DREB1A类转录调控域中对转录激活功能起关键作用的氨基酸

从烟草品种k326中克隆到2个干旱应答元件结合蛋白类(DREB-Like)转录因子基因,命名为NtDREBI和NtDREB1A.序列分析发现,NtDREBI和NtDREB1A编码的蛋白质具有典型的AP2/EREBP转录因子家族EREBP亚族A类特征.酵母单杂交结果显示,NtDREBI具有激活功能, 而NtDREB1A不能激活下游基因,但可以与DRE元件结合.将NtDREBI、NtDREB1A与其它AP2/EREBP类转录因子序列比对,发现在C末端第148位氨基酸有显著差别.采用定点突变方法进一步研究表明,DREB1A类转录因子的第148位氨基酸残基与其邻近氨基酸残基的相互作用对调控转录激活功能起关键作用.     

小黑杨环锌指蛋白基因的克隆与表达分析

用cDNA-AFLP技术从小黑杨中克隆与盐胁迫反应相关的cDNA片段,进一步应用RACE技术克隆出具有完整开放读码框的小黑杨环锌指蛋白基因（PsnRZF）,该基因全长1061bp,其中5非翻译区为184bp,3非翻译区为82bp,开放读码框为795bp,编码264个氨基酸,预测蛋白的分子量为30.25kDa,理论等电点为8.04。实时定量PCR检测的结果显示,正常生长条件下该基因在根、茎、叶中都表达;NaCl胁迫下,该基因在根、茎、叶中的表达量升高。在叶中的表达量随着处理时间的延长而逐渐升高,胁迫处理后第6天表达量达到最高。     

棉铃虫(Helicoverpa armigera)FK506结合蛋白基因的克隆、表达与纯化

为了深入了解FK506结合蛋白基因的作用和探索调控棉铃虫CYP6B6的表达机制,基于单酵母杂杂交结果采用RT-PCR的方法从棉铃虫的中肠cDNA中扩增得到了FK506结合蛋白基因,将测序正确的目的片段克隆至原核表达载体pET32a中,在大肠杆菌BL21中用异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导表达,通过镍柱离子亲和层析纯化目的蛋白。用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达和纯化结果,并用Western blotting进行验证。结果表明,克隆得到的目的基因大小为327 bp,编码108个氨基酸残基,预测蛋白质分子量和等电点分别是11.78 kD和7.87。氨基酸序列分析表明该序列具有完整的开放阅读框,且没有信号肽。重组质粒pET32a-FKBP在大肠杆菌BL21中获得表达,主要以可溶性形式存在,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,Western blotting检测发现纯化的目的蛋白大小正确且纯度高。     

高山离子芥铁转运蛋白基因编码序列的克隆及其抗逆性表达的实时定量分析

铁转运蛋白 (iron transport protein,IRT)是具有跨膜运输离子功能的特殊蛋白质,属于金属离子转运家族的成员．本研究运用RACE方法从高山离子芥（Chorispora bungeana）中克隆得到完整的铁转运蛋白cDNA,命名为CbIRT（基因登录号为EU330924）．该基因全长1 290 bp,包含1个1 035 bp的开放阅读框（ORF）,编码344个氨基酸的蛋白．系统进化树分析显示,该基因与拟南芥AtIRT1和遏蓝菜TcIRT-G的亲缘关系最近,同源性分别达到了87.4%和86.5%,而在氨基酸序列水平与拟南芥AtIRT1的同源性达到了89%,表明克隆得到的CbIRT属于金属离子转运体家族成员．实时荧光定量方法对高山离子芥CbIRT基因在不同温度和铁营养水平条件下的表达情况进行分析表明,CbIRT对零下低温和零上低温的表达水平呈截然不同的反应;正常铁营养状态下,CbIRT是微量表达的,而缺铁及低温处理都可以大幅度地促进该基因的表达,富铁可以抑制该基因的表达．显示了该蛋白在转运Fe离子方面的重要作用．     

向普通小麦导入纤毛鹅观草抗黄矮病基因的研究──Ⅰ.F_1和BC_1的产生及其细胞遗传学

为了将纤毛鹅观草Z1010对黄矮病毒株系PAV和RPV的抗性基因转入普通小麦,通过幼胚拯救,获得了纤毛鹅观草Z1010×普通小麦品种莱州953的杂种F1,以及用5个普通小麦品种（系）回交的BC1衍生系。对杂种F1及BC1植株的细胞学分析表明,纤毛鹅观草Z1010不仅对Ph基因具有很强的抑制作用,而且能使杂种F1形成未减数配子,对细胞遗传学资料的进一步分析认为,通过部分同源染色体间的交换将纤毛鹅观草Z1010的抗黄矮病基因转入小麦是可能的。     

