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1.
结核分枝杆菌ESX-1分泌蛋白ESAT-6增强巨噬细胞吞噬功能   总被引:1,自引:0,他引:1  
【目的】研究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)分泌蛋白ESAT-6(early secreted antigenictarget of 6 kDa)对巨噬细胞吞噬功能的影响。【方法】用重组质粒pFLAG-ESAT-6和pFLAG-EGFP转染RAW264.7细胞,经G418筛选,PCR、RT-PCR和Western blot鉴定,获得稳定表达flag-ESAT-6和flag-EGFP的RAW细胞系,然后用流式细胞术观察各稳转细胞系吞噬荧光微球的能力,并用共聚焦显微镜和菌落计数法检测稳转细胞系吞噬大肠杆菌(Escherichia coli)的能力。【结果】获得了稳定表达flag-ESAT-6的RAW-E6细胞系和表达flag-EGFP的RAW-EGFP细胞系;流式细胞术检测结果表明RAW-E6吞噬荧光微球的能力显著强于野生型细胞系RAW264.7和对照细胞系RAW-EGFP;菌落计数和激光共聚焦分析表明RAW-E6细胞系吞噬E.coli的能力也显著强于RAW264.7和RAW-EGFP。【结论】通过胞内表达发现结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6能够增强巨噬细胞的吞噬功能,这将为深入理解结核分枝杆菌的致病机制提供新的思路。  相似文献   

2.
【背景】鱼类诺卡氏菌病潜伏期和病程较长,感染率和死亡率较高,给水产养殖业带来较大的经济损失,其病原鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是胞内寄生菌,侵入细胞后引起慢性感染是主要的致病机制。【目的】构建鰤诺卡氏菌侵染大口黑鲈(Micropterus salmoides)头肾巨噬细胞体外模型,观察鰤诺卡氏菌侵染巨噬细胞的过程并探究鰤诺卡氏菌对巨噬细胞的凋亡作用。【方法】采用密度梯度离心法分离巨噬细胞,通过特异性染色和PCR扩增巨噬细胞表达基因mpeg1对细胞进行鉴定,并通过CCK-8法和氧呼吸暴发活性测定检测巨噬细胞的活性;通过倒置荧光显微镜和流式细胞术观察侵染过程中细菌与细胞的形态与数量变化;通过双荧光流式细胞术检测、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放试验及线粒体膜电位检测,探究鰤诺卡氏菌对巨噬细胞的凋亡作用。【结果】从大口黑鲈头肾分离获得纯度高的巨噬细胞,经染色和PCR法鉴定为巨噬细胞;筛选出最优的体外培养条件为1640培养基+1%青霉素链霉素+1%胎牛血清。在脂多糖刺激后,巨噬细胞的氧呼吸暴发能力显著提高(P<0.05)。GFP-鰤诺卡氏菌侵染细胞2 h后细菌被细胞吞噬,4 h细胞变圆且贴壁率降低,6 h细菌大量繁殖并包围细胞,8 h后细胞大量死亡。凋亡相关实验结果表明,侵染初期巨噬细胞凋亡率增加,LDH释放增加,线粒体膜电位下降;随着侵染时间延长,细胞凋亡率下降、LDH释放量及线粒体膜电位下降减少,说明鰤诺卡氏菌对巨噬细胞起先促进后抑制凋亡的作用。【结论】通过密度梯度离心法成功分离大口黑鲈头肾巨噬细胞,并通过鰤诺卡氏菌侵染细胞后初步摸清鰤诺卡细菌在细胞水平的致病机理,建立了鰤诺卡氏菌侵染大口黑鲈头肾巨噬细胞的体外模型;证实了鰤诺卡氏菌可侵染巨噬细胞并抑制细胞凋亡,从而达到在巨噬细胞内存活,为进一步开展鰤诺卡氏菌与巨噬细胞相互作用并阐明鰤诺卡氏菌的致病机制奠定了研究基础。  相似文献   

