EPO,EPOR及其信号传递研究进展

EPO(Erythropoietin,促红细胞生成素)是促进哺乳动物红系祖细胞增殖和分化的主要细胞团子。EPO与红系祖细胞表面的EPOR(EPO Receptor)结合后,通过信号传递使细胞核内特定基因转录发生改变。与其它造血生长因子不同,EPO主要作用于相对成熟的红系细胞。近年来,随着对人和动物的EPOR分子克隆以及EPOR突变体分析,使我们对EPO与EPOR的相互作用及其信号传递路径有了比较深入的了解。     

自制的人尿红细胞生成素活力测定 Ⅰ、多血小鼠红细胞~(59)Fe掺入法

红细胞生成素(Erythropoietin,以下简称EPO)是高等动物及人类造血活动中一个十分重要的生理调节因子。在临床研究中,EPO活力测定有助于对各种原因引起的贫血或多血症的鉴别诊断;在红系造血祖细胞体外培养研究中,EPO是一个不可缺少的刺激因子。因此EPO活力测试在临床血液病和实验血液学研究中都是一个重要的、有应用价值的研究课题。     

促红细胞生成素在酿酒酵母中的表达

促红细胞生成素(EPO)是一种特异刺激红系祖细胞向功能成熟的红细胞增殖分化的造血生长因子。重组人EPO(rhEPO)应用于临床治疗多种红细胞减少症取得了确切疗效。 酿酒酵母是迄今研究最为深入的真核生物之一,其遗传背景清楚,由此衍生的各种载体宿主菌表达系统较大肠杆菌载体宿主表达系统有更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力;因其较哺乳动物细胞系统     

促红细胞生成素的纯化

促红细胞生成素(Erythropoitm,EPO)是一种糖蛋白激素,正常条件下在血浆中浓度很低,当贫血或缺氧时,血浆中EPO浓度显著增加,并分泌到尿液里、EPO具有促进红系祖细胞的增殖、分化和成熟的作用,正是这一特性使它在某些贫血治疗中有着重要价值。为了研究EPO性状及临床应用,获得大量纯品EPO非常重要,1977年Miyake等人首先经过7步纯化从再障性贫血患者尿中获得毫克量级尿EPO(urme EPO,uEPO)。天然EPO源于正常人及患者尿液、血浆和胎盘浸出液。八十年代后朗编码人EPO基因被克隆,重组人EPO(recombinant human EPO,rhEPO)在哺乳动物细胞中成功表达,大大丰富了EPO来源,减小了纯化难度,使获得大量EPO纯品用于临     

人红细胞生成素的分离、纯化及鉴定

 用自制的苯基-琼脂糖CL-4B和羟基邻灰石等层析材料,从再生障碍性贫血病人尿中分离、纯化制得了红细胞生成素(EPO)。用多血小鼠红细胞~(56)Fe参入法测定该制品在体内的生物活力。用小鼠与人骨髓红系祖细胞培养法测其在体外的生物活力。实验结果说明,我们自制的EPO制品,不仅能用于动物,也能用于人骨贿红系祖细胞的培养。用Azocoll法测该制品中蛋白水解酶活力为阴性。     

促红细胞生成素基因修饰的胎肝基质细胞促进脐血CD34 +细胞向红系分化

通过重组慢病毒系统感染人胎肝基质细胞(fetal liver stromal cells,FLSCs),建立了能够稳定高效表达促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)的细胞株EPO/FLSCs.从胎儿肝脏克隆EPO基因,构建重组慢病毒EPO的表达载体,感染FLSCs,根据荧光表达强弱进行流式分选,获得能够继续稳定传代的高表达EPO基因的FLSCs,RT-PCR和ELISA结果证实,细胞株中的EPO基因稳定表达.RT-PCR结果显示,FLSCs的EPO在mRNA水平的表达分别是未转染FLSCs和转染空载体FLSCs的5.63倍和5.71倍.ELISA法检测了转染重组慢病毒EPO表达载体的FLSCs EPO蛋白表达水平,结果显示EPO蛋白的表达水平也明显升高.收集EPO/FLSCs的条件培养基,体外诱导脐血CD34+细胞向造血细胞分化,结果显示向红系定向分化的细胞比例明显居多,有可能为临床细胞治疗提供稳定、高质量的细胞来源.     

