猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒三型、猪流感病毒三重RT-PCR检测方法建立及初步应用

【背景】猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒三型(porcine circovirus type III,PCV3)和猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)是3种影响猪只健康的重要呼吸道病原,对养猪业造成严重的经济损失,因此需要建立高效快速的检测方法,以了解3种病原在国内的流行情况。【目的】建立能同时检测PRRSV、PCV3和SIV的三重RT-PCR方法,为3种病毒的流行病学调查和疾病监控提供技术支持。【方法】针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),猪圆环病毒三型(PCV3),猪流感病毒(SIV)基因序列,分别设计3对特异性引物,扩增PRRSV M和N基因(436bp)、PCV3 Cap基因(619bp)和SIV M基因(199bp)。通过对退火温度和引物浓度优化建立三重RT-PCR检测方法,并对建立的多重检测方法进行特异性、敏感性、重复性试验验证。【结果】建立了能够同时快速检测PRRSV、PCV3、SIV的三重RT-PCR方法,而对猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type II,PCV2)、猪细小病毒2型(porcine parvovirus II,PPV2)、猪细小病毒3型(porcine parvovirus III,PPV3)和猪细环病毒1型(torque teno sus virus I,TTSuV1)等6种病原的扩增均为阴性,特异性较好。敏感性结果显示,同时检测PRRSV、PCV3、SIV这3种病原的检测下限为100copies/μL,批间与批内试验结果均一致。用该方法对黑龙江省部分地区猪场的67份临床病料进行检测,结果显示PRRSV阳性率为16.5%,PCV3阳性率为10.5%,SIV阳性率为10.5%,而且存在混合感染。【结论】该方法灵敏度高、特异性强,能够应用于临床样品检测,有效预测病原的流行情况。     

六种猪呼吸道RNA病毒MALDI-TOF MS同步检测体系的构建

【目的】建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)和猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)多目标检测方法,同时对SIV进行通用型、H1型及H3型分型检测。【方法】本研究根据6种病原体基因的保守序列,设计了6对加标引物及对应的延伸探针并进行单反应试验。通过体系优化引物浓度和反应条件,以及方法特异性、重复性及灵敏度分析,使用MALDI-TOF MS检测方法及荧光定量PCR方法分别对临床样本和猪源产制品进行检测,并对结果进行对比验证。【结果】质谱结果显示,6种产物峰仅在靶标病毒对应的产物位置出现峰...     

猪圆环病毒Ⅱ型的研究进展

猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus type2,PCV-2)是引起猪圆环病毒病(porcine circovirus desease,PCVD)的主要病原,在猪群中广泛存在。本病毒可以单独或者与其它病原混合感染猪只,引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、育肥猪皮炎与肾病综合征(PDNS)等一系列较为复杂的疾病,严重威胁猪只的健康。经过10余年持续不断的努力,各国对PCV-2的研究日益深入,对病毒的相关特性也有了较为清晰的认识。对病毒的病原学、流行病学、致病机理、临床症状、病理变化、诊断和防制对策等方面的研究进展进行了简要综述。     

Ⅱ型猪圆环病毒检测试剂盒的研制

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)属圆环病毒科圆环病毒属成员。PCV分两种血清型,即PCV-1和PCV-2,其中PCV-1由Tischer等于1974年检测到,对猪没有致病性;PCV-2可引起部分断奶仔猪和育肥猪的断奶仔猪多系统综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,     

非洲猪瘟病毒微滴数字PCR (ddPCR)方法的建立及应用

【目的】非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)能导致猪群高死亡率,从而造成严重的经济损失。因此,建立严密、高效的防控系统,包括灵敏、准确的诊断方法以及高效的预报预警机制等,以避免ASF传入我国。本文旨在建立一种新型而高灵敏度的ASFV微滴数字PCR(Droplet digital PCR,dd PCR)检测方法。【方法】针对ASFV K205R基因设计一对特异性引物和Taq Man探针,通过反应条件优化,建立了ASFV实时荧光定量PCR(q PCR)和dd PCR检测方法;并对两种方法的线性关系、灵敏性、特异性和重复性进行了评估,利用建立的ASFV检测方法对163份国内和进境的组织样本及血清样本进行检测,血清样本经商品化ASFV ELISA试剂盒复检,评估不同方法检测结果的符合率。【结果】建立的ASFV q PCR和dd PCR检测方法线性关系较好(R2≥0.998),dd PCR的最低检测限度可达到0.36拷贝,在20μL反应体系中约为10拷贝/反应,检测灵敏度是q PCR的10倍。ASFV dd PCR检测方法具有很高的特异性和重复性,不与其他猪常见病毒发生交叉反应。【结论】该方法灵敏度高、特异性强,可作为一种有效的分子生物学方法来诊断ASFV,为防止该病传入我国以及ASFV的实时监测提供新的技术储备,同时促进dd PCR技术在我国的发展和应用。     