盐地碱蓬DREB同源基因SsDREB的功能研究

Ss DREB是从盐地碱蓬克隆获得的一个DREB2类转录因子,其表达受高盐和干旱诱导,而对ABA和低温处理反应不明显。本研究将Ss DREB与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建融合表达载体并在洋葱表皮细胞中进行瞬时表达,结果表明SsDREB编码蛋白定位在细胞核中;酵母转录激活实验证明,Ss DREB能特异性结合DRE顺式作用元件,并激活下游报告基因的表达;采用农杆菌介导法将Ss DREB基因在35S启动子的驱动下转入烟草中,获得的转基因植株对干旱和盐胁迫抗性均显著提高;为研究Ss DREB过量表达提高转基因烟草抗旱、耐盐能力的分子机制,选取烟草中与提高质膜稳定性、消除活性氧和渗透平衡相关的8个逆境胁迫相关基因,以烟草α-tublin基因做为内参,利用半定量RT-PCR方法分析在正常生长条件下这8个基因在转基因烟草和对照烟草中的表达情况,实验结果表明这8个基因都受外源Ss DREB基因的调控,其中6个基因在转基因烟草中的表达量显著高于非转基因植株。     

缺铁应答基因FOX1上游调控基因的筛选

[目的]筛选与莱茵衣藻FOX1基因启动子结合的调控基因序列。[方法]利用酵母单杂交的方法,构建pHIS2.1-FOX1诱饵载体,并将其转入到酵母菌株Y187中,在SD/-Trp/-His/-Leu/50 mmol/L 3-AT筛选培养基上挑选酵母阳性转化子,PCR克隆阳性转化子的序列并测序,利用Blastx程序检索phytozome莱茵衣藻基因组数据库,获得阳性转化子序列的同源基因信息。[结果]18个酵母阳性转化子测序成功,其同源基因主要有CTR型铜离子转运体(CTR2)、核糖体蛋白,和参与光合作用、氧化还原反应和物质运输等方面的功能蛋白。[结论]利用酵母单杂交技术筛选到缺铁应答基因FOX1潜在的上游调控基因。     

棉花脱水应答元件(DRE)结合蛋白GhDBP1的原核表达、纯化及其DNA结合活性

棉花是一种重要的经济作物,其生产和产量要受到干旱、低温和高盐等环境胁迫的影响,因此提高棉花对这些胁迫的抗性非常重要.脱水应答元件(DRE-dehydrationresponsiveelement)结合蛋白(DBP)在调节植物对环境胁迫的抗性中起到非常重要的作用.而且过量表达DBP类基因的转基因植株能够很好抵抗这些环境胁迫,所以研究棉花中此类DRE元件结合蛋白对棉花生产有非常重要的意义.在以前的工作中,从棉花中分离一个DBP基因,命名为GhDBP1并在转录水平上分析它在棉花植株中的表达特征.在研究中,报道了GhDBP1的原核表达、纯化和它的DNA结合特性.GhDBP1基因的编码区用PCR技术扩增出来插入到原核表达载体pET28a中,并转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中.经过IPTG诱导,GhDBP1融合蛋白在BL21(DE3)菌株中成功进行表达.利用Ni-NTA亲和层析技术得到了纯化的融合蛋白.在非同位素的凝胶滞留实验中,纯化的GhDBP1融合蛋白能够结合到含有DRE元件的DNA片段上.另外,用SWISS-MODEL软件对GhDBP1蛋白的DNA结合区的三维结构进行了计算机模拟.模拟的结果显示,GhDBP1蛋白的DNA结合区的主链结构和折叠模式与已知的拟南芥GCC盒结合蛋白AtERF1的DNA结合区结构很相似.这些结果显示了GhDBP1是一个脱水应答元件(DRE)结合的转录因子,并可能运用与AtERF1的DNA结合区相似的结构和它的目标序列脱水应答元件(DRE)相结合.     

棉花中一个类DREB1/CBF基因(GhDREB1L)的分子克隆及其功能分析

DREB1/CBF类转录因子在植物抵抗外界环境胁迫上起到非常重要的作用, 而且对于利用基因工程技术来提高植物的抗逆性也非常有用. 从棉花中分离出一个编码DREB1/CBF类蛋白(GhDREB1L)的cDNA, 并对该蛋白质的序列特性、DNA结合特性及转录本的表达特征进行了分析. GhDREB1L含有一个保守的AP2/ERF结构域, 其氨基酸序列与其他植物中DREB家族的DREB1/CBF组成员高度相似. 采用Ni-NTA亲和层析技术, 成功纯化了在BL21 (DE3)菌株中表达的GhDREB1L蛋白的DNA结合区. 凝胶滞留实验揭示, 纯化的GhDREB1L融合蛋白能够特异性地与已经得到鉴定的DRE元件(核心区, ACCGAC)以及胚胎发育晚期丰富蛋白基因LEA D113启动子区中的类DRE元件(核心区, GCCGAC)结合. 半定量RT-PCR显示GhDREB1L基因在棉花子叶中受到低温、干旱以及NaCl处理的诱导. 这些结果暗示了棉花GhDREB1L转录因子可能是通过与DRE元件的结合, 在低温、干旱及高盐的应答途径中起重要作用.     

