中国红豆杉紫杉烯合酶cDNA的分离、表达和鉴定

紫杉烯合酶是一种二萜环化酶 ,催化牛儿基牛儿基焦磷酸形成紫杉醇生物合成过程中的中间体紫杉烯。利用PCR扩增同源探针筛选cDNA文库 ,克隆了一个编码中国红豆杉 (Taxuschinensis (Pilg .)Rehd .)紫杉烯合酶 3′端的 2 15 1bp的cDNA片段 ,也通过PCR扩增得到了该基因 5′端的 6 11bp的cDNA片段 ,将这两个cDNA片段拼接在一起 ,得到长 2 712bp的cDNA片段 ,具有一个 2 5 86个碱基的开放阅读框架 (ORF) ,编码包括质体转移肽在内的共 86 2个氨基酸残基 ;该酶与太平洋红豆杉紫杉烯合酶有 97%的同源性 (identity) ,与其他植物萜类环化酶也有较高的同源性。利用融合表达载体pET_32a在大肠杆菌BL2 1trxB中表达 ,所表达的融合蛋白以包含体形式存在。包含体经过变性、复性和再折叠 ,利用His残基亲和凝胶柱层析得到融合的紫杉烯合酶。用毛细管气相色谱 质谱联用对酶促反应产物进行分析 ,结果表明 ,融合的紫杉烯合酶能催化产生 4(5 ) ,11(12 )_紫杉烯     

中国红豆杉愈伤组织紫杉烯合成酶cDNA片段的分离(简报)

从红豆杉的组织培养物中,筛选得到紫杉烷类化合物的高产株系,构建该株系的cDNA库,利用紫杉烯合成酶的特异性PCR引物对构建的cD－NA库进行PCR扩增,将得到的片段克隆后测序,该82bp片段与太平洋红豆杉紫杉烯合成酶相同片段完全一致。     

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶和紫杉二烯合酶基因在灰盖鬼伞中的组合表达

紫杉二烯是紫杉醇合成途径中的前体物质。紫杉醇是红豆杉的一种重要的次级代谢产物,是一种重要的新型抗癌药物。然而,紫杉醇在植物中含量低且难提取,限制了高效应用。利用基因工程手段,借助担子菌类真菌灰盖鬼伞具有的内源类异戊二烯合成途径,构建含有牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate,GGPP)合酶和紫杉二烯合酶的融合基因表达载体p Bg GGTS和独立表达盒表达载体p Bg GGg TS,并分别转入灰盖鬼伞LT2菌株中,经过选择性筛选、PCR鉴定、Southern blotting杂交验证,分别获得了5株融合表达的灰盖鬼伞工程菌和5株独立表达盒的灰盖鬼伞工程菌株。各随机挑选了1株工程菌株,分别提取菌丝体和发酵液分析。GC-MS分析表明,两种工程菌株与原出发菌株的菌丝提取物无明显差异峰,而与出发菌株的发酵液提取物相比,两种转基因灰盖鬼伞的发酵液中均出现了明显的差异峰,采用GC-MS特征质量离子分析方法判定为紫杉二烯,分别为44 ng/L(转化p Bg GGg TS)和30 ng/L(转化p Bg GGTS)。结果表明,通过在灰盖鬼伞融合基因或各自独立表达的形式共表达ggpps和ts基因,可以生物合成紫杉二烯。     

云南红豆杉紫杉烯合成酶基因克隆、序列分析与植物表达载体的构建

利用分段RT—PCR法成功地从云南红豆杉叶片总RNA中分离出两条长约1．4kb和1．5kb的cDNA片段,克隆到pUCm—T载体中,序列拼接分析表明,该cDNA片段与Wildung MR等发表的紫杉二烯合成酶基因编码区2586bp有41个核苷酸不同,同源性为98．42％,具有编码862个氨基酸蛋白质的能力．为了检测所克隆的基因编码产物是否具有活性,并进一步制备抗体以便于将来转基因植物的检测,构建了一个酵母表达载体GAPA-T14;为了转化植物构建了两个具有不同启动子的植物表达载体,pBI121-T14(含35S启动子)和pBIH-T14(在pBI121的基础上以胶乳特异启动子取代35S启动子)．     

紫杉醇合成代谢途径中紫杉烯合成酶cDNA的克隆

紫杉烯合成酶(Taxadienesynthase)被认为在紫杉醇合成代谢途径中起着限速酶的作用。为进一步研究紫杉烯合成酶的作用机理和紫杉醇生物合成代谢调控机制,采用RTPCR技术从东北红豆杉(Taxuscuspidata)愈伤组织中获得了紫杉烯合成酶基因片段,将该片段克隆在载体pGEMTEasyVector上,并转化到大肠杆菌JM109中,经EcoRI酶切检测,Southernblotting及部分cDNA序列分析证实该片段确为紫杉烯合成酶基因,与国外报道的从太平洋红豆杉(Taxus.brevifolia)幼茎中得到的紫杉烯合成酶基因序列具有很高的同源性。     

