Smad3基因剔除小鼠的繁殖与基因型鉴定

目的为进一步深入研究Smad3基因在脊椎动物发育中的重要作用,对Smad3基因剔除小鼠进行保种和繁育研究.方法采用基因剔除杂合子小鼠进行保种,通过PCR和Southern杂交对杂合子小鼠交配所产生的后代进行基因型鉴定,纯合子小鼠和野生型小鼠用于表型分析,杂合子小鼠用于留种和繁殖生产.结果采用PCR方法对278只子代小鼠进行了基因型鉴定,83只为野生型,133只为杂合子,62只为纯合子.结论Smad3基因剔除突变能稳定遗传.采用杂合子小鼠保种,子代小鼠三种基因型比例符合孟德尔遗传定律.     

DDR2基因缺失小鼠的繁育及子代基因型的鉴定

目的：探讨盘状结构域受体2（DDR2）基因缺失小鼠的优化繁殖方法与子代小鼠DDR2基因型的鉴定方法,建立DDR2基因缺失小鼠模型,为进一步研究DDR2分子在肿瘤、肺纤维化、类风湿性关节炎等复杂疾病中的功能以及作用机制奠定基础。方法：将从美国JAX实验室引进的三对杂合子小鼠进行饲养并交配繁殖,繁殖成功后其子代中将会出现野生型、杂合子以及纯合子3种基因型。用基因组提取试剂盒试剂盒提取子鼠鼠尾的基因组DNA,经紫外分光光度计定量后,采用Taqman qPCR的方法准确鉴定出小鼠的基因型,同时观察子代小鼠各基因型的比例,并通过小鼠体态观察,进一步证实Taqman qPCR鉴定方法的可靠性。结果：DDR2基因杂合子小鼠互交繁殖可得到DDR2野生型小鼠、DDR2纯合子小鼠以及DDR2杂合子小鼠三种基因型小鼠,所得子代基本符合孟德尔遗传规律,且雌性和雄性DDR2纯合子小鼠体长均较DDR2野生型小鼠和DDR2杂合子小鼠小,鼻子也较其它基因型小鼠明显变短,无繁殖能力。依据Taqman qPCR的结果所得出的纯合子小鼠体貌特征与文献报道一致,证实了Taqman qPCR结果的可靠性。结论：雌、雄性DDR2杂合子小鼠交配可有效获得DDR2基因缺失小鼠;实验所用Taqman qPCR方法能够准确鉴定子代小鼠的基因型,DDR2纯合子小鼠的获得为后续实验的提供了较理想的动物模型。     

Presenilin-1/Presenilin-2双基因敲除小鼠的繁育及基因型鉴定

目的:繁殖及鉴定Presenilins双基因敲除小鼠,为进一步研究阿尔茨海默症(AD)奠定基础。方法:将引进的野生型及PS1/PS2双基因敲除小鼠进行饲养并繁殖,繁殖成功的子代小鼠基因型有野生型、杂合子和纯合子3种。提取子代小鼠鼠尾基因组DNA,用PCR法和琼脂糖凝胶电泳鉴定基因类型。结果:PS1/PS2双基因敲除小鼠的饲养和繁殖均获得成功,繁殖结果符合孟德尔遗传规律,同时获得更多基因型小鼠和Presenilins双基因敲除小鼠。结论:正确的饲养繁殖以及鉴定方法是获得PS1/PS2双基因敲除小鼠的有效途径。     

Grx-1基因敲除鼠的繁殖及子代基因型鉴定

目的探讨glutaredoxin-1(Grx-1)基因敲除小鼠的优化繁殖及子代鼠的鉴定方法,为进一步研究Grx-1在支气管肺发育不良(BPD)中的作用奠定基础。方法将从美国哈佛医学院引进的纯合子Grx-1基因敲除小鼠与野生型小鼠进行交配后得到的子一代小鼠同代间相互交配,繁殖出的子二代中将出现纯合子、杂合子以及野生型3种基因型。从出生起观察其生长发育情况,2周龄时剪尾提取基因组DNA,用PCR方法扩增目的基因片段,琼脂糖凝胶电泳结果判定基因型。结果 Grx-1纯合子小鼠的饲养繁殖取得成功,获得了一批Grx-1基因敲除纯合子小鼠。结论正确的饲养繁殖以及鉴定方法是获得Grx-1基因敲除纯合子小鼠的有效途径,为相关研究提供动物实验模型奠定了基础。     

