40天后,观察到受体C57BL／6小鼠背部出现白色毛发,逐渐扩展至3—4cm^2,同时还出现在颈部和腹部,取该部位的皮肤组织进行免疫组化检测及RT—PC汉检测。蛋白水平和基因水平的结果均显示受体C57BL／6小鼠出现白色毛发处的皮肤组织为BALB/C来源。首次直接证明了成体骨能源多能间充质干细胞体内在一定条件下可以分化成皮肤干细胞及皮肤组织。不仅为研究体内诱导皮肤分化的机制也为鉴定成体多能干细胞提供了一个模型,也为成体干细胞可塑性理论提供了新的依据。     

肾脏疾病的干细胞治疗

近年来,利用干细胞的细胞疗法在医学领域带给人们最大的期望。对于目前一些顽症包括一些肾脏疾病的治疗,胚胎干细胞的分离和成体干细胞呈现出的潜力带给人们极大的希望。本文简述干细胞研究概况及其在肾脏疾病治疗上的应用。     

肿瘤干细胞的光动力治疗研究进展

肿瘤干细胞(cancerstem cells,CSCs)是在肿瘤组织中具有干细胞特性的细胞亚群,它具有正常干细胞的多向分化潜能,能够无限增值和自主分化为各种具有异质性的肿瘤细胞。CSCs在肿瘤的发生、生长、转移中起着重要作用。同时,CSCs对目前大多数治疗如化疗、放疗不敏感,甚至具有耐药性,这也就导致了恶性肿瘤在治疗后容易复发。鉴于此,针对肿瘤干细胞的治疗日益受到关注,光动力疗法(photodynamictherapy,PDT)由于其微创性,不良反应少,靶向性强等特点在肿瘤的治疗研究中不断得到发展。本文将从CSCs的特性入手,结合PDT治疗的最新进展,探讨PDT治疗在肿瘤干细胞治疗中的应用。     

干细胞与心肌细胞替代治疗

胚胎干细胞及来源于骨髓、骨骼肌、血管、肝脏、皮肤、脂肪等组织器官的成体干细胞均有多向分化潜能。胚胎干细胞可分化为3个胚层的所有组织细胞。成体干细胞具有可塑性和转分化的潜能。在一定条件下,这些干细胞可被诱导分化为心肌细胞。成年心脏可能存在心肌干细胞,具有增殖和分化为包括跳动性心肌细胞的多种细胞的潜能。因此,干细胞可用于心肌细胞替代治疗,以替代死亡的心肌细胞,改善心脏功能,防治心肌梗塞后心衰、减少心肌重构等症状。本文对干细胞治疗心肌梗塞有关进展及问题作一综述。     

科学家首次利用人体皮肤细胞培育出类胚胎干细胞

美国和日本的科学家通过改造人体皮肤细胞，培育出一种外观和作用与胚胎干细胞（ES）非常接近的干细胞。这项技术使得在不使用胚胎或卵母细胞的前提下生产用于疾病研究或治疗的干细胞成为可能，从而避开一直困扰学术界的伦理争论．大大推动了与干细胞有关的疾病疗法研究。     

人干细胞生长因子-α基因的克隆、表达及其协同rhGM-CSF对人脐带间充质干细胞的增殖作用

为了研究hSCGF-α对人脐带间充质干细胞 (Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs) 的作用,采用基因工程技术获得重组人干细胞生长因子-α (Recombinant human Stem Cell Growth Factor-α,rhSCGF-α)。针对SCGF基因的高GC含量,采用PCR两步法获得hSCGF-α基因,插入pET-28a(+) 载体质粒,构建重组质粒pET-28a-SCGF-α,转化大肠杆菌BL21(DE3) 获得表达菌株。低温20 ℃诱导24 h,目标重组蛋白人干细胞生长因子-α以可溶性表达为主。通过Ni2+-NTA柱纯化,获得目标重组蛋白,电泳谱带扫描分析蛋白纯度可达90％以上。以巨噬细胞/粒细胞(Granulocyte/macrophage,GM)集落形成实验鉴定重组蛋白的生物学活性,并协同重组人巨噬细胞/粒细胞集落刺激因子(Recombinant human GM-colony stimulating factor,rhGM-CSF) 研究其对人脐带间充质干细胞的影响。结果显示,纯化的重组蛋白rhSCGF-α具有生物学活性;hSCGF-α及rhGM-CSF对hUCMSCs均有刺激增殖活性,但协同作用效果最强。     

