一种可分泌多种活化型因子的工程细胞的建立

该研究目的是构建可分泌多种活化型因子的工程细胞,用于诱导干细胞分化为耳蜗神经元样细胞的共培养。首先将大鼠脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)和神经营养因子3(neurotrophin 3, NT3)的成熟肽编码序列用内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site, IRES)连接起来,再插入慢病毒表达载体pLVX-IRES-tdTomato,并包装成慢病毒,再将慢病毒分别感染HEK293T细胞和已有的表达活化型表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1, IGF1)和成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2, FGF2)的HEK293T/3GF细胞,采用有限稀释法获得稳定转染的细胞克隆,利用Western blot检测细胞培养液上清中的BDNF和NT3的表达情况,并通过检测人肺癌A549细胞和大鼠嗜铬细胞瘤PC-12细胞的增殖以及PC-12细胞的分化情...     

携带绿色荧光报告基因的EBV-LMP1真核表达载体构建与鼻咽癌细胞中的表达

潜伏膜蛋白1(LMP1)是由EB病毒编码的致瘤蛋白,众多研究表明LMP1蛋白可通过NF-κB、p38 MAPK、c-JNK等多条重要信号通路引起鼻咽癌细胞的生物学行为改变。我们从EB病毒阳性的B95-8狨猴淋巴瘤细胞中克隆EB病毒LMP1 c DNA,构建携带绿色荧光基因的真核表达质粒p IRES2-Zs-Green1-LMP1,通过脂质体转染的方法将质粒导入鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2中,利用质粒所携带的绿色荧光蛋白表达粗略计算转染的效率,通过免疫细胞化学(ICC)、RT-PCR、Western-Blot检测该质粒的表达。本实验室所构建的p IRES2-Zs-Green1-LMP1表达质粒能在鼻咽癌细胞内表达LMP1蛋白,为后续的实验研究奠定基础。     

稳定表达可视化hFcRn的MDCK细胞株构建

[目的]建立稳定表达融合EGFP的人新生儿Fc受体(h FcRn)的MDCK细胞株。[方法]构建重组慢病毒质粒p EGFP-h FcRn,采用四质粒包装系统共转染HEK 293T细胞生产重组慢病毒,感染MDCK细胞后对EGFP阳性细胞进行流式单细胞分选;通过Western Blot及EGFP-β2m荧光共定位验证h FcRn的完整性,并用流式细胞仪检测h FcRn与人Ig G的结合活性。[结果]测序结果表明成功构建p EGFP-FcRn慢病毒表达载体;感染后EGFP阳性MDCK细胞比例约为26.5%,流式单细胞分选后得到纯阳性细胞;荧光共定位及Western Blot均检测到h FcRn的完整表达;流式分析表明细胞株上的h FcRn与Ig G存在p H依赖性结合。[结论]成功获得稳定表达具有生物活性的可视化h FcRn的MDCK细胞株。     

血管内皮细胞通过诱导ERG表达促进前列腺癌耐药

目的:探讨血管内皮细胞对前列腺癌细胞耐药能力的影响,并进一步研究血管内皮细胞作用于前列腺癌细胞的可能的分子机制。方法:1.利用Transwell小室构建共培养体系,通过CCK-8和Annexin V-FITC/PI检测细胞耐药的能力并通过蛋白印迹法(WB)检测凋亡相关分子的表达;2.利用聚合酶链式反应(PCR)及WB检测共培养后前列腺癌细胞中成红细胞病毒E26致癌物(ERG)的表达情况;利用酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选出共培养组与非共培养组细胞上清之间有差异的细胞因子,并通过WB检测各个细胞因子与ERG的关系,确定影响ERG表达最明显的细胞因子。结果:1.前列腺癌细胞与血管内皮细胞共培养后,前列腺癌细胞对多西他赛的耐药性增加,细胞凋亡减少;2.共培养后前列腺癌细胞ERG的表达增高;血管内皮细胞分泌的成纤维细胞生长因子2(FGF2)在共培养后有明显增加,FGF2可以促进前列腺癌ERG的表达,并且这种病效应会被FGF2的抑制剂所逆转。结论:血管内皮细胞分泌的FGF2可促进前列腺癌细胞ERG的表达,促进前列腺癌细胞对多西他赛的耐药性。     

