凝胶柱层析测定半乳糖苷转移酶的简易方法

半乳糖苷转移酶催化转移UDP-半乳糖上的半乳糖苷到葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖上,形成乳糖类化合物。本法采用一根Bio-gel P-2小玻璃柱(0.3×45cm)可以将产物乳糖与底物清楚地分开,为该酶活性的测定提供了一个简便的精确的新方法。     

荧光方法直接测定一氧化氮

根据2,3-二氨基萘(2,3-diaminonaphthalene,DAN)可与一氧化氮( ^·NO)反应生成荧光性2,3-萘酚三唑(2,3-naphthotriazole,NAT)和 ^·NO的气体特性,设计了一个流动气体和荧光方法相结合的 ^·NO直接测定方法.此法以惰性气体氮气为流动气体使样品中的待测 ^·NO随流动气体进入测定溶液,溶液中的DAN捕集流动气体中的 ^·NO生成荧光性NAT.实验结果表明测定溶液的荧光强度与 ^·NO浓度呈正比,与酸化亚硝酸盐溶液的浓度亦呈良好线性关系.用此方法测得五份酸化正常人血浆的 ^·NO浓度为(31.04±4.70) nmol/L,并可用于连续观察 ^·NO从亚硝基硫醇的自发释放.     

一种用于检测5′-核苷酸磷酸二脂酶的荧光底物合成方法

本文利用间苯二酚为原料合成4-甲基伞形酮,继而经过磷酸酯化,缩合等反应过程合成4-甲基伞形酮-5′-胸腺嘧啶核苷磷酸二酯。反应过程中对胸腺嘧啶核苷的3′位羟基未加任何保护,缩合反应特异地发生在核苷的5′位羟基上。产品经过DEAE-葡聚糖凝胶柱层析分离纯化。利用纸层析、吸收光谱和酶学反应特征鉴定都证明合成的产品对于5′-核苷酸磷酸二酯酶具有专一性,可以用于5′-核苷酸磷酸二酯酶活性测定以及其同工酶谱分析。     

用简易测定法进行呼吸强度的测定

呼吸作用是新陈代谢的重要组成部分．是植物体一切生命活动所需能量的来源．进行呼吸作用测定一般测定呼吸过程中O2的消耗量或CO2的释放量。     

利用6-磷酸-β-葡萄糖苷酶在低温条件下获得酶-底物复合物实际结构的方法

利用“酶晶体低温抑活底物固定”方法,在?20 ℃条件下,将6-磷酸-β-葡萄糖苷酶 (BglA) 晶体与底物对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷-6-磷酸 (pNPβG6P) 进行浸泡试验,通过X射线进行衍射数据收集并处理,获得了完整的底物电子密度图。研究结果表明,在不突变酶中关键基团使酶失活,以及不选用底物类似物替代原有底物的情况下,通过上述方法,可以获得酶与底物复合物的实际结构。该研究结果可为今后低温酶学及复合物中间态的进一步研究提供帮助。     

人体唾液维生素B6的快速荧光测定

人体唾液维生素Ｂ６的快速荧光测定□熊忠（中国科学院西北高原生物所,西宁８１０００１）维生素Ｂ６是水溶性维生素Ｂ族之一,它包括三种：吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺。吡哆醇在体内磷酸化转变为吡哆醛再生成吡哆胺,吡哆醛和吡哆胺在体内是以辅酶形式参与代谢。我们一般地...     

用质粒作底物测定核糖体失活蛋白酶活性的新方法

植物核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP)是一类能作用于核糖体最大RNA的独特蛋白质.它是研究蛋白质生物合成中核糖体RNA结构与功能的有力工具.利用RIP能在DNA中脱去一些腺嘌呤碱基使超螺旋DNA解旋的特点,分别以常用的质粒PUC18、PUC19和PBR322 DNA为底物,建立了测定RIP酶活性的一种新方法,其灵敏度是50ng(天花粉蛋白)和5ng(还原型的辛纳毒蛋白),酶催化反应的时间是60min.这个新方法具有方便、快捷、灵敏的特点,避免了常用方法中制备核糖体、提取RNA的仪器和技术条件的限制,检测的时间由原来的几天缩短到约120min,大大地降低了检测的费用,为广泛和深入地研究RIP提供了有利的条件.     

