鲑鱼降钙素串联基因的克隆、表达及重组蛋白的生物学活性

目的：将鲑鱼降钙素(salmon calcitoni,sCT)基因以同向串联方式连接,构建串联多拷贝基因的表达质粒pHis-nCT(n≤3),并在原核中表达,研究表达产物的降钙活性。方法：采用半化学半酶促法合成sCT基因,利用基因的特点及特殊的酶切位点NdeI和SamI在表达载体pTrcHisC中进行sCT基因与载体基因的融合及sCT基因的串联,并在TOP10中表达串联多拷贝基因。表达产物形成包含体,对包含体变性、复性后,以Ni-Chelating Sepharose亲和纯化。用血清钙浓度测定法研究串联表达产物及裂解产物的降钙活性。结果：重组菌表达的串联融合蛋白经过变性、复性及亲合层析,纯度达到90％以上。活性试验表明,串联融合蛋白及其裂解产物可以抑制破骨细胞,降低血清钙浓度,且呈剂量效应关系。结论：原核表达质粒pTreHisC可以有效表达串联的sCT基因,重组的串联蛋白及裂解产物均有降钙活性。     

报告基因

报告基因(ｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅ)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因,也就是说,是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因,或与其它目的基因相融合,在调控序列控制下进行表达,从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控,筛选得到转化体。作为报告基因,在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件:(1)已被克隆和全序列已测定;(2)表达产物在受体细胞中不存在,即无背景,在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物;(3)其表达产物能进行定量测定。在植物基因工程研究领域,已使用的…     

杆状病毒载体及其在昆虫细胞中表达外源基因的研究进展

本文介绍了杆状病毒载体在昆虫细胞中表达外源基因的基本策略和发展趋势。杆状病毒载体系统近年来已被人们广泛用来表达人类、动物和植物等的一些重要蛋白质分子,在医学、农业等领域的基因工程研究中发挥了越来越大的作用。杆状病毒载体系统表达外源基因的效率高,表达产物的结构和活性与天然产物一致,为当今基因工程研究中最有发展前途的病毒载体表达系统。     

日本血吸虫中国大陆株21.7kD蛋白编码基因的克隆和表达

根据日本血吸虫菲律宾株编码21.7kD蛋白的基因设计引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用RT-PCR法扩增出大小为558bp的基因片段。经序列分析推断该基因片段为编码日本血吸虫中国大陆株21.7kD蛋白基因的完整阅读框,与菲律宾株该基因的碱基序列同源性为98%。将其克隆到表达载体pET28a(+)中,在大肠杆菌BL21中获得表达,融合表达产物分子量约为25.4kD。利用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对该表达产物进行Western印迹检测,在预测位置出现了明显的识别条带,说明该基因的表达产物具有抗原性。     

中枢神经系统中Isl-1基因的表达

同源框基因Isl—1是LIM基因家族的一员。在哺乳动物中Isl—1基因主要在胰岛中表达,表达产物结合于胰岛素基因的增强子,调控胰岛素基因的转录。由于近年来发现胰岛素及其受体也存在于神经系统中,因此观察了中枢神经系统中是否有Isl—1基因的表达。     

地衣芽胞杆菌ATCC9945A中γ-聚谷氨酸降解酶基因的克隆、表达及降解性能鉴定

目的:验证在地衣芽胞杆菌ATCC9945A中存在着γ-聚谷氨酸降解酶基因(ywtD),为下一步解决在γ-聚谷氨酸微生物发酵合成过程中产物γ-PGA降解的技术性难题提供依据。方法:通过在pET-28b(+)大肠杆菌表达系统克隆表达地衣芽孢杆菌ATCC9945A中的ywtD基因,对诱导表达条件进行优化,采用SDS-PAGE和Western Blot方法检测目的蛋白的表达,并体外酶解实验验证其活性。结果:PCR扩增得到了一个1 245bp的基因片段,预期编码414个氨基酸,诱导表达后得到一个分子量大小约为45.6 kDa的表达产物。Western Blot分析结果表明ywtD基因得到了有效表达。体外酶解实验表明该表达产物具有降解γ-PGA的活性。结论:证明在地衣芽胞杆菌ATCC9945A中存在着γ-聚谷氨酸降解酶基因。     