成纤维细胞生长因子9抑制PDGF-BB诱导的肺血管平滑肌细胞表型转化

该研究探讨了成纤维细胞生长因子9(fibroblast growth factor 9,FGF9)在肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)及肺血管平滑肌细胞表型转化中的作用。建立野百合碱(monocrotaline,MCT)诱导的大鼠肺动脉高压模型,Western blot检测大鼠肺组织中FGF9的表达情况。血小板衍生生长因子-BB(platelet-derived growth factor BB,PDGF-BB)诱导肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)表型转化,Western blot检测PASMCs中FGF9的表达情况。重组人成纤维细胞生长因子9(recombinant human fibroblast growth factor 9,rhFGF9)干预PASMCs,通过划痕实验检测细胞迁移能力,Western blot检测细胞表型相关蛋白[α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)]、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)及血小板衍生生长因子受体β(platelet-derived growth factor receptor β,PDGFR-β)的表达水平。siRNA抑制FGF9后,Western blot检测PASMCs表型与PCNA蛋白水平。结果显示,大鼠肺组织及PASMCs中FGF9的表达显著降低(P0.05);PDGF-BB下调PDGFR-β与收缩表型标志物α-SMA的表达(P0.05),同时上调PCNA与合成表型标志物OPN的表达(P0.05),且细胞的迁移能力增加;rhFGF9抑制PDGF-BB诱导的细胞表型转化和细胞迁移,而不影响PCNA与PDGFR-β的表达;下调FGF9可降低α-SMA(P0.05)的表达,而PCNA与OPN的表达无显著改变,即下调FGF9后,平滑肌细胞的收缩表型发生改变。总之,rhFGF9抑制PDGF-BB诱导的平滑肌细胞表型转化和迁移,下调FGF9能改变平滑肌细胞的收缩表型,提示FGF9可能参与肺动脉高压的病理过程。     

cspA冷休克启动子-重组人bFGF表达载体的构建及在大肠杆菌中可溶性表达研究

碱性成纤维生长因子b FGF具有刺激血管生成,促进血管内皮细胞和成纤维细胞增殖等生物活性,在组织修复中也起到重要作用。本研究运用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增出b FGF的编码序列,克隆至表达载体p ColdⅡ,构建csp A冷休克启动子调控的重组表达载体p Coldb FGF,转化E.coli BL21(DE3),在20℃低温诱导下b FGF几乎完全是可溶性表达,表达量占细胞总蛋白50%以上。纯化的b FGF能够促进NIH 3T3增殖,半数有效剂量ED50为1.33μg/L,具有较高的生物活性。     

重组hKGF2原核表达载体的构建及其蛋白质的纯化

角质细胞生长因子2（ keratinocyte growth factor 2, KGF2）是新近发现且发展迅速的成纤维细胞生长因子家族中新的一员,又称FGF10,是上皮细胞特异性的促有丝分裂剂,应用前景广泛。为构建其高效原核表达菌株,首先用RT-PCR法从培养的人胚胎肺成纤维细胞中获得去除信号肽的hKGF2 cDNA,将其插入pMD18-T载体;经测序后,克隆入pET-30a( + )表达载体,将成功构建的pET-30a( + )- hKGF2重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后, SDS-PAGE及Western blot鉴定重组蛋白为高效可溶性表达。重组蛋白经Ni+-NTA（镍亲和层析）一步法纯化后纯度达95%以上,为进一步的应用研究及大规模生产奠定了基础。     

FGF23/α-Klotho信号传导的分子机制

成纤维细胞生长因子23(fibroblast growth factor 23,FGF23)是内分泌型FGFs家族中的重要一员,是一种重要的骨源性调磷激素。FGF23主要通过结合成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor,FGFRs)/α-Klotho的复合物来调控肾脏中磷和维生素D的代谢。FGF23信号通路的异常与多种代谢性疾病尤其是慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)有非常密切的关系。FGF23水平的不断上升是导致CKD患者疾病进程加快、诱发并发症甚至最终死亡的主要因素。通过对最近发表的FGF23-FGFR1c-α-Klotho三元复合物蛋白结构的分析,更好地阐明FGF23蛋白信号传导的分子机制,为相关疾病的治疗或药物开发提供新的策略。     