应用酵母单杂交系统分离水稻蜡质基因5'调控区结合蛋白的基因

在水稻蜡质基因５’上游区中一段３１ｂｐ 核苷酸序列能与水稻未成熟种子核蛋白特异结合。为了克隆这一核蛋白基因,以此３１ ｂｐ 序列构建成“鱼饵”质粒,从水稻ｃＤＮＡ文库中筛选到１３ 个阳性克隆。根据这些阳性克隆中插入ｃＤＮＡ 片段的相互杂交结果,对这些克隆进行了分组。     

茶树肌动蛋白基因（CsActin1）全长cDNA克隆与生物信息学分析

以茶树（Camellia sinensis）萌动芽为材料,根据茶树萌动芽芽抑制消减杂交文库中分离得到的肌动蛋白（actin）基因的5′-片段设计引物,利用3′-RACE技术克隆了其cDNA全长序列,该基因cDNA全长1 470 bp,命名为CsActin1（GenBank登录号HQ235647）。序列分析表明,CsActin1开放阅读框长1 134 bp,编码377个氨基酸,5′非编码区100 bp,3′非编码区236 bp。推测的蛋白质分子量为41.70 kD,等电点约为5.31,具有肌动蛋白家族的特征信号序列（YVGDEAQs.KRG和WIAKaEYDE）和肌动蛋白相关蛋白的特征信号序列（LLTEApLNPkaNR）。CsActin1与GenBank中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在80%以上,氨基酸序列相似性在95%以上。与其它植物肌动蛋白的进化树分析结果表明,茶树肌动蛋白与杨树的两个肌动蛋白间的亲缘关系最为密切。并对推导的蛋白结构进行了分析。     

长春花钙调素基因克隆及其假基因的识别

以长春花[Catharanthus roseus(L.)G.Don]叶片cDNA和基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增得到了长春花钙调素基因447 bp的全长编码cDNA序列和2个大小不同的DNA片段.序列分析表明,DNA长片段全长1 551 bp,由2个外显子和1个内含子构成,为长春花钙调素基因编码区DNA片段;DNA小片段全长447 bp,与447 bp的长春花钙调素基因cDNA核苷酸一致性高达87%,有56个碱基的差异,其中位于226 bp处的碱基A突变为T,即由AAG突变为终止密码子TAG使翻译提前终止.推测此447 bp的DNA小片段可能为长春花钙调素基因的假基因,命名为CCaMP1.     

茶树细胞周期蛋白基因的克隆与表达

以茶树萌动芽为材料,采用SMART-RACE PCR技术从茶树萌动芽中获得了茶树细胞周期蛋白基因的全长cDNA序列(命名为CsCYC1),并用实时定量PCR方法(qRT- PCR)研究了该基因在茶树越冬芽休眠到萌发后不同阶段的表达模式.结果显示:(1)该基因全长1956 bp,包含1320 bp的开放阅读框(ORF),编码439个氨基酸残基.(2) CsCYC1预测分子量为49.35 kD,具有细胞周期蛋白家族典型的保守cyclin-box结构域和三维结构.(3)系统进化分析结果表明,CsCYC1的氨基酸序列与葡萄、蓖麻、毛果杨、琴叶鼠耳芥、拟南芥等的相似性分别为77％、74％、72％、68％和67％.(4)实时荧光定量PCR分析显示,CsCYC1基因在茶树越冬芽休眠期的表达量远低于恢复生长期,在萌发期表达量最高,说明该基因与茶树越冬芽休眠的解除关系密切.     