间充质干细胞治疗糖尿病皮肤损伤的研究进展

糖尿病患者的皮肤组织易受内源性及外源性的各种损伤,且创面具有愈合慢、易感染等特点,这种特点在下肢皮肤创伤中表现尤为突出,常伴有高截肢风险,故糖尿病皮肤损伤可严重影响患者的生活质量。间充质干细胞（MSCs）是一类多能干细胞,其具有易分离、易培养、多向分化和免疫源性低等特征,目前已被广泛应用于创伤修复、组织再生等研究。对于糖尿病皮肤损伤,MSCs的临床移植治疗已成为继药物、手术之后的又一种治疗新技术。本文结合MSCs的生物学特性,对其应用在糖尿病皮肤损伤方面的研究进展做一综述。     

1型糖尿病治疗方法的回顾与展望

1型糖尿病是由包括病毒感染、药物接触及自身免疫在内的各种原因导致的胰岛β细胞凋亡所引起的,主要表现为由血清中胰岛素的绝对缺乏引起的高血糖。在过去数十年中,外源补充胰岛素一直是1型糖尿病的最主要治疗方法。随着人们对1型糖尿病机制的深入了解及生命科学相关技术的发展,科研工作者及临床医生开始探索治疗1型糖尿病的新方法,其中包括将分泌胰岛素的外源胰岛或干细胞移植入体内。或将胰岛素基因直接导入体内,合成并分泌体内缺乏的胰岛素等。本文对胰岛移植、干细胞和基因疗法用于治疗1型糖尿病的主要方式做一简要回顾与综述,并重点讨论近年来的研究进展及其临床应用的可行性。     

干细胞与癌症

有“万能细胞”之称的干细胞可用于治疗多种疾病,如心肌梗死、中风、肝硬化、糖尿病、皮肤病、帕金森氏症以及癌症等几乎所有的常见病,其中干细胞治疗癌症(恶性肿瘤)更引人关注,预示着干细胞疗法将会决定今后医学发展的未来。目前,对干细胞的研究与应用取得了重要进展。     

法首次用人类干细胞制造出表皮

法国科学家首次成功地利用人类干细胞制造出了一块完整的表皮,该成果可缩短重度烧伤患者等待皮肤移植手术的时间,减小感染的几率,从而挽救病人生命。科学家希望这种干细胞疗法未来可成为重度烧伤患者和遗传性皮肤病患者的替代疗法。相关研究成果发表于2009年11月份的英国《柳叶刀》杂志上。     

诱导干细胞向胰岛β样细胞分化的研究进展

β细胞替代治疗可能是目前唯一可以治愈1型糖尿病的方法,但可供移植的胰岛来源严重匮缺,阻碍了此疗法的临床应用。为此,调控干细胞分化为成熟的有功能的胰岛细胞成为近年来的研究热点。本文着重探讨了胰岛细胞发生发育的基因调控及几种生物活性分子体外诱导干细胞向胰岛β细胞分化的作用及其机理。     