嵌合表皮生长因子疫苗E5T-mSEA的设计及抑瘤活性检测

表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)及其配体在多种肿瘤细胞中高表达,免疫注射表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)-载体蛋白所产生的抗体能够干扰EGFR与EGF的相互作用,进而抑制肿瘤生长。本实验室设计了EGF和TGFα的嵌合配体E5T,并将具有免疫增强作用的葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal enterotoxin A,SEA)与之融合。融合蛋白在大肠杆菌内表达后,通过金属螯合亲和层析,得到了纯度较高的E5T-mSEA融合蛋白。将E5T-mSEA免疫小鼠,能够产生高滴度的抗体,该抗体能够同时识别EGF和TGFα。将抗E5T-mSEA免疫血清与肿瘤细胞共培养,在1:10的稀释度下能显著抑制EGFR阳性肿瘤细胞的生长,而对EGFR阴性肿瘤细胞293T的生长没有明显影响。     

人胰岛素样生长因子－ⅡcDNA的PCR扩增及序列分析

人胰岛素样生长因子(Hurman insulin-1ike growth factor,简称h IGF)是一类既有细胞分化和增殖活性,又有胰岛索样作用的多肽,包括IGF—Ⅰ和IGF—Ⅱ两种。其中IGF—Ⅰ的功能比较清楚。而IGF—Ⅱ的作用正在研究中,可能在胎儿的生长发育及脑组织和神经系统中起重要作用。IGF－Ⅱ能刺激一些细胞系的生长,对不同的肿瘤起自分泌和旁分泌生长因子的作用〔1－6〕,最近又发现IGF—Ⅱ能刺激神经及肌肉的再生。由于天然IGF—Ⅱ的分离困难,我们利用基因工程方法克隆表达IGF—Ⅱ c DNA,以获得大量重组蛋白,为研究和应用打下基础。     

成纤维细胞生长因子9在抑郁症及其运动干预调节中的作用

成纤维细胞生长因子9（fibroblast growth factor 9, FGF9）是成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）家族成员之一,属于一种自分泌或旁分泌生长因子。在脑组织中,FGF9主要表达于海马和皮质区,具有促进细胞增殖和维持细胞存活的功能。研究发现,FGF家族在抑郁症患者的多个脑区出现表达紊乱,FGF9在抑郁行为中扮演着负调控角色,但其介导抑郁行为的分子机制尚不清楚。本文综述了FGF9及其家族成员在抑郁中的作用; 围绕其受体（FGFR）信号在中枢神经系统中的功能特点,深入分析FGF9调节抑郁行为中的作用机制;结合运动抗抑郁的神经营养假说,提出经由FGFR/GSK3β/β-catenin通路的FGF信号,可能介导抑郁症的运动干预机制的假设。这些将为FGF9介导抑郁行为和运动抗抑郁的有关研究提供理论的基础和探索的思路。     

FGF13敲低的肺癌A549细胞株构建及转录组学分析

本研究的目的是探究成纤维细胞生长因子13(fibroblast growth factor13, FGF13)影响非小细胞肺癌发生发展的分子机制。通过构建干扰FGF13的真核表达载体并进行慢病毒包装,获得FGF13敲低的肺癌A549细胞株。利用转录组测序(RNA Sequencing, RNA-seq)技术检测基因表达谱并筛选差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),并对差异基因进行GO和KEGG富集分析,对部分DEGs的表达水平进行验证。采用STRING在线数据库筛选DEGs编码的蛋白相互作用网络(protein-protein interaction, PPI)中的关键基因,并通过UALCAN数据库对关键基因进行预后分析。与对照组细胞相比,FGF13敲低的肺癌A549细胞株共筛选出1 114个DEGs(P≤0.05,差异倍数≥2),其中表达上调和下调的DEGs分别有672和442个。实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)验证CXCL10和SELE等6个基因与测序结果一致。GO富集分...     