3.
吴彬  叶青  李洋  李昌瑜  喻雪婧  周舒  王行国 《微生物学报》2010,50(11):1494-1502
【目的】通过磷脂酰胆碱(PC)阳性大肠杆菌菌株与磷脂酰乙醇胺(PE)阳性野生型和PE阴性突变型菌株比较,并用PC+PE+双阳性菌株佐证,从细菌形态、生理生化以及巨噬细胞对细菌的吞噬作用等方面探讨活体内磷脂酰胆碱能否替代磷脂酰乙醇胺。【方法】光学和电子显微镜观察细菌形态和结构;不同条件培养细菌并使用分光光度计测定OD600值,评估细菌的生长情况;使用SDS-PAGE和2-D电泳法测定细菌间质蛋白组分;用小鼠RAW264.7巨噬细胞系检测细菌的粘附和吞噬作用。【结果】与短棒状的PE+野生型细菌AD93/pDD72相比,PC+细菌AD93/ptac67中仍有25%丝状体;与PE-突变体AD93一样,PC+细菌AD93/ptac67仍需要添加二价离子Mg2+或Ca2+才能生长;与野生型AD93/pDD72相比,PC+细菌AD93/ptac67的周质蛋白组分、粘附率与相对吞噬效率呈现明显的差异;与野生型细菌Top10/ptac85相比,PE+PC+双阳性细菌Top10/ptac66的细胞壁外层、抗逆性和周质蛋白组分也显示差别。【结论】在活体内,膜磷脂中PC替代PE不能使PE-突变体细胞的功能完全恢复至野生型状态,PE和PC在功能上存在明显的差别,两者在功能上不能相互替代。  相似文献   

4.
【背景】双分子荧光互补(Bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)在水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)等微生物蛋白互作中的应用已有报道,但在工业菌株米曲霉(Aspergillus oryzae)中还未见应用。【目的】探究米曲霉中Fus3和Ste12蛋白在生长发育中可能存在的相互作用关系,建立在米曲霉活细胞中检测蛋白互作的方法,即BiFC体系。该系统可用于特异性、可视化米曲霉目标蛋白在活细胞中的定位,并且可以更加直观地探究蛋白之间是否存在相互作用。【方法】利用MultisiteGateway复杂载体构建技术,使用切开的绿色荧光蛋白,将荧光蛋白分子的两个片段N端和C端分别与米曲霉Fus3和Ste12蛋白融合,对获得的转化株进行荧光观察。通过BiFC系统检测蛋白之间的相互作用。【结果】成功转化的米曲霉菌丝中观察到荧光,Fus3和Ste12在米曲霉中存在相互作用。【结论】通过BiFC技术证实蛋白质Fus3和Ste12在无性繁殖菌株米曲霉体内发生互作,暗示它们通过互作可能参与除了有性生殖之外的其他细胞功能,并为米曲霉蛋白互作功能研究提供一种新的检测技术和方法。  相似文献   

5.
【目的】探究红球菌(Rhodococcus sp.)R04膜蛋白RHOGL009301的生理功能和突变菌株的代谢特性,确定该膜蛋白的生理功能与苯甲酸转运的关系。【方法】将RHOGL009301基因与绿色荧光蛋白基因在Rhodococcus erythropolis进行融合表达,Delta Vision观察该基因蛋白产物的定位。通过基因同源重组敲除RHOGL009301基因,并对比野生型菌株和缺陷型菌株在不同碳源培养下的生长情况。HPLC测定红球菌R04野生型菌株和缺陷型菌株代谢联苯和苯甲酸时细胞内外代谢物,分析不同生长条件下代谢物的浓度变化。【结果】RHOGL009301基因与绿色荧光蛋白基因在Rhodococcus erythropolis中实现共表达,并定位在细胞膜上。获得了RHOGL009301基因的缺陷型菌株R04ΔMP,与野生型菌株相比,缺陷型菌株在联苯和苯甲酸培养条件下的生物量明显降低,生长速度减慢。HPLC分析表明RHOGL009301基因的缺失抑制了苯甲酸的转运。【结论】膜蛋白RHOGL009301是苯甲酸代谢和转运相关的蛋白,基于序列同源性分析,该膜蛋白是一种新型的苯甲酸转运蛋白。  相似文献   