外源基因在酵母中的表达

随着基因工程研究的发展,至今已建立了不少系统可以用来表达外源基因。酵母系统就是其中最常用的系统之一。酵母作为外源基因的表达系统的好处在于:①酵母是一种传统的工业微生物,广泛被用于酿酒和食品工业中。它不会产生毒素,因此用它来表达医药工业和食品工业上有用的蛋白质,极易被人们所接受。②酵母是一种真核生物。尽管这是一种低等的真核生物,但它仍具有一般真核生物的特点。在基因工程中需要表达的外源基因多数来自人类或其他真核生物。要使表达产物具有生物活性常常需要对表达产物进行加工。酵母基本上具备这种能力。因此用酵母表达的产物生物活性要比原核生物表达的好。③酵母的遗传学     

融合表达载体的研究进展

基因工程的实施,主要包括DNA克隆、外源基因的表达及其重组产物的纯化。基因表达是指一个外源基因在表达系统中,既能高效表达又具有原来的生物学活性。目前有三个表达系统,即大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞。其中大肠杆菌最早研究应用,但表达质粒转人受体菌（宿主）后,并不都能获得理想的结果,它涉及到许多因素：诸如基因结构的特点、mRNA的转录效率、蛋白质的折叠、宿生蛋白酶对重组产物的水解作用、外源基因和E·COlt基因间所存在的差异以及表达产物对宿主细胞的毒性等;此外,在高效表达的同时,为了更好地获得人们所需要的重…     

外源蛋白在大肠杆菌中的表达定位策略

外源基因在大肠杆菌中表达是对基因重组技术的成功应用。外源基因在不同的大肠杆菌表达系统中表达产物可能定位于大肠杆菌空间结构的不同位置：胞质,胞质膜,胞周质,胞外膜和胞外培养基,五种表达定位方式各有其特点和途径。     

外源蛋白在大肠杆菌中的表达定位策略

外源基因在大肠杆菌中表达是对基因重组技术的成功应用。外源基因在不同的大肠杆菌表达系统中表达产物可能定位于大肠杆菌空间结构的不同位置:胞质,胞质膜,胞周质,胞外膜和胞外培养基,五种表达定位方式各有其特点和用途 。     

内生菌次生代谢产物提高玉米渗透胁迫抗性的表达谱分析

利用基因芯片技术对10%PEG渗透胁迫下植物内生菌次生代谢产物处理的玉米进行差异基因表达谱分析。结果显示,检测到的差异表达基因共计441个,其中上调表达基因147个,下调表达基因294个,参与21条代谢通路。采用晶芯生物分子功能注释系统V 3.0(MAS)将差异表达基因进行GO功能分类,其中45%基因参与各种生物学过程;18%基因与生成各种细胞组分有关;36%基因编码产物则与执行各种分子功能有关;1%与Gen Bank中功能未知序列相对应。KEGG代谢分析表明差异表达基因广泛涉及基础物质代谢、能量代谢、次生代谢及信号转导途径。表达谱分析结果表明,在渗透胁迫下次生代谢产物对玉米的影响是一个多基因参与、多个生物途径协同调控的过程。     

杆状病毒表达系统研究进展

介绍了杆状病毒表达系统的构建策略,载体发展情况及其表达外源基因的影响因素.杆状病毒表达系统在基因工程、药物开发、疫苗生产等方面发挥了越来越重要的作用,其表达效率高,表达产物与天然产物有相似的结构和活性,且对人畜无害,为当今基因工程研究中最有发展前途的表达系统.     

RGD肽与尿激酶B链融合蛋白原核重组表达质粒的构建、表达和功能的初步分析

将化学合成的RGD肽(Arg-Gly-Asp)编码寡核苷酸与尿激酶B链cDNA相连成为融合基因后,克隆至原核表达质粒pBV220中,在P-RP-L启动子的作用下,经42℃热诱导,在大肠杆菌DH5α中获得了融合基因的表达,其表达量占菌体总蛋白的9.2%,表达产物以无活性的包含体形式存在。经变复性处理得到纯化的融合基因的表达产物,经Western blotting分析表明产物具有与天然尿激酶相似的抗原性,体外活性分析显示其具有一定的纤溶和抗血小板聚集的活性。     

丙型肝炎病毒C+E1区基因在原核细胞中的克隆与表达

将丙型肝炎病毒Ｃ＋Ｅ１区基因插入到原核高效表达载体ｐＢＶ２２１质粒中,构建了质粒ｐＢＶ２２１ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１作为表达载体,然后,将含有该质粒的宿主大肠杆菌进行升温诱导表达ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１区基因,并对表达产物进行了生物活性的检测。结果表明,插入到表达载体ｐＢＶ２２１中的ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１基因片段能够得到有效的表达,表达产物主要为非融合蛋白形式存在于细胞中,同时这种Ｃ区和Ｅ１区连接共表达的产物保持了良好的抗原活性     