Twist1稳定表达细胞株的建立及对乳腺癌细胞上皮-间充质转变的影响

目的:构建Twist1的慢病毒真核表达载体,并建立稳定表达Twist1的乳腺癌细胞株,研究Twist1在乳腺癌中对上皮-间充质转变(EMT)的影响。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增Twist1编码序列,克隆到慢病毒p CDH载体,构建成p CDH-Twist1,转染293T细胞,Western印迹鉴定p CDH载体介导的Twist1的表达;包装病毒载体,感染ZR75-1细胞,用嘌呤霉素筛选得到稳定表达Twist1的细胞株,检测ZR75-1细胞对EMT的影响。结果:经Bam HⅠ、Eco RⅠ双酶切及测序证实得到p CDH-Twist1表达载体,Western印迹实验发现Twist1在293T细胞内表达;嘌呤霉素筛选得到稳定表达Twist1的ZR75-1细胞株。结论:构建了p CDH-Twist1的真核表达载体并建立了稳定表达Twist1的ZR75-1细胞,为进一步研究Twist1在EMT过程中的机制奠定了基础。     

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体稳定过表达基因工程修饰人脐带间充质干细胞亚细胞系的建立

目的通过基因工程修饰法建立肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)稳定过表达的人脐带间充质干细胞亚系(h UC-MSC_TRAIL)。方法人TRAIL全长蛋白编码序列(CDS)由PCR法扩增而得,PCR产物经NotⅠ和MluⅠ双酶切并纯化后,亚克隆至经同样双酶切的慢病毒表达载体p LEX-MCS。重组载体经PCR法和限制性内切酶酶切法鉴定,再行DNA直接测序验证后命名为人TRAIL表达慢病毒载体pLEX-h TRAIL。p LEXh TRAIL与相应包装质粒ps PAX2和p MD2.G经聚乙烯亚胺介导共转染HEK293T细胞以包装慢病毒。P4代h UC-MSC经慢病毒感染24 h,再行嘌呤霉素筛选2周后,抽提细胞基因组DNA,行PCR法鉴定h TRAIL c DNA在h UC-MSC基因组中的整合情况;同时抽提细胞总RNA,并行RT-PCR法检测外源h TRAIL在h UC-MSC中的m RNA表达水平,以及实时定量RT-PCR法检测周期调控相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E1、p21~(WAF1/CIP1和p27的表达,采用方差分析和t检验进行统计学分析。结果 PCR法和限制性内切酶酶切法鉴定结果表明,本研究已成功构建人TRAIL慢病毒表达载体p LEX-h TRAIL,直接DNA测序结果证实克隆得到的人TRAIL蛋白编码序列准确无误;病毒包装及细胞感染的鉴定结果说明,慢病毒感染法可成功介导外源人TRAIL在h UC-MSC的稳定整合和高表达;实时定量RT-PCR法检测结果则显示,与对照慢病毒感染后的细胞相比,h TRAIL表达慢病毒感染后其细胞周期调控相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E1、p21~(WAF1/CIP1)和p27的m RNA表达水平分别是对照组的1.19倍(P=0.141)、0.94倍(P=0.745)、0.95倍(P=0.047)和1.01倍(P=0.567),表明外源TRAIL高表达对体外培养的h UC-MSC生长增殖等表型无显著影响。结论本研究经基因工程修饰法成功构建了具外源TRAIL稳定高表达的h UC-MSC亚细胞系,该亚细胞系的建立为后续靶向攻击TRAIL敏感肿瘤细胞的细胞治疗的探索奠定了基础。     

信号肽对肝细胞生长因子HGF在CHO中表达及分泌的影响

该研究旨在筛选不同的分泌型信号肽以提高肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)中的表达。通过PCR方法将5种不同的分泌型信号肽代替HGF自身信号肽,分别构建了表达质粒并转化哺乳动物细胞CHO,挑选高表达克隆。采用qPCR方法检测表达过程中HGF转录水平差异,Western blot检测CHO培养基中HGF的累积差异,犬肾细胞(Madin-Daby canine kidney cells,MDCK cells)离散实验初步验证HGF的活性。研究结果表明,不同的分泌型信号肽对CHO表达HGF过程中的转录水平没有影响,但明显改变HGF在培养基中的累积,对分泌的HGF活性没有影响。综上所述,合适的分泌型信号肽促进CHO分泌外源蛋白质。     