Stella基因真核表达载体的构建及其对小鼠胚胎干细胞多能性的影响

构建Stella基因真核表达质粒,转染小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESC)并初步探讨Stella对减数分裂起始相关基因(Stra8)及胚胎干细胞多能性的影响。通过RT-PCR扩增目的基因,并连接至真核表达载体pEGFP-C1,利用重组质粒转染小鼠胚胎干细胞。对转染细胞进行荧光检测,确认Stella的表达,并利用免疫荧光及PCR检测转染细胞基因表达情况。酶切鉴定及测序分析表明成功构建含Stella基因的重组真核表达质粒,过表达Stella对ES细胞的增殖和形态学特征、进入减数分裂阶段的相关基因及其多能性基因的表达影响并不显著。故此得出结论:Stella在小鼠胚胎干细胞中能够正确表达,但对ES细胞的分化、Stra8基因的表达及其多能性基因的表达并无显著影响。     

应用骨髓干细胞治疗肝硬化研究进展

随着干细胞研究的深入和技术的发展,再生医学的干细胞疗法治疗肝脏疾病已成为研究热点。骨髓来源造血干细胞和间充质干细胞等在肝脏疾病治疗方面有巨大潜力。骨髓干细胞参与肝纤维化与肝硬化修复主要包括迁移、归巢与转化等过程,并需要多种细胞因子和趋化因子的协同作用促进肝细胞再生与减轻肝纤维化。本文拟对骨髓干细胞治疗肝硬化的最新研究进展进行综述。     

Microdystrophin基因重组腺病毒的构建及转染mdx骨髓间充质干细胞的表达

构建含有人microdystrophin基因的重组腺病毒,来感染dystrophin基因敲除小鼠mdx的骨髓间充质干细胞(ＭＳＣ)进行基因修饰,为同种异体基因修饰的干细胞移植治疗ＤＭＤ疾病奠定基础。用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因。片段回收后定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttle-CMV-MICRO。PmeⅠ线性化重组质粒pShuttle-CMV-MICRO,去磷酸化后回收后与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。然后将病毒上清转染DMD模型鼠mdx小鼠的骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达。成功构建了含有microdystrophin基因的重组腺病毒,病毒滴度为5.58×10¹²vp/mL。间接免疫荧光检测可见microdystrophin蛋白在mdx小鼠MSCs中高效表达。该重组腺病毒载体的构建及成功转染到mdx MSCs内表达为下一步用microdystrophin基因修饰的mdx MSCs进行同种异体移植治疗ＤＭＤ疾病奠定了基础。     

Microdystrophin基因重组腺病毒的构建及转染mdx骨髓间充质干细胞的表达

构建含有人microdystrophin基因的重组腺病毒,来感染dystrophin基因敲除小鼠mdx的骨髓间充质干细胞(ＭＳＣ)进行基因修饰,为同种异体基因修饰的干细胞移植治疗ＤＭＤ疾病奠定基础。用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因。片段回收后定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttle-CMV-MICRO。PmeⅠ线性化重组质粒pShuttle-CMV-MICRO,去磷酸化后回收后与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。然后将病毒上清转染DMD模型鼠mdx小鼠的骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达。成功构建了含有microdystrophin基因的重组腺病毒,病毒滴度为5.58×10¹²vp/mL。间接免疫荧光检测可见microdystrophin蛋白在mdx小鼠MSCs中高效表达。该重组腺病毒载体的构建及成功转染到mdx MSCs内表达为下一步用microdystrophin基因修饰的mdx MSCs进行同种异体移植治疗ＤＭＤ疾病奠定了基础。     

通过胚胎干细胞途径获得的嵌合体小鼠中neo基因在各组织中的分布

为探讨小鼠胚胎干细胞参与早期胚胎发育的潜能,以neo基因作为目的基因进行了胚胎干细胞的转染,经G418的筛选,获得表达neo基因的单克隆细胞,挑取部分克隆扩大,进行小鼠囊胚腔注射,再重新植入小鼠子宫,共注射了60个囊胚,分别回输到5只假孕小鼠,在子代中得到了携带有neo基因的嵌合体小鼠。通过对嵌合体小鼠各组织PCR分析发现,neo基因可以在皮肤、肝脏、血液等多种组织中存在。