四种常见猪肠道病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用

【背景】猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)是当前导致猪群发生病毒性腹泻的4种主要病原,并且常发生混合感染。【目的】建立一种可鉴别诊断这4种腹泻病毒病的检测方法,对于临床诊断具有重要意义。【方法】针对PEDV的M蛋白基因、TGEV的N蛋白基因、PDCoV的N蛋白基因和PoRV的VP7蛋白基因分别设计特异性引物,进而构建相应的重组质粒标准品。通过对PCR反应条件优化,建立可同时检测PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的多重RT-PCR检测方法。随后通过敏感性、特异性和重复性试验对该方法的有效性进行验证。【结果】敏感性试验结果显示,对PEDV-M、TGEV-N、PDCoV-N和PoRV-VP7重组质粒标准品的最低检测下限分别为1.75×10²、1.5×10³、1.6×10²和1.6×10²copies/μL;特异性试验结果显示,仅可检出本研究中的4种靶病毒,而猪群常见病毒CSFV、PRRSV、PCV2和PRV未能检出。重复性试验结果显示,选取10⁸、10⁶和10⁴copies/μL 3个不同浓度的重组质粒作为模板,其他条件不变,分别进行5次重复试验,5次试验均扩增出清晰、均匀的条带。对山东各地区送检的52份临床腹泻样品通过建立的四重RT-PCR方法进行检测,发现PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的阳性率分别为37%(19份)、6%(3份)、10%(5份)和25%(13份)。其中PEDV和PoRV混合感染2份(4%),PEDV和TGEV混合感染2份(4%),PEDV和PDCoV混合感染1份(2%)。通过单重RT-PCR对该多重RT-PCR临床样品检测结果进行重复验证,结果显示多重RT-PCR与常规单重RT-PCR结果符合率为100%。最后随机挑选5个检测为阳性的临床样本进行测序验证,结果均为相应病毒的基因片段。【结论】本研究建立了可同时检测PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的四重RT-PCR检测方法,研究结果为临床4种猪腹泻病毒病的鉴别诊断及流行病学调查提供了技术手段。     

鉴别检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失疫苗株的三重荧光PCR的建立

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)引起的猪的一种急性、高度接触性传染病.本研究根据ASFV B646L、MGF360-14L和CD2v基因设计了 3套引物和探针,建立了可同时鉴别检测ASFV野毒株和基因缺失疫苗株的三重荧光PCR方法.结果表明,该法特异性强,可同时检测ASFV B646L、MGF360-14L和CD2v基因,与猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、猪A型塞内卡病毒等无交叉反应;两份ASFV MGF360-505R与CD2v基因联合缺失疫苗株DNA三重荧光PCR法检测结果都仅出现一条B646L扩增曲线,与预期一致;灵敏度高,该法对重组质粒pUC-B646L、pUC-360-14L和pUC-CD2v的检出限分别为1.572×103拷贝/mL、1.934×103拷贝/mL 和 1.929×103拷贝/mL,灵敏度比世界动物卫生组织(World organization for animal health,OIE)推荐的荧光PCR高10倍;重复性好,对三种重组质粒检测的Ct值批内和批间变异系数均小于2％;应用该法及OIE推荐的荧光PCR对1 215份样品进行平行检测,结果显示23份样品为阳性,1 192份样品为阴性,两种方法检测结果一致.本研究建立的方法能鉴别检测ASFV野毒株和基因缺失疫苗株(缺失MGF360-505R和/或CD2v基因),对将来基因缺失疫苗的推广应用及ASF疫情防控具有重要的意义.     

疫苗原辅料中猪圆环病毒1型、2型和猪细小病毒PCR检测方法的建立及验证

目的 建立疫苗原辅料中猪圆环病毒1型(porcine circovirus type 1, PCV1)、2型(porcine circovirus type 2, PCV2)和猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)检测方法并进行验证。方法 根据NCBI公布的PCV1、PCV2和PPV基因序列设计了3对特异性引物,通过优化反应条件,建立起检测疫苗原辅料中PCV1、PCV2和PPV的PCR检测方法,并对方法的重复性、中间精密度、专属性、耐用性和检测限进行了验证。结果 PCR反应的退火温度为55℃,特异性引物浓度为10μmol/L。该方法重复性、中间精密度、专属性和耐用性均良好,对PCV1、PCV2、PPV的最低检测限分别为1 pg/μL、100 fg/μL和10 fg/μL。结论 PCR检测方法可以有效检测出疫苗原辅料中外源病毒污染情况,能为生产合格的疫苗提供质量保证。     

猪Ⅱ型圆环病毒四川分离株鉴定及其ORF2基因序列分析

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV),属于圆环病毒科(Circoviridae),圆环病毒属(Circovirus),血清型为PCV-1和PCV-2[1]。PCV-1首先由Tis-cher[2]于1974年从PK-15猪肾传代细胞系中分离获得,PCV-2首先由Clark[3]报道了是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,随即相继报道了PCV-2与PDNSS(猪皮炎与肾炎综合症)、NP(增生性坏死性肿炎)、PRDC(猪呼吸道综合征)、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦有重要关联[4,5];它常与猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)或猪细小病毒(PPV)并发感染或继发细菌感染[6]。我国自从2000年郎…     

猪Ⅱ型圆环病毒四川分离株鉴定及其ORF2基因序列分析

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV),属于圆环病毒科(Circoviridae),圆环病毒属(Circovirus),血清型为PCV-1和PCV-2[1].PCV-1首先由Tischer[2]于1974年从PK-15猪肾传代细胞系中分离获得,PCV-2首先由Clark[3]报道了是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,随即相继报道了PCV-2与PDNSS(猪皮炎与肾炎综合症)、NP(增生性坏死性肿炎)、PRDC(猪呼吸道综合征)、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦有重要关联[4,5];它常与猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)或猪细小病毒(PPV)并发感染或继发细菌感染[6].