SPARC基因敲除小鼠的繁育及子代基因型的鉴定

目的:探讨富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白(SPARC)基因敲除小鼠的繁殖和鉴定方法,为进一步研究SPARC蛋白的功能奠定基础。方法:将所引进的杂合子小鼠进行饲养并繁殖,繁殖成功后其子代中将会出现野生型、杂合子以及纯合子3种基因型。提取子鼠鼠尾基因组DNA,用PCR法扩增SPARC和Neo基因片段,通过限制性内切酶酶切反应,证实PCR扩增产物的正确性;应用Westernblot检测SPARC蛋白质的表达,进一步证实PCR鉴定方法的可靠性。结果:SPARC基因杂合子小鼠互交繁殖结果基本符合孟德尔遗传规律,SPARC基因缺失纯合子小鼠有繁殖能力。琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物分子量大小与预期的目的基因片段相对分子质量大小一致,酶切和Westernblot结果证实PCR结果可靠。结论:PCR方法能够准确鉴定SPARC基因突变小鼠基因型。     

骨形态发生蛋白9基因敲除小鼠的构建

目的运用CRISR/Cas9技术敲除小鼠基因组中Bmp9基因片段,构建Bmp9基因敲除小鼠。方法根据Bmp9基因的外显子序列,设计一段sgRNA并合成。sgRNA体外转录后和Cas9mRNA混合后显微注射受精卵细胞,注射后的受精卵细胞移植至受体动物获得子代小鼠。提取子代小鼠基因组DNA测序鉴定其基因型。基因型鉴定正确的小鼠与野生型交配后筛选纯合子小鼠。同时取纯合子小鼠心脏、肝、脾、肺、肾,匀浆后提取总RNA和总蛋白,通过qPCR、WB和免疫组化检测BMP9在各组织中的表达。结果设计并合成20bp的sgRNA并进行体外转录,显微注射并回植后得到基因突变小鼠,连续交配后得F2代纯合子。测序结果显示,突变小鼠存在两种基因型,一种为5bp缺失突变,另一种为13bp缺失并伴有1bp插入突变。与野生型C57BL/6相比,qPCR、WB和免疫组化结果均表明基因敲除小鼠肝中BMP9表达显著降低。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建出了BMP9基因敲除小鼠。     

Caveolin-1基因敲除小鼠子代基因型的鉴定及繁育方法

目的探讨小凹蛋白-1(caveolin-1)基因敲除小鼠的鉴定方法与最优繁育方式,为深入研究caveolin-1在脑缺血损伤修复中的作用提供理想的动物模型。方法将引进的caveolin-1基因敲除小鼠饲养于SPF级实验室,煮沸裂解法提取鼠尾组织基因组DNA,根据美国杰克逊实验室(Jackson Laboratory)提供的引物序列进行PCR反应检测其基因型,采用caveolin-1~(+/-)杂合子互交、杂合子与caveolin-1~(-/-)纯合子杂交(正交及反交)、纯合子互交4种不同的交配方式,观察亲代小鼠的受孕率、子代小鼠的外形特征及纯合率。结果琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物分子量大小约200 bp和661 bp,与预期的目的基因片段分子量大小一致,成功鉴定了caveolin-1基因敲除小鼠的不同基因型;不同交配方式的繁殖结果基本符合孟德尔遗传规律,且雌性、雄性caveolin-1~(-/-)纯合鼠具有一定的繁殖能力,三种不同基因型小鼠的外形特征无明显差异。结论煮沸裂解法提取基因组DNA、PCR法能够快速可靠鉴定caveolin-1基因敲除小鼠的基因型;caveolin-1杂合子小鼠互交与纯合子互交相结合的繁育方法可能是短期内获得足量纯合子子鼠与同源野生子鼠的较好方式。     