利用GST融合蛋白表达系统表达与纯化人N-Ras蛋白

目的:克隆人N-ras蛋白全长编码区基因,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人N-ras蛋白全长编码区基因,将其克隆到p GEX-KG载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,SDS-PAGE鉴定表达与纯化产物。结果:从人乳腺文库中扩增获得约600 bp的DNA片段,并克隆至p GEX-KG载体上,经测序与目的序列完全一致;在大肠杆菌Rossate中诱导表达出相对分子质量约47×103的目的蛋白;纯化后,经鉴定获得了纯度较高的重组蛋白GST-N-Ras。结论:获得了重组蛋白GST-N-ras,为后续深入研究Ras基因与其他癌基因、抑癌基因的相互作用奠定了基础。     

链霉菌Streptomyces olivaceoviridis A1 木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌及毕赤酵母中的高效表达

从橄榄绿链霉菌StreptomycesolivaceoviridisA1中克隆出木聚糖酶基因xynA ,将带与不带原基因信号肽编码序列的xynA分别以正确的阅读框架克隆到大肠杆菌表达载体pET 2 2b( )上的pellB信号肽编码序列之后 ,得到 2种构建的重组载体 ,在重组大肠杆菌中木聚糖酶得到了表达 ,表达产物具有生物活性。进一步将不带原基因信号肽编码序列的xynA插入到毕赤酵母转移载体pPIC9中 ,转化毕赤酵母得到重组子 ,在重组子中木聚糖酶基因得到了高效分泌表达 ,在摇床培养水平上的表达量达到 2 0 0mg L ,且表达产物具有生物学活性。     

肥胖基因的分离及其在大肠杆菌中的表达

利用PCR技术自外周血白细胞染色体DNA中扩增获取了肥胖基因(ob基因)的外显子2和3序列.经过拼接,获得了全长的ob基因编码序列. 测序结果表明,获得的序列与文献报道完全一致.利用PCR技术扩增出成熟蛋白的编码序列,克隆至表达载体pBV220中获得了表达菌株,并对表达产物进行了初步纯化,为进一步研究ob基因产物的功能与应用奠定了基础.     

RGD肽与尿激酶B链融合蛋白原核重组表达质粒的构建,表达和？…

将化学合成的ＲＧＤ肽（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）编码寡核苷酸与尿激酶Ｂ链ｃＤＮＡ相连成为融合基因后,克隆至原核表达质粒ｐＢＶ２２０中,在ＰＲＰＬ自动子的作用下,经４２℃热诱导,在大肠杆菌ＤＨ５α中获得了融合基因的表达,其表达量占菌体总蛋白的９．２％,表达产物以无活性的包含体形式存在。经变复性处理得到纯化的融合基因的表达产物,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析表明产物具有与天然尿激酶相似的抗原性,     

人源抗TNF—α抗体Fab基因的单链化及其表达和纯化

构建人源抗TNF－α单链抗体基因,并尝试其在E.coli中的表达和纯化,采用人工接头,按VH－linkerVL的结构将人源抗TNF－a的VH,VL基因拼接成单链抗体（ScFv)基因,并将构建好的ScFv基因插入表达载体pQE30,转染E.coli M15,以IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂纯化表达产物,构建的ScFv基因长723bp, 列分析表明,该序列拼接正确,SDS－PAGE显示,用重组的pQE30转化的M15菌经诱导后,有相对分子质量（M）约为52000的外源蛋白表达,Ni-NTA树脂纯化的表达产物纯度大于90％,因此,成功地构建了人源抗TNFa的ScFv基因,并在E.coli DH5a中表达和纯化的该基因的产物。     

重组A型产气荚膜梭菌α毒素C端基因在大肠杆菌中的高效表达

在成功克隆A型产气荚膜梭菌α毒素C端基因(cpa408基因)后,发现基因N端ATG后密码子在大肠杆菌中的使用频率普遍偏低,在不改变氨基酸的前提下,对N端基因进行修饰,构建重组表达质粒pBV220cpa408,导入大肠杆菌DH5α中,经温度诱导,cpa408基因获得了高效表达,表达量达菌体总蛋白的4375%,表达产物以可溶形式存在。经Westernblot分析,表达产物能被标准抗α毒素血清识别。