获取观察用草履虫的简易方法

选择温暖晴朗的日子 ,到池塘或水沟等处瓢取一定量的水装入瓶内 (根据我们的经验 ,在腐殖质丰富、生长有大量浮萍的水体中瓢取的水含草履虫较多 ) ,带到实验室后用滤纸进行过滤。过滤的目的是滤去大部分的水 ,使草履虫集中于剩下的水中 ,从而提高水中草履虫的含量。过滤时 ,将滤纸折成漏斗状放在玻璃漏斗上 ,再将采集来的水缓慢倒入漏斗内进行过滤 ,滤出的水和采集瓶底部带有杂质的水不要 ,直到漏斗里只剩下 2 0 ml左右的水时 ,停止过滤 ,并将漏斗内的水倒入干净的大培养皿里。大培养皿里水含有草履虫的数量与瓢取水量的多少成正比。将上面…     

磷酸化底物肽的硫代磷酸化及荧光标记

以蛋白激酶Ａ的一磷酸化底物肽ＬＲＲＡＳＬＧ为模型肽,研究了硫代磷酸化及荧光标记反应条件。荧光标记试剂５－｛「（（２－碘代乙酰）氨）乙基」氨基｝萘－１－磺酸（１,５－ＩＡＥＤＡＮＳ）适宜浓度为１．６ｍｍｏｌ／Ｌ,标记反应缓冲液的适宜ｐＨ为７至８。实验了标记肽分别在Ｎ－端序列分析、电喷雾质谱和０．１％三氟乙酸存在下的稳定性。比较了标记肽和标记肽的紫外吸收光谱的差异特征。初步显示高效液相色谱蛋白酶解肽谱     

荧光底物在酶联免疫吸附试验中的应用

碱性磷酸酶底物,对硝基酚磷酸二钠(PNPP),在酶联免疫吸附试验(ELISA)中已普遍使用。本实验用一种荧光底物,4-甲基聚缴花酮磷酸酯做间接ELISA反应(FS-ELISA),同前者进行了比较。当用0.1ml的黄瓜花叶病毒(CMV),浓度为0.1ng/ml包被时,在紫外光下仍可看到反应所产生的荧光。FS-ELISA对CMV测定的敏感度比用PNPP底物时高100倍。最后对该方法用于定性和半定量检测抗原的问题进行了讨论。     

用DANS反应-聚酰胺薄膜层析-荧光方法对小鼠尾壳核γ-氨基丁酸和牛磺酸的超微量测定

本工作将DANS反应和微量薄膜层析技术与荧光测量加以修改后联用,并注意了组织样品的去蛋白和DANS-牛磺酸洗脱剂的改进,获得了满意的定量测定氨基酸的结果。GABA、牛磺酸的浓度(GABA:0—60×10~(-12)克分子;牛磺酸:0—300×10~(-12)克分子)与其相应的DANS衍生物的荧光强度成线性关系。回收率分别为95—113％和82—94％。灵敏度比原有荧光方法提高了近100倍(10~(-12)克分子数量级)。用此法测得小鼠尾壳核中的GABA和牛磺酸分别为1.26±0.06和15.5±1.0微克分子/克湿重,组织样品只需0.5毫克或更少些。这为测定微量神经组织中的自由氨基酸提供了一种简便的超微量方法.     

肥胖基因FTO作用底物是RNA中的6-甲基腺嘌呤

RNA在众多细胞工作机制中具有调控和信息分子双重功能的作用。因此,RNA修饰的研究是生物学的一个新兴领域。据最新的RNA修饰数据库RNAMDS中一共收集并记录了109种RNA的修饰形式,其中RNA甲基化修饰占80%,尤其是6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A),是发生在腺嘌呤A第六位N原子上的甲基化,也是真核生物RNA内部序列中最常见的一种转录后修饰形式。最新研究发现:肥胖基因FTO表达的相关蛋白可以脱掉6-甲基腺嘌呤上的甲基,而且研究表明,该甲基化过程是可逆的。激活或敲除6-甲基腺嘌呤甲基转移酶基因会引起生物体重要的表型变化,本文将通过体外模拟生理环境条件下的去甲化底物反应条件,共同孵育FTO野生型和FTO突变型的基因表达的蛋白酶分别与RNA甲基化底物作用的实验,再利用质谱与高效液的技术对多种甲基化形式予以进一步探索,来发现FTO表达蛋白对单链RNA上的6-甲基腺嘌呤具有去甲基化功能。同时,经过体内试验的验证,在FTO基因敲低细胞中m RNA中的6-甲基腺嘌呤水平升高;相反,在FTO基因过表达细胞中m RNA中的6-甲基腺嘌呤水平降低;而6-甲基腺嘌呤甲基化酶METTL3的表达均未受到影响。     