6.
【目的】探究慢生型花生根瘤菌Ⅲ型分泌系统在花生-根瘤菌互作的功能。【方法】本研究采用同源重组和三亲本接合转移的方法,构建Bradyrhizobium sp. MZ5的Ⅲ型分泌系统调节基因ttsI突变体;荧光定量PCR检测添加大豆苷元(Daidzein)和染料木黄酮(Genistein)诱导物后野生型和突变株转录水平上ttsI的表达量变化及其差异;蛭石结瘤实验分析ttsI基因突变对花生结瘤能力的影响。【结果】在转录水平上,大豆苷元和染料木黄酮对MZ5的Ⅲ型分泌系统调节基因ttsI的表达具有显著的抑制作用(P0.05)。在MZ5△ttsI突变体中ttsI基因的表达量都明显下调,与野生型菌株的相比都达到极显著水平(P0.001)。蛭石结瘤实验表明,与野生型菌株相比,MZ5△ttsI突变体在不同花生品种的结瘤数和地上部干重都显著性降低。根瘤石蜡切片表明,MZ5△ttsI突变体在根瘤内的含菌量少于野生型菌株。【结论】Bradyrhizobium sp. MZ5菌株中的Ⅲ型分泌系统在花生-根瘤菌互作中对结瘤有积极的促进作用。  相似文献   

7.
【背景】AMP-17是从微生物诱导的家蝇转录组数据库筛选到的一条特异性高表达基因,采用原核表达体系获得其重组蛋白并证实了具有显著的抗菌效果,特别是对白色念珠菌具有较强的抗菌活性。【目的】研究抗菌肽AMP-17对白色念珠菌菌丝的抑制作用。【方法】采用微量液体稀释法测定AMP-17对11株白色念珠菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC);根据对AMP-17的敏感程度选取3株绘制生长曲线;通过光学显微镜观察并计数经AMP-17作用后白色念珠菌芽生孢子生成率及芽管形成率;倒置荧光显微镜观察白色念珠菌酵母相向菌丝相转化及以菌丝相为起点AMP-17促进菌丝相转化为酵母相的情况。【结果】AMP-17对支气管肺泡灌洗液分离株16105的MIC为10μg/mL,对粪便分离株16214的MIC为40μg/mL,对其余9株白色念珠菌的MIC均为20μg/mL;白色念珠菌经不同浓度的AMP-17作用后,各时间点的芽生孢子生成率均显著低于对照组,尤其是40μg/mL的AMP-17组,芽生孢子生成率仅15%,显著低于阳性药物氟康唑;各实验组芽管形成率显著低于对照...  相似文献   

8.
【目的】为了给外源蛋白在酿酒酵母细胞中的定位提供参考,构建酿酒酵母荧光定位报告菌株。【方法】运用染色体同源重组的方法,将突变的、已进行酵母表达优化的红色荧光蛋白RedStar分别整合到12个酵母细胞器标记蛋白的C端,与之进行融合表达,用特异性引物对每一个酵母荧光定位报告菌株进行PCR扩增和测序验证,用激光共聚焦显微镜进行荧光检测,对线粒体和细胞核进行特异性染料染色,用EGFP标记沙门氏菌已知定位蛋白SipA,与构建的相应荧光定位报告菌株进行共定位。【结果】构建的酿酒酵母荧光定位报告菌株可分别标示酵母细胞的肌动蛋白、晚期胞内体、细胞核、核周质、纺锤体、线粒体、过氧化物酶体、脂滴、初级内吞体、次级内吞体、高尔基体顺面及高尔基体反面。PCR扩增及测序验证、荧光检测、染料与相应报告菌株的共定位、已知定位蛋白SipA与相应报告菌株的共定位均提示报告菌株构建成功。【结论】这些报告菌株的构建,为日后在酵母中观察细胞器动态变化,以及未知蛋白在酵母中的定位提供了基础性工具。  相似文献   