代谢工程酵母菌合成紫杉烯的研究

紫杉烯是紫杉醇生物合成的重要中间体,为在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中建立一个生物合成紫杉烯的代谢途径,克隆了酵母的羟甲基戊二酰CoA(3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme A,HMG-CoA)还原酶基因和=牛儿基=牛儿基二磷酸(geranylgeranyl diphosphate,GGDP)合酶基因,并构建了其融合表达载体pGBT9/HG;同时构建了包含紫杉烯合酶基因的表达载体pADH/TS;将这两个表达载体共转化酵母细胞,通过GC-MS分析检测工程酵母的代谢产物,结果表明获得的工程酵母能够合成紫杉烯,即在酵母细胞中建立了一个合成紫杉烯的代谢途径。     

中国红豆杉枝叶中的紫杉烷二萜

从中国红豆杉(Taxus chinensis)枝叶的乙醇提取物中分离得到8个紫杉烷二萜,通过波谱分析分别确定为：14p羟基巴卡亭Ⅵ(1),巴卡亭Ⅵ(2),巴卡亭Ⅳ(3),1β-去羟基巴卡亭Ⅳ(4),云南红豆杉酯甲(5),2α-去乙酰-2α-苯甲酰基-13α-乙酰基云南紫杉亭(6),5α-羟基-2α,7βp,9α,10β,13α-五乙酰氧基紫杉-4(20),11-二烯(7)和Taxaein(8)。其中化合物1为新化合物,并报道八个化合物在丙酮中测得的核磁共振信号,化合物8的数据属首次报道。     

利用运动红豆杉悬浮细胞生长紫杉醇和紫杉烷类化合物

云南红豆杉（Taxus yunnanensis Cheng et L.K.Fu）的一些株紫杉醇高产细胞系经过8年多的继代培养,仍保持较稳定的紫杉烷类化合物的生物合成能力。从此株紫杉醇高产细胞系的悬浮培养物中分离到8个紫杉烷类合物。经核磁共振光谱和质谱数据分析,它们的化学结构分别是2,5,10－三乙酰基－14－丙酰氧基紫杉二烯（1）、2,5,10－三酰氧基－14－（2′－甲基丙酰氧基）紫杉二烯（2）,2,5,10,14－四乙酰氧基紫杉二烯（3）、2,5,10－三乙酰氧基－14－（2′－甲基－3′－羟基丁酰氧基）紫杉二烯及其差向异构体（4和5）、巴卡亭Ⅳ（6）、巴卡亭Ⅲ（7）和紫杉醇（8）。化合物3、5－7为首次从云南红豆杉细胞培养物中分离到。定性分析表明,云南红豆杉细胞悬浮培养液中的化学成分与培养细胞中的相似。另外,此株紫杉高产细胞系的紫杉醇含量可达高0．3％,可用来进行大规模培养。     

云南红豆杉中紫杉醇和四种紫杉烷类化合物含量

云南红豆杉中紫杉醇和四种紫杉烷类化合物含量项伟张宏杰阮德春孙汉董（云南省林业科学院,昆明６５０２０４）（中国科学院昆明植物研究所,昆明６５０２０４）Ｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｔａｘｏｌａｎｄｏｔｈｅｒ４ｔａｘａｎｅｄｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓｉｎＴａｘｕｓｙｕ...     

紫杉醇生物合成酶的研究进展

抗癌药紫杉醇是具有萜类环状结构的天然次生代谢产物.研究紫杉醇生物合成酶,特别是其合成关键酶,将为利用基因工程手段大量生产紫杉醇打下基础.对紫杉醇生物合成过程中参与酶的研究进展作一综述.     

中国红豆杉羟化酶基因TcCYP725A22的克隆与功能研究

基于中国红豆杉( Taxus wallichiana var. chinensis (Pilger)Florin)转录组序列,从中扩增到1个新的P450羟化酶基因 TcCYP725A22 ,并对其进行了克隆、表达及功能分析。生物信息学分析结果显示:该基因编码区长1500 bp,共编码499个氨基酸;编码蛋白无信号肽,包含1个跨膜区,具有催化活性中心结构域。进一步将该基因在酿酒酵母WAT11 中进行异源表达功能研究,蛋白质免疫印迹(Western blot)实验结果表明,目的蛋白TcCYP725A22可在WAT11中成功表达;液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析结果显示,羟化酶TcCYP725A22对底物紫杉素表现出催化活性。依据质谱结果及反应底物紫杉素的分子结构,判断其催化产物可能为添加了2个羟基的紫杉烷新衍生物。     