几丁质酶结构域内含蛋白1(Chid1)基因剔除小鼠的建立

建立几丁质酶结构域内含蛋白1(chitinase domain containing 1,Chid1)基因剔除小鼠,观察小鼠表型和发育差异。设计了合适的基因剔除策略,成功构建了基因剔除打靶载体。以电穿孔方法将打靶载体导入ES细胞(embryonic stem cell),用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,挑选抗药的阳性克隆,提取ES细胞基因组DNA,用长臂PCR鉴定出阳性ES细胞。将阳性ES细胞复苏培养后注入小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠。嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配后获得Aguoti毛色的杂合子小鼠。在雌雄杂合子交配的后代中获得纯合子小鼠。从脑、脾脏、肝、肺的RNA水平鉴定来看,基因剔除小鼠的Chid1基因未表达,而杂合子、野生型小鼠有明显的该基因条带。经过初步的表型观察发现,Chid1基因剔除小鼠发育正常,未出现胚胎致死,交配繁殖能力无异常。几丁质酶结构域内含蛋白1(Chid1)基因剔除小鼠模型建立成功。Child1基因对于小鼠发育、生殖方面无明显作用。     

Ⅱ型肺泡上皮细胞Brg1基因条件敲低小鼠的基因型鉴定

该文旨在鉴定特异敲低Ⅱ型肺泡上皮细胞中Brg1(Brahma-related gene 1)基因小鼠的基因型,为进一步研究Brg1在肺相关疾病中的作用奠定基础。将两对转基因小鼠Brg1fl/fl和SP-C-rt TA/(tet O)7-Cre进行繁殖交配,将得到纯合子、杂合子及野生型3种基因型。出生后1周龄剪尾提取基因组DNA,PCR法判定基因型。用多西环素诱导法诱导(tet O)7-Cre重组酶活性,靶向剪切Ⅱ型肺泡上皮细胞上Brg1基因,磁珠分选法提取小鼠原代Ⅱ型肺泡上皮细胞,通过观察细胞生长特征、检测pro SP-C表达鉴定原代Ⅱ型肺泡上皮细胞,RT-PCR法、Western blot检测Brg1表达水平。结果显示,成功繁殖了Brg1纯合子小鼠,通过磁珠分选法成功分离了原代Ⅱ型肺泡上皮细胞,用多西环素诱导法成功敲低了Ⅱ型肺泡上皮细胞Brg1基因。该结果为相关研究提供动物模型奠定了基础。     

乳腺上皮细胞特异性敲除Scrib基因杂合子小鼠的制作与鉴定

目的利用Cre．LoxP重组酶系统构建乳腺上皮细胞特异性敲除Serib基因杂合子小鼠,并进行鉴定,为进一步在动物整体水平研究Scrib基因在乳腺癌中的作用提供研究平台。方法将Scrib条件敲除杂合子小鼠（Scrib＋/ft小鼠）进行繁殖并鉴定,然后将鉴定结果为阳性的子代Scrib＋/ft小鼠与乳腺上皮细胞特异性表达Cre重组酶的MMTV．Cre纯合子小鼠进行杂交,鉴定其子代小鼠的基因型。结果成功繁育Scrib条件敲除小鼠和MMTV．Cre小鼠,并通过鉴定得到Scrib＋/ft小鼠,与MMTV-Cre小鼠杂交并繁殖,获得基因型为Scrib＋/ft;MMTVCre＋/-小鼠5只。结论本研究利用Cre．LoxP重组酶系统成功构建了乳腺上皮细胞特异性敲除Scrib基因杂合子小鼠,为进一步研究极性蛋白Scrib表达下调在乳腺癌发生中的作用提供了良好的动物模型。     