血小板、红细胞生成素双功能融合蛋白的构建

为探索TPO- EPO融合蛋白在肿瘤化疗中作为辅助治疗药物 ,同时纠正红细胞贫血和血小板减少症的可能性 ,首先通过PCR分别扩增了TPON -端 1 5 3肽和EPO成熟肽的编码cDNA ,并构建成功TPO -EPO融合基因 .融合基因在COS- 7细胞和CHO细胞中的表达产物能够维持TPO依赖株Ba/F3 mpl细胞和EPO依赖株Bet -2细胞的生长 ,能够在半固体培养体系中刺激巨核系集落和红系集落的形成 ,表明它同时具有TPO和EPO的生物活性 .初步体内实验表明 ,含有融合蛋白的培养上清可以使小鼠血小板数目升高 40 % ,对红细胞的作用有待进一步确定 .以上结果初步表明融合蛋白构建成功 ,为进一步探讨融合蛋白的体内活性和应用前景打下了基础 .     

脐带血造血干/祖细胞体外分化为不同阶段红系祖细胞的动力学观察

目的:探讨体外培养脐带血单个核细胞定向诱导分化为不同阶段红系祖细胞的动力学变化情况。方法:用0.5%甲基纤维素沉降脐带血红细胞及人淋巴细胞分离液密度梯度离心法得到单个核细胞,在含EPO、SCF、IGF-1等细胞因子的无血清培养体系中诱导其定向分化为红系祖细胞,观察细胞增殖、存活率、细胞集落形成情况,并检测不同阶段细胞红系特异性表面标志CD71和CD235a的表达。结果:随着培养时间的延长,细胞数逐渐增多,14 d细胞可扩增140倍左右,收集诱导后的细胞进行瑞氏吉姆萨染色,可见大量红系祖细胞,诱导后的细胞集落形成能力强,形成的克隆大部分为红系集落。诱导过程中,14 d前CD71、CD235a的表达逐渐增高。按细胞表面标志表达的不同可将诱导的细胞分为4群,分别对应红系祖细胞的不同阶段;随着诱导天数的增加,各时间点细胞对应的早期红系祖细胞群(P2、P3)比例逐渐下降,中晚期红系祖细胞群(P4、P5)的比例逐渐上升。结论:无血清培养基添加细胞因子组合的红系诱导培养体系可较好地诱导扩增红系祖细胞,流式分选可获得相对均一而处于不同分化阶段的红系祖细胞群体。获得了红系祖细胞体外分化的动力学数据,为今后进一步优化红系诱导分化体系获得均一的红系祖细胞奠定了基础,并对未来利用干细胞制备均一的红系祖细胞应用于临床治疗有一定的指导作用。     

miR-24通过靶基因Sp1调控β-类珠蛋白表达

为了研究miR-24对于珠蛋白表达的调控作用,并明确其作用机制.首先采用定量PCR的方法确定miR-24在红系分化过程中的表达变化情况,以及miR-24过表达后珠蛋白的表达变化情况.进而通过报告基因实验以及Western blotting的方法确定miR-24的靶基因.通过表型回复实验证明miR-24是否通过靶基因调控珠蛋白的表达.结果发现在hemin诱导的K562细胞以及EPO诱导的造血干/祖细胞向红系分化过程中,miR-24表达上调,在K562细胞中过表达miR-24可以促进红系分化过程中ε-和γ-珠蛋白的表达上调,进一步的研究表明miR-24是通过靶基因Sp1来行使对珠蛋白的调控作用的.以上结果表明miR-24通过负调节其靶基因Sp1促进红系分化过程中珠蛋白的表达上调.     

人促红细胞生成素基因在家蚕体中的高效表达

人促红细胞生成素(EPO)是一种调控红系干细胞增殖、分化和成熟的糖蛋白激素。将合成的EPO cDNA插入杆状病毒转移载体pBlueBacⅢ,使其置于Ph基因强启动子控制之下,获得了转移载体pBlueBacEPO。将pBlueBacEPO DNA与野生型BmNPV DNA共转染BmN细胞,经空斑纯化,获插入EPO cDNA的重组病毒rBmNPVEPO。经Sonthern杂交和PCR扩增鉴定证明人EPO基因已正确组建于BmNPV的预定位置。将重组病毒rBmNPVEPO穿刺接种5龄幼虫和蛹,收集感染第3～5d的幼虫血淋巴和3～6.5d蛹血淋巴。用ELISA检测幼虫血淋巴中EPO表达量高达62800u/mL,蛹血淋巴中表达量达74000u/mL。Western blot结果显示幼虫血淋巴和蛹血淋巴均有一条明显的免疫杂交带,分子量均约为26kD。用TF1细胞对幼虫表达产物进行了生物活性测定,每毫升血淋巴中EPO活性约为63000u。     