人牛精浆蛋白相关新基因的cDNA克隆、定位和表达

为了研究牛精浆 (bovineseminalplasma ,BSP)蛋白及其相关蛋白在受精及受精卵发育中的重要作用 ,寻找BSP蛋白相关新基因 .采用cDNA末端快速扩增 (RACE)技术 ,克隆了一个BSP蛋白相关基因的cDNA序列 .应用辐射杂种细胞系 (RH)技术进行了基因染色体定位 .通过RT PCR检测了该基因在人体各组织中的表达情况 .并将该基因编码的蛋白进行了原核表达 .新基因的cDNA长度为 10 5 2bp ,其开放阅读框架 (ORF)编码了一个含 2 2 3个氨基酸残基的蛋白质 ,氨基酸序列中含有 4个纤连蛋白Ⅱ结构域 ,与BSP蛋白在结构上具有一定的相似性 ,称其为人BSP相关蛋白 (humanBSP relatedproteins ,HBRP) .该基因定位于染色体 19q13,在大肠杆菌中表达为 5 2kD的融合蛋白 .研究结果提示 ,应用RACE方法克隆了一种新的人类与BSP蛋白相关的基因 ,推测其编码蛋白是与BSP蛋白功能相关的结合蛋白 ,通过基因重组技术大量获得表达蛋白 ,对进一步研究新蛋白的生物学功能具有重要的意义 .     

版纳微型猪近交系SRY基因编码区序列克隆及生物信息学分析

目的获得版纳微型猪近交系(BMI)SRY基因编码区序列并进行分子系统进化研究。方法以看家基因GAPDH为内参,对BMI猪的SRY基因编码区序列进行PCR扩增、克隆和序列分析,并应用Lasergene、Bi-oEdit、ClustalX、MEGA等生物信息学软件同鲸鱼、海豚、鹿、绵羊、牛、海豹、马、海象、熊猫、人、驴、熊、猫、虎和美洲豹等15个物种相应SRY编码区核苷酸序列和氨基酸序列进行了比对分析,在此基础上采用NJ和ME法对其编码区氨基酸序列构建了分子系统进化树。结果 BMI猪SRY基因编码区序列长711 bp,编码236个氨基酸,GenBank登录号为GU991615。BMI猪与鲸鱼、海豚、鹿、绵羊、牛、海豹、马、海象、熊猫、人、驴、熊、猫、虎和美洲豹的SRY基因编码区核苷酸序列相似性分别为83.7%、82.8%、78.4%、78.0%、76.9%、73.3%、73.1%、73.0%、72.9%、72.7%、72.7%、72.2%、71.6%、71.3%、70.8%,相应的氨基酸序列相似性分别为72.8%、54.5%、67.3%、64.5%、61.5%、61.9%、59.5%、61.4%、62.0%、59.1%、59.0%、62.0%、59.6%、59.6%、59.2%。结论 BMI猪同鲸鱼等15个物种的SRY基因编码区核苷酸和相应氨基酸序列具有较高的保守性。NJ和ME方法聚类构建的分子系统进化树表明,BMI猪与牛、绵羊、鹿聚为一个分支,符合分类学地位,它们分别为偶蹄目下的猪科、牛科和鹿科动物。     

辣椒ATP硫酸化酶基因（CaATPS1）的克隆与逆境表达

采用 RT-PCR和RACE方法,克隆了叶绿体ATP硫酸化酶基因的全长序列,命名为CaATPS1,GenBank 登录号为KX009745。该基因包含1个长为1 377 bp的完整开放阅读框,编码 458个氨基酸,预测分子量51.11 kD,等电点6.74。氨基酸同源性分析表明,该基因与 GenBank 中登录的茄科植物烟草、马铃薯及其它物种中的ATPS1氨基酸序列具有较高的同源性;进化树分析表明,辣椒CaATPS1与同为茄科属的烟草、马铃薯和胡麻属的芝麻处于同一进化分枝上,而与十字花科植物进化关系较远;荧光定量PCR分析显示,CaATPS1能被低温、干旱、高盐、机械损伤、过氧化氢、水杨酸、乙烯利以及DC3000侵染等各种胁迫和信号分子诱导。     

枸杞脱落酸生物合成关键酶基因NCED的克隆及表达分析

脱落酸(abscisic acid,ABA)对植物的生长发育具有独特的调控功能,并在植物适应逆境环境中发挥重要作用。9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是高等植物中ABA生物合成途径的一个关键酶。根据GenBank中的植物NCED基因的同源序列设计简并引物,通过RT-PCR及RACE技术从枸杞叶片中克隆到1个编码NCED的基因,命名为LbNCED。其cDNA全长为2316 bp,含有1个1824 bp的开放阅读框,编码1个含607氨基酸残基,分子量为67.38 kDa、等电点(pI)为6.43的假定蛋白,其氨基酸序列与番茄(Lycopersicon esculentum)和马铃薯(Solanum tuberosum)的同源性达90%,在N-末端具有1个含15个氨基酸的叶绿体转运肽。Southern杂交结果表明,该基因在枸杞基因组中以低拷贝形式存在。盐处理和脱水处理的枸杞叶片中LbNCED基因的表达与内源ABA的积累同步变化。