9.
【目的】为能实时直观了解嗜肺军团菌感染细胞的过程,研究细菌在细胞内的变化及其与宿主细胞间的相互作用关系。【方法】通过基因敲除、克隆回补等重组构建绿色荧光蛋白(GFP)稳定高表达的嗜肺军团菌株,利用该菌株建立小鼠巨噬细胞Raw264.7的感染模型。【结果】通过荧光显微镜可实时观察细菌感染细胞的全过程,包括细菌在细胞内的形态变化、增殖和裂解宿主细胞等。【结论】重组菌可替代野生菌株在细胞感染中应用,为直观研究嗜肺军团菌与被感染细胞之间的相互作用关系,以及进行相关药物模型的制备、药物筛选、耐药机制研究等提供了新的手段。  相似文献   

10.
目的:在金黄色葡萄球菌中分别构建RNaseHⅠ、RNaseHⅡ和RNaseHⅢ的突变菌株,并研究它们在金黄色葡萄球菌中的生物学功能。方法:利用同源重组的方法在金黄色葡萄球菌中分别构建RNaseHⅠ、RNaseHⅡ和RNaseHⅢ的插入突变菌株,检测突变株生长速度、溶血活性及外分泌蛋白表达水平与野生型的差异,进一步通过流式细胞术检测突变株外分泌蛋白细胞毒性的改变,同时在体外检测突变株在全血中的存活能力。结果:构建了金黄色葡萄球菌RNaseHⅠ、RNaseHⅡ和RNaseHⅢ的插入突变菌株;表型检测结果显示,与野生型菌株相比,3种突变株的生长速度减慢,溶血素和外分泌蛋白明显减少;流式细胞术检测结果显示3种突变株毒性比野生型菌株减弱;全血杀伤实验结果显示3种突变株在全血中的存活率低于野生型菌株。结论:RNaseHⅠ、RNaseHⅡ和RNaseHⅢ在金黄色葡萄球菌生长繁殖、毒素产生和侵袭机体的过程中有重要作用,它们可能与金黄色葡萄球菌的致病性相关。  相似文献   

11.
刘胡林  徐兴然  凌开建  邹祥 《微生物学报》2022,62(11):4141-4154
【目的】分离筛选人阴道环境中具有益生特性的乳酸杆菌,探索外阴阴道假丝酵母病的益生菌疗法。【方法】利用含1%碳酸钙的de Man,Rogosa and Sharpe (MRS)培养基从无症状育龄女性阴道分泌物中分离乳酸杆菌,采用共培养方法评价其对白色念珠菌(Candida albicans)的抑制作用,通过对乳酸杆菌的耐酸性能、体外聚集特性和黏附能力测试考察其益生特性,并进行乳酸杆菌株功能化组合。通过构建小鼠外阴阴道假丝酵母病模型,初步探索乳酸杆菌株组合对C. albicans的抑制作用。【结果】从53个样品中分离得到19株乳酸杆菌,筛选获得4株乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus ZH08、L. fermentumZH09、L. fermentum ZH11和L. crispatus ZH17)具有较强抑制C. albicans生长的能力。4株乳酸杆菌均能耐受低pH环境,能快速降低培养液pH。其中2株L. fermentum具有更强的抑制活性,能在24 h内快速抑制C. albicans生长,抑制率可达到95%以上;另2株L. crispatus具有更强的聚集特性和...  相似文献   

12.
[目的]对灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的细胞核和过氧化物酶体进行荧光蛋白标记,为研究其生长发育和侵染过程中细胞结构和细胞器动态提供基础.[方法]以绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(DsRED、mCherry)为报告基因,利用根癌农杆菌介导转化(Agrobacterium tumefaciens m...  相似文献   