脂肪细胞因子 CTRP4转基因鼠的构建与鉴定

目的：建立人CTRP4基因的转基因小鼠,为脂肪细胞因子CTRP4的体内功能研究奠定基础。方法首先构建人CTRP4的转基因小鼠线性化表达载体,再利用显微注射的方法将载体注射入小鼠受精卵,从而构建人CTRP4的首建鼠（ Founder ）并与野生型小鼠交配繁殖得到F1代阳性小鼠,再通过近亲繁殖与测交的方法,得到CTRP4转基因纯合子小鼠,并通过PCR和western blot 的方法对纯合子小鼠进行鉴定。结果得到人CTRP4转基因小鼠纯合子小鼠两个品系,western blot鉴定该转基因小鼠心脏,肝脏,脑,肾脏等多种组织中均呈现CTRP4高表达。结论成功构建了人CTRP4转基因小鼠纯合子小鼠。     

敲除NDRG2 基因的AD模型小鼠的构建与鉴定

目的:构建与鉴定NDRG2基因全身敲除的阿尔茨海默症(AD)小鼠模型。方法:将NDRG2-/-、APP/PS1进行饲养杂交繁殖,将通过PCR技术鉴定基因型为NDRG2+/-APP/PS1的子一代小鼠再与NDRG2-/-小鼠回交获得子二代小鼠,提取子二代小鼠的基因组DNA再利用PCR方法:扩增NDRG2和APP/PS1基因片段并进行琼脂糖凝胶电泳检测获得4种基因型的小鼠。结果:选取基因型为NDRG2-/-APP/PS1的小鼠即为全身NDRG2敲除且淀粉样蛋白基因过表达的阿尔茨海默症模型小鼠。应用PCR方法:鉴定NDRG2基因全身敲除的AD小鼠模型。成功获得NDRG2基因全身敲除的AD小鼠,该基因型小鼠有繁殖能力,其繁殖符合孟德尔遗传规律。结论:成功构建NDRG2基因敲除的阿尔茨海默症模型小鼠,为进一步研究NDRG2基因在阿尔茨海默症病理发展过程中的作用机制及新的治疗方法的研究提供模型基础。     

碱性鞘磷脂酶基因剔除鼠的基因型和表型特征

目的为研究alk-SMase在结肠癌发生发展中的作用提供动物模型的实验数据。方法将野生型(WT,+/+)、杂合子(+/-)、纯合子(KO,-/-)alk-SMase基因剔除小鼠剪尾提取DNA,PCR法作基因型鉴定;取其肝肠组织进行HE染色、激光共聚焦分析以及质谱仪检测,观察和分析不同基因型鼠的表型特征。结果与WT和杂合子比较,KO鼠显示:外观和体重无明显区别;基因型鉴定出现一个条带,其分子量为247 bp;小肠黏膜明显增厚,但alk-SMase表达减弱;质谱分析显示在肠道和肝脏中的鞘磷脂含量增高,1-磷酸鞘氨醇含量增加,而神经酰胺含量降低。结论 alk-SMase KO鼠有明显特征,但其外观和体重与其他基因型比较没有明显区别,为研究alk-SMase的生物功能提供了一个理想的动物模型。     

miR-5572转基因小鼠构建病态窦房结综合征疾病模型的繁殖与鉴定

目的探讨miR-5572转基因小鼠构建病态窦房结综合征疾病模型的可行性。方法繁殖与鉴定了miR-5572 F1及F2代野生型纯合子及杂合子小鼠,并通过形态学、心电图记录及窦房结组织Cav1.2、Cav1.3mRNA和蛋白表达水平测定来观察疾病模型。结果 F2代miR-5572纯合子敲入小鼠在形态上较野生型小鼠生长缓慢,体型较小。相较于杂合子和野生型小鼠,纯合小鼠的平均心率明显偏低(P0.05),差异有显著性。miR-5572纯合子小鼠窦房结组织Cav1.2、Cav1.3 mRNA和蛋白表达水平低于野生型(P0.05),差异有显著性。结论过表达miR-5572转基因小鼠可以构建病态窦房结综合征疾病模型。     