FGF9与FGFR3受体在骨发育与疾病中的作用

成纤维细胞生长因子9(fibroblast growth factor,FGF9)最初发现于人类神经胶质瘤细胞,是成纤维细胞生长因子家族的成员之一.研究发现FGF9在多种组织的发育及疾病的发生中起重要作用.FGF9与肝素结合活化FGFR3受体,可作用于软骨细胞,在骨骼发育及损伤过程中抑制软骨细胞增生和软骨内骨化.FGF9基因缺失或突变可分别导致骨骼发育不良或肿瘤.本文简要综述FGF9与FGFR3受体在骨发育中的作用及其致病机制的研究进展.     

SH2A抑制IGFⅡ诱导的抗凋亡作用

为研究SH2A的生物学特性,构建野生型和缺陷型SH2A表达载体,通过流式细胞术和蛋白激酶C(PKC)活性检测,研究其对细胞凋亡的影响.研究结果显示SH2结构域是SH2A的主要功能域;SH2A可以诱导细胞快速进入凋亡晚期而促进细胞凋亡;同时发现SH2A抑制胰岛素样生长因子Ⅱ(Insulin-like growth factor Ⅱ,IGF Ⅱ)的抗凋亡作用,并阻滞IGFⅡ诱导的Ca2+释放和PKC激活.因此,SH2A可能通过抑制PKC信号通路而促进细胞凋亡.     

合浦珠母贝IGF2BP1基因的克隆与表达分析

胰岛素样生长因子2信使核糖核酸结合蛋白(insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein,IGF2BP)在脊椎动物体内功能很多,但在贝类中研究很少。为研究IGF2BP1是否参与了贝类的生物矿化过程,本研究通过RACE技术克隆获得合浦珠母贝(Pinctada fucata)IGF2BP1基因cDNA序列,命名为PfIGF2BP1。该基因全长2 980 bp,其中开放阅读框长1 737 bp,预测编码579个氨基酸,有4个KH结构域和2个RRM结构域。多重序列分析发现各物种的IGF2BP1氨基酸序列非常保守。实时定量PCR结果显示PfIGF2BP1在肠等8个组织和壳顶期等5个胚胎发育时期中均有表达,表达量最高的组织为珍珠囊(p0.05),说明Pf IGF2BP1可能参与了珍珠形成过程。Pf IGF2BP1在眼点期表达量最高,其次为壳顶期,说明PfIGF2BP1可能参与次生壳的形成过程。原位杂交表明PfIGF2BP1在外套膜边缘的外褶中表达,推测其可能参与棱柱层的形成。本研究为以后探讨IGF2BP1在贝类生物矿化过程中的作用奠定了基础。     

Src蛋白激酶活性的调节机制

Src蛋白激酶在人类多种肿瘤细胞中被激活并在肿瘤发生、发展过程中起重要作用.Src活性的调节主要包括共价修饰、异构调节,但基因突变和其他一些方式也可以调节其活性.Src共价修饰主要是磷酸化,Tyr530、Tyr419、Thr34、Thr46、Ser72、Tyr138和Tyr213等都是Src的磷酸化位点,其中Tyr530位点和Tyr419位点是Src最重要的磷酸化位点.异构调节包括SH3、SH2等区域结合的调节,分别涉及黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)、孕酮受体(progesterone receptor,PR)、雌激素受体(estrogen receptor,ER)、雄激素受体(androgen receptor,AR)、P130Cas、血小板源生长因子(the platelet-derived growth factor,PDGF)、血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR,HER1/erb B1)、人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2,ERBB2/HER2/NEU)、胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R)、纤维母细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor,FGFR1)、肝细胞生长因子受体(hepatocyte growth factor receptor c-Met)、人类1型T细胞白血病病毒编码的辅助蛋白p13、HIV-1毒力因子Nef和Sin.本文就Src蛋白激酶的调节机制作一简要综述.