13.
【背景】烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)引起的烟草黑胫病(tobacco black shank)是烤烟生产上重要的土传根茎病害之一,生产上防治困难。【目的】筛选对病原菌具有强拮抗能力的有益微生物菌株是开展生物防治的基础。【方法】采用平板对峙法筛选对烟草疫霉具有拮抗作用的枝穗霉菌株。根据枝穗霉在烟草疫霉菌落上的覆盖程度和产孢量,以及对烟草疫霉菌丝、孢囊梗和孢子囊的缠绕情况,将枝穗霉的拮抗能力划分为强、中等、弱和无4个等级。【结果】供试8种65株枝穗霉中,6株具有强拮抗能力、27株具有中等拮抗能力、22株具有弱拮抗能力、10株无拮抗能力;不同枝穗霉菌株对烟草疫霉的抑制率大小为20.0%-86.7%。【结论】粉红枝穗霉(Clonostachys rosea)菌株7901、11361和亚麻生枝穗霉(C. byssicola)5072、6729、7507及条孢枝穗霉(C. grammicospora)6730对烟草疫霉具有强拮抗能力,这为后续盆栽试验及作用机理研究等提供了种质资源。  相似文献   

14.
【目的】通过实验室培养模拟自然环境微生物相互作用,进而找到影响细菌基因型和表型的基因。【方法】将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在实验室条件下进行单独培养和两两混合培养并连续转接,通过得到的数量表型与最大生长速率表型做全基因组关联分析(GWAS),对得到的与表型相关的SNP进行注释与分析。【结果】162个SNP位点影响到大肠杆菌原始菌株与共培养菌株的生长,36个SNP位点影响大肠杆菌菌株在单独培养和共同培养的生长。总共有85个SNP位点影响金黄色葡萄球菌的原始菌株与单独培养。其中5个基因在之前文献中已有报道。对影响不同时间点细菌数量变化形状的SNP位点进行功能注释,大肠杆菌中有706个与生长性能相关。金黄色葡萄球菌中,129个和不同的生长性能相关。大肠杆菌SNP位点的13个基因在之前的研究中已有报道。【结论】混合培养和单独培养都检测到与生长相关的显著基因,本研究表明了GWAS在研究细菌互作进化机制方面的潜力。  相似文献   

15.
【目的】利用一个GFP的超折叠变体SfGFP(superfolder GFP)对瓦雷兹芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FZB42菌株进行标记,以期确立一种瓦雷兹芽孢杆菌及近缘芽孢杆菌通用的高亮GFP标记手段,同时,为了方便后续生物膜和分子互作的相关研究,测试SfGFP基因插入位点,假基因xkdB,作为外源基因表达座位的可行性。【方法】利用基因工程技术构建了一系列质粒,然后通过同源重组的方式,分别获得xkdB敲除菌株FBS373和SfGFP标记菌株FBS374,分别测试这些菌株在生长速度、碳源利用、荧光亮度、生物膜形成、swarming运动性等方面的差异。【结果】本研究成功构建了SfGFP标记的瓦雷兹芽孢杆菌FZB42,其荧光亮度是gfp+变体标记菌株的5倍以上;xkdB基因敲除对瓦雷兹芽孢杆菌FZB42生长速度、不同碳源利用、生物膜形成和运动性等方面无明显影响。【结论】通过本研究我们确认了xkdB基因位点作为瓦雷兹芽孢杆菌FZB42基因组上外源基因表达的中性位点的可行性,同时,通过在xkdB基因座位表达了SfGFP基因,成功对FZB42进行了高亮标记,对同类菌株的标记...  相似文献   

16.
【目的】研究小檗碱对新生隐球菌的抗菌活性及其作用机制。【方法】采用微量肉汤稀释法测定小檗碱对新生隐球菌标准菌株和临床分离菌株的最小抑菌浓度,通过棋盘法测定小檗碱与氟康唑、两性霉素B的协同作用,测定小檗碱对隐球菌重要毒力因子的表达,以及对巨噬细胞和隐球菌互作的影响,采用隐球菌感染大蜡螟模型测定小檗碱的体内杀菌活性。【结果】小檗碱是一种杀真菌化合物,在测试的菌株中,最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)范围为8-16μg/mL。亚致死剂量小檗碱能够抑制隐球菌荚膜大小、产黑色素能力和有性生殖能力,并能增强巨噬细胞的杀菌能力。锌指转录因子Nrg1介导了上述重要的过程。在隐球菌感染动物模型中,小檗碱能够延长感染大蜡螟的存活时间。【结论】小檗碱在体内外具有优异的抗隐球菌活性,有望作为抗隐球菌药物开发的起始化合物。  相似文献   