基于CRISPR/Cas9技术构建Plin1基因敲除小鼠模型及表型分析

利用CRISPR/Cas9技术构建纯合围脂滴蛋白(Plin1)基因敲除小鼠模型,并初步分析其表型.针对Plin1基因2号外显子前后序列设计sgRNA并构建表达载体,体外转录获得sgRNA后与Cas9蛋白混合,显微注射至小鼠受精卵中并进行胚胎移植.出生小鼠经测序及PCR基因型鉴定获得Fo代阳性小鼠;令Fo代小鼠与野生型小...     

S100a4-Cre×Ddr2flox/flox条件敲除小鼠的繁育及基因型鉴定

目的:利用Cre-LoxP重组酶系统构建成纤维细胞中Ddr2特异性敲除的纯合子小鼠并鉴定,为进一步研究Ddr2在肺纤维化中的作用提供基础。方法:将购买的Ddr2 loxp小鼠和成纤维细胞特异表达的S100a4-Cre小鼠分别繁殖与鉴定,然后将两种小鼠杂交与鉴定,最终得到基因型为Cre~× Ddr2~(flox/flox)的纯合子小鼠就是在成纤维细胞中Ddr2条件性敲除小鼠。结果:成功繁殖并用PCR技术准确鉴定了基因型为Cre~× Ddr2~(flox/flox)的纯合子小鼠,Western blot结果表明纯合子小鼠的肺成纤维细胞中Ddr2已缺失。结论:本研究利用Cre-LoxP系统成功构建了在成纤维细胞中Ddr2特异性敲除的纯合子小鼠,为进一步研究Ddr2在肺纤维化发展中的机制提供了研究平台。     

ERα基因敲除小鼠的繁育及子代小鼠基因型的鉴定

目的探讨雌激素受体α(ERα)基因敲除小鼠的优化繁育方法及ERα基因敲除小鼠子代鼠的鉴定方法,建立ERα基因敲除小鼠模型,为进一步研究ERα蛋白的功能奠定基础。方法用4种不同的交配方式观察子代鼠的各表型比率及雌、雄性ERα基因突变纯合子小鼠的繁殖能力;从子鼠鼠尾中提取基因组DNA,用PCR方法扩增ERα基因片段,琼脂糖凝胶电泳后观察结果。HE染色观察雌、雄性ERα-/-小鼠生殖系统表型变化。结果 WT、ERα+/-、ERα-/-各表型小鼠互交繁殖结果基本符合孟德尔遗传规律,且雌、雄性ERα-/-小鼠无繁殖能力。与WT比较,雄性ERα-/-小鼠睾丸脏器系数降低,睾丸病理变化表现为生精小管管腔膨胀,生精细胞层变薄,且排列不规则;雌性ERα-/-小鼠子宫脏器系数降低,子宫和卵巢病变明显,表现为:子宫浆膜、肌层、内膜层细胞排列不规则,卵巢有囊性病变、充血,无黄体。结论雌、雄性ERα+/-小鼠交配是繁育ERα-/-小鼠的较好方法;实验所用PCR方法能够精确鉴定ERα-/-小鼠,ERα-/-小鼠的获得为ERα蛋白功能的实验研究提供了较理想的动物模型。     