中国红豆杉羟化酶基因TcCYP725A22的克隆与功能研究

基于中国红豆杉（Taxus wallichiana var.chinensis（Pilger） Florin）转录组序列,从中扩增到1个新的P450羟化酶基因TcCYP725A22,并对其进行了克隆、表达及功能分析。生物信息学分析结果显示：该基因编码区长1500 bp,共编码499个氨基酸;编码蛋白无信号肽,包含1个跨膜区,具有催化活性中心结构域。进一步将该基因在酿酒酵母WAT11中进行异源表达功能研究,蛋白质免疫印迹（Western blot）实验结果表明,目的蛋白TcCYP725A22可在WAT11中成功表达;液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析结果显示,羟化酶TcCYP725A22对底物紫杉素表现出催化活性。依据质谱结果及反应底物紫杉素的分子结构,判断其催化产物可能为添加了2个羟基的紫杉烷新衍生物。     

中国红豆杉中一个新的紫杉烷二萜

从中国红豆杉(Taxus chinensis)枝叶中分离得到4个紫杉烷二萜,通过波谱分析分别确定为：1β-羟基-2α,7β-二去乙酰基巴卡亭I(1),1β-羟基巴卡亭I(2),2α,5α,7β,9α,10β,13α-六乙酰氧基紫杉-4(20),11-二烯(3)和2-去乙酰氧基-5-去肉桂酰taxinine J(4)其中化合物1为新化合物。     

A New Farnesyl Diphosphate Synthase Gene from Taxus media Rehder： Cloning, Characterization and Functional Complementation

Farnesyl dlphosphate synthase （FPS; EC 2.5.1.10） catalyzes the production of 15-carbon farnesyl dlphosphate which Is a branch-point Intermediate for many terpenoids. This reaction Is considered to be a ratelimiting step In terpenold biosynthesis. Here we report for the first time the cloning of a new full-length cDNA encoding farnesyl dlphosphate synthase from a gymnosperm plant species, Taxus media Rehder, designated as TmFPS1. The full-length cDNA of TmFPS1 （GenBank accession number： AY461811） was 1 464 bp with a 1 056-bp open reading frame encoding a 351-amino acid polypeptlde with a calculated molecular weight of 40.3 kDa and a theoretical pl of 5.07. Biolnformatlc analysis revealed that TmFPS1 contained all five conserved domains of prenyltransferases, and showed homology to other FPSs of plant origin. Phylogenetlc analysis showed that farnesyl dlphosphate synthases can be divided Into two groups： one of prokaryotic origin and the other of eukaryotic origin. TmFPS1 was grouped with FPSs of plant origin. Homologybased structural modeling showed that TmFPS1 had the typical spatial structure of FPS, whose most prominent structural feature Is the arrangement of 13 core helices around a large central cavity In which the catalytic reaction takes place. Our blolnformatic analysis strongly suggests that TmFPS1 is a functional gene. Southern blot analysis revealed that TmFPS1 belongs to a small FPSgene family in T. media. Northern blot analysis indicated that TmFPS1 is expressed in all tested tissues, Including the needles, stems and roots of T. media. Subsequently, functional complementatlon with TmFPS1 in a FPS-deflclent mutant yeast demonstrated that TmFPS1 did encode farnesyl dlphosphate synthase, which rescued the yeast mutant. This study will be helpful In future Investigations aiming at understanding the detailed role of FPS In terpenold biosynthesis flux control at the molecular genetic level.     

曼地亚红豆杉植株中GGPP合成酶的克隆与分析

从 5年生曼地亚红豆杉 (Taxusmedia)的当年生新鲜枝叶中提取分离出mRNA ,然后根据已知植物的牛儿基牛儿基焦磷酸合成酶基因 (GGPPS基因 )DNA序列保守区设计特异简并引物。RT PCR获得了一条大小约 60 0bp的扩增谱带 ,回收该特异谱带并进行TA克隆 ,蓝白斑筛选 ,得到若干阳性克隆。经过质粒大小比较和PCR验证后 ,进行序列测定和同源性比较。发现该序列属于GGPP合成酶的片断 ,与Taxuscanadensis (AAD 1 60 1 8 1 )和Abiesgrandis (AAL1 761 4 2 )的GGPP合成酶相应区段的氨基酸序列一致性为 98%和 86%。蛋白质序列分析发现该序列含有一个特征的异戊二烯合成酶保守的结构域。进化树分析表明 ,曼地亚红豆杉GGPPS在进化上位于植物类 ,靠近古细菌类。曼地亚红豆杉GGPPS基因的克隆为研究红豆杉生产紫杉醇的分子机理和转基因植株的构建奠定了良好的基础。     

红豆杉细胞悬浮培养结构化数学模型的探讨

用１０Ｌ机械搅拌式生物反应器悬浮培养红豆杉细胞,得到细胞生长、基质消耗和紫杉醇合成动力学曲线。经过代谢动力学分析建立了结构化数学模型。并将模型值与实验值进行比较,结果表明模型预测值与实验值较吻合。