17.
【背景】功能作图(functionalmapping)模型是基于统计方法的分析生物体动态复杂性状发育的全基因组作图方法,旨在定位性状发育过程中的数量性状位点(quantitative trait loci, QTL),将功能作图应用于微生物研究有助于解析复杂的互作过程。【目的】利用功能作图定位两种微生物在动态生长发育过程中发挥显著作用的QTL,通过基因功能注释找到影响微生物表型生长的基因。【方法】将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各100个菌株单独培养和一一配对共同培养,将取得的各菌株生长丰度表型数据和单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)数据进行关联分析,找到同一物种在不同培养条件下对生长起作用的显著QTL。【结果】通过功能作图分析,在大肠杆菌中定位到217个QTL,金黄色葡萄球菌中定位到152个QTL;通过功能聚类和基因注释分析发现,QTL所在候选基因中金黄色葡萄球菌scdA、sdrC、sdrD、ftsA和大肠杆菌phr、nagC、eptA、ppsA、priA、flim基因对微生物的生长发挥了较大作用。【结论】本文借助功能作图定位了大肠杆菌和金黄...  相似文献   

18.
【目的】筛选辣椒(Capsicum annuum L.)根腐病防病促生细菌并明确其防病促生效应。【方法】采集健康辣椒根围土壤样品,以辣椒根腐病病原真菌茄镰孢(Fusarium solani)和尖镰孢(Fusarium oxysporum)为指示菌,采用平板对峙法筛选生防细菌,采用选择性培养基筛选溶无机磷、溶有机磷、固氮菌和解钾菌等促生菌,钼锑抗比色法测定溶磷量,凯氏定氮法测定固氮量,火焰原子吸收光谱法测定解钾量。对特性良好组合的菌株进行16S rDNA序列分析鉴定并制作菌剂,最后采用盆栽法测定菌剂防病促生效果。【结果】共筛选得到323株特性良好的功能菌株,拮抗菌78株,溶有机磷菌87株,溶无机磷菌107株,固氮菌128株,解钾菌123株,部分菌株同时具有多个功能特性。互作组合得到6个特性良好的菌株组合,包括8株功能菌株,鉴定发现XP271和XP181为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis),XP125为特基拉芽胞杆菌(Bacillus tequilensis),XP236为耐盐芽胞杆菌(Bacillus halotolerans),XP79为巨大芽胞杆菌(Bacillus ...  相似文献   

19.
[目的]研究在体外情况下和厚朴酚对白色念珠菌的抑制作用及其可能机制。[方法]采用微量稀释法测定和厚朴酚对白色念珠菌的最低抑菌浓度(MIC80)和最低杀菌浓度(MFC);用透射电镜观察不同浓度和厚朴酚对白色念珠菌超微结构的影响;采用Annexin V-FITC/PI染色法分析不同浓度和厚朴酚对白色念珠菌细胞凋亡的影响;用DCFH-DA染色法测定不同浓度和厚朴酚对白色念珠菌细胞内活性氧积累的影响;用JC-1染色法分析不同浓度和厚朴酚对白色念珠菌线粒体膜电位的影响;用碘化丙啶染色、考马斯亮蓝G-250染色检测和厚朴酚对白色念珠菌细胞膜通透性的影响;通过测定加入麦角甾醇后,和厚朴酚对白色念珠菌的抑制作用的变化,检测和厚朴酚对白色念珠菌细胞膜的影响。[结果]和厚朴酚对白色念珠菌具有很强的抑制作用,MIC和MFC分别为16 μg/mL和32 μg/mL。对白色念珠菌细胞壁、细胞膜和胞浆均有明显的影响。和厚朴酚是通过增加活性氧的产生和破坏线粒体功能来诱导白念珠菌的细胞凋亡和坏死。它也影响细胞膜的通透性,这可能和细胞壁的破坏和与麦角固醇的结合有关。[结论]和厚朴酚通过产生活性氧并伴随着一系列的细胞损伤这种复杂的机制从而对白色念珠菌产生抑制作用,使和厚朴酚成为一种潜在的抗真菌药物。  相似文献   

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