用凝集素和非同位素标记底物测定核心α－1，6－岩藻糖转移酶及其应用

报道了一个不需同位素和ＨＰＬＣ的α－１,６－岩藻糖转移酶（α１,６ＦｕＴ,又称核心岩藻糖转移酶）的测定法,包括从正常人血浆提纯运铁蛋白,消化成带有天冬酰胺（Ａｓｎ）的二天线Ｎ－糖链,去除外端唾液酸和半乳糖后,用生物素酰胺乙酰基团标记其Ａｓｎ,并以此生物素衍生物标记的Ａｓｎ－七糖的Ｎ－糖链为受体底物,ＧＤＰ－Ｌ－岩藻糖为供体底物,用ＬＣＡ柱吸附法分离岩藻糖化后的产物,再用ＨＲｐ－Ａｖｉｄｉｎ交联物与柱上带有生物素的产物结合,此ＨＲＰ－Ａｖｉｄｉｎ－生物素。岩藻糖化产物从柱上洗脱后测定ＨＲＰ活力可代表α１,６ＦｕＴ活力。此法在较宽的范围内,产物量与酶量和反应时间成正比．人肝细胞癌、亚硝胺诱发大鼠肝癌后期或用佛波酯（ＰＭＡ）处理人肝癌细胞后,α１,６ＦｕＴ增高,而用视黄酸或ｄｂ－ｃＡＭＰ处理人肝癌细胞后,则该酶活力降低。     

血清γ-谷氨酰转肽酶活力的简易微量测定

正常人血清γ-谷氨酰转肽酶的活力很低。在急性肝炎,肝癌和梗阻性黄疸等患者中,血清γ-谷氨酰转肽酶活力显著升高,可高达正常人血清中活力的100倍。因此对于肝胆系统疾病的诊断有一定意义,与其他酶活力测定等配合也有助于肝癌的诊断。     

用网筒固定小白鼠的简易方法

在人工饲养蚊虫喂血时,往往将小白鼠四肢用大头针钉子木板上,或是用铁夹夫于木板上。这些方法不但麻烦,而且对小白鼠四肢均有严重损伤,甚至导致死亡,难以重复利用。为此,我们研制了用网筒固定小白鼠的简易方法,经反复改进,试用效果良好。！制作方法：本网筒用4目网孔铁纱按大小分为3种型号,长均为15cm,横断面为椭圆形,长短轴分别为：巨型为主scm及二scm、11型为3cm及Zcm、Ill型为2．scm及Zcm。将4国铁纱按所需尺寸剪下后,弯成扁圆筒状,使接头处在椭圆短轴上,用细铁丝缝合即成。2使用方法：按小白鼠大小选用相应型号的网简。…     

△6-脂肪酸脱氢酶对n-6和n-3途径中脂肪酸底物的偏好

添加α-亚麻酸作为底物,经半乳糖诱导,在含有少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的酿酒酵母总脂肪酸中检测到十八碳四烯酸的生成;同时添加亚油酸和α-亚麻酸时,检测到γ-亚麻酸和十八碳四烯酸生成,而且十八碳四烯酸的含量是γ-亚麻酸含量的3.81倍,表明在酿酒酵母中少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶不仅能催化α-亚麻酸生成十八碳四烯酸,而且偏好n-3途径中的底物α-亚麻酸.同样,在改变少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列后所构建的转基因酵母中,也得到类似的结果,而且各种目的脂肪酸的含量均有明显提高.     

肺活量的简易测定

实验器材塑料袋一个(不漏气,体积为5000毫升左右)、短玻璃管一根、水桶二个、量杯一只、铁块一块(5公斤左右)、细线若干。实验步骤把铁块(上系一条线)放入一只水桶内,盛满水。把塑料袋的开口端用细线扎紧,在袋的底角上剪一个小孔,使玻璃管刚好插