EERα基因敲除小鼠的繁育及子代小鼠基因型的鉴定

目的 探讨雌激素受体α(ERα)基因敲除小鼠的优化繁育方法及ERα基因敲除小鼠子代鼠的鉴定方法,建立ERα基因敲除小鼠模型,为进一步研究ERα蛋白的功能奠定基础.方法 用4种不同的交配方式观察子代鼠的各表型比率及雌、雄性ERα基因突变纯合子小鼠的繁殖能力;从子鼠鼠尾中提取基因组DNA,用PCR方法扩增ERα基因片段,琼脂糖凝胶电泳后观察结果.HE染色观察雌、雄性ERα<'-/->小鼠生殖系统表型变化.结果 WT、ERα<'+/->、ERα<'-/->各表型小鼠互交繁殖结果基本符合孟德尔遗传规律,且雌、雄性ERα<'-/->小鼠无繁殖能力.与WT比较,雄性ERα<'-/->小鼠睾丸脏器系数降低,睾丸病理变化表现为生精小管管腔膨胀,生精细胞层变薄,且排列不规则;雌性ERα<'-/->小鼠子宫脏器系数降低,子宫和卵巢病变明显,表现为:子宫浆膜、肌层、内膜层细胞排列不规则,卵巢有囊性病变、充血,无黄体.结论 雌、雄性ERα<'+/->小鼠交配是繁育ERα<'-/->小鼠的较好方法;实验所用PCR方法能够精确鉴定ERα<'-/->小鼠,ERα<'-/->小鼠的获得为ERα蛋白功能的实验研究提供了较理想的动物模型.     

基于CRSIPR/Cas9技术构建凝血因子8基因敲除小鼠模型及表型验证

基于CRISPR/Cas9技术构建凝血因子8(F8)基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。针对F8基因外显子1非编码区和外显子26下游序列设计sgRNA靶位点,体外转录获得sgRNA,与编码Cas9的mRNA混合后通过受精卵显微注射方法获得F₀代阳性敲除小鼠,通过繁育及基因型鉴定获得F8基因敲除纯合子小鼠(F8^-/-小鼠);通过逆转录PCR(RT-PCR)检测主要组织中F8基因在mRNA水平的表达情况,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血浆中F8基因在蛋白水平的表达情况;通过活化部分凝血活酶时间检测(APTT)和纤维蛋白原含量(FIB)测定实验检测F8基因敲除后小鼠凝血功能情况。PCR及测序结果表明F8基因在小鼠基因组中被成功敲除;RT-PCR 和ELISA检测结果显示,F8^-/-小鼠中F8在mRNA和蛋白水平上表达均显著低于野生型小鼠(WT小鼠)(P<0.000 1,P<0.01);APTT、FIB和滴血实验检测结果显示,F8^-/-小鼠血浆凝固时间显著高于WT小鼠(P<0....     

应用CRISPR/Cas9技术制备Ace2基因敲除小鼠模型及基因型的鉴定

本研究旨在应用CRISPR/Cas9技术高效构建Ace2 (angiotensin-converting enzyme 2)基因敲除小鼠模型,并繁殖、鉴定及验证Ace2基因敲除小鼠。通过构建靶向敲除Ace2基因的载体,体外将Cas9 mRNA和向导RNA (guide RNA, gRNA)显微注射到小鼠受精卵中,通过PCR和TA克隆测序对小鼠Ace2基因的第3至18号外显子删除情况进行检测和鉴定,繁育Ace2基因敲除小鼠并利用qRT-PCR和Western blot方法验证获得的Ace2~(-/Y)小鼠主要脏器中Ace2 mRNA和蛋白表达情况。结果显示,顺利构建表达gRNA载体并体外转录,成功将有活性的gRNA和Cas9 mRNA直接注射入受精卵,获得6只阳性F0代初建鼠,PCR和基因测序鉴定表明成功删除了小鼠Ace2基因的第3至18号外显子;F0代鼠与野生型鼠回交,得到3只阳性F1代鼠,再与野生型鼠相交配得到的后代为F2代,在F2代中选择Ace2~(-/+)雌性杂合子鼠与野生型鼠交配,获得F3代Ace2~(-/Y)雄性纯合子小鼠。qRTPCR和Western blot结果表明,F3代Ace2~(-/Y)小鼠肾脏和肺中未检测到Ace2 mRNA和蛋白表达。本方法通过CRISPR/Cas9技术成功制备了Ace2基因敲除小鼠模型,为进一步研究Ace2基因功能奠定了基础。