动态

东京大学医科学研究所细菌感染研究部的土屋辉昌发现了贫血状态的小鼠肝脏能诱导结合于造血因子EPO基因上游部位的蛋白,在4月京都召开的日本血液学会上发表这一结果。EPO是促进红细胞增殖的细胞激肽之一。该蛋白在肾脏内处于低氧状态时刺激EPO基因的转录,可促进红细胞的恢复。为研制在活体内使用的氧传感器开辟了途径。据土屋介绍在小鼠正常状态下的肾脏中至少存在着3种EPO上游基因结合蛋白,但是,苯肼会引起     

不同发育阶段红系造血细胞的生物力学特性和血液流变特性的变化

用可诱发小鼠贫血的病毒(anemia-inducing strain friend’s virus, FVA)感染BALB/c小鼠, 15 d后取其脾脏, 分离出原红细胞, 在加促红细胞生成素(EPO)等的培养基中培养12, 24, 48 h, 获得大量相对同步化的早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞, 研究了不同发育阶段的上述早期红系造血细胞的生物力学及血液流变学特性的变化规律. 发现不同发育阶段的早期红系造血细胞, 随着发育其电泳率、渗透脆性、膜的流动性和黏弹性都发生了改变, 这种改变与膜脂的组成、膜蛋白、细胞膜的骨架蛋白、脂质分子与蛋白质分子的相互作用有关.     

地塞米松诱导红系细胞凋亡的观察

正常机体内,红细胞生成素（EPO）诱导红系细胞分化,并阻止其凋亡,使其维持机体所需足够的数量。本文采用诱导贫血病毒（FVA）诱导BALB／c小鼠脾细胞所形成的红细胞实验系统,研究了外界因子－地塞米松（Dex）对EPO作用的影响。取6－8周雌性BALB／c小鼠,尾部静脉注射含FVA的小鼠血清。15天后,断颈处死,取脾于IMDM中漂洗、剪碎、过滤、离心、制成单细胞悬液,在EPO存在下,于平皿中培养至不同的时期后,进行不同浓度、不同时间的Dex处理。取细胞进行：（1）台盼蓝染色计数死细胞数;（2）观察DNA电泳图谱;（3）电镜检察细胞学变化。Fig.1表明：随着Dex处理浓度和时间的增加,细胞死亡率也增加。Fig.2表明：10^-4浓度Dex处理,即可使早（12h）、中（24h）幼期红细胞凋亡,DNA断裂成多聚核小体,产生明显DNA梯形带。Fig.3表明：高浓度Dex可以使早期幼期红细胞凋亡。电镜观察表明：与对照（Fig.4)比较,Dex处理后,细胞核固缩,染色质沿核膜内面周边凝聚,核周间隙扩张,胞质内出现空泡（Fig.5);随后细胞破碎,出现大量凋亡小体（Fig.6),Dex拮抗EPO,诱导红系细胞凋亡的现象此前未见报导。这对深入认识Dex作用机理,指导临床具有重要意义。     

EPO治疗慢性肾衰患者对铁调素、FDP及红细胞免疫的影响

为了探讨促红细胞生成素(EPO)治疗慢性肾衰患者对铁调素、纤维蛋白原降解产物(FDP)及红细胞免疫水平的影响。选取我院2014年1月至2016年1月间收治的30例规律使用EPO治疗的肾功能不全肾衰期患者作为研究对象进行自身对照研究,患者使用EPO治疗12周,分别于治疗前、治疗后检测并比较血清铁调素、FDP、红细胞免疫水平等指标。研究显示,相较于治疗前,30例患者接受治疗后血清中的RBC、Hb、TRF、PA、血清铁和RBC-C3b RR比例均发生显著性提高,差异具有统计学意义(p0.05);而hs-CRP、FDP、铁调素水平以及RBC-ICR比例发生显著性降低,差异具有统计学意义(p0.05);但血清中Scr水平无明显变化,差异不具有统计学意义(p0.05)。因此,EPO治疗慢性肾衰患者能通过调节血清铁调素水平纠正肾性贫血,同时改善患者的红细胞免疫功能及营养状态。     

红细胞生成素cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达

将(?)红细胞生成素(EPO)cDNA构建的重组表达质粒用电穿孔法引入COS-7细胞,ELISA和红系集落测活结果表明,该重组质粒在哺乳动物细胞中能够表达有生物活性的红细胞生成素。进一步将其转染CHO-dhfr~-细胞,经氨甲喋呤(MTX)加压扩增,混合细胞中各克隆表达水平比较一致,细胞的平均表达水平为2-3μg/10~6 Cells/24hr。细胞冻存后复苏其表达水平与冻存前一致,表明外源基因整合稳定。     

大剂量rHuEPO治疗肾性贫血的临床研究

目的:探讨应用大剂量重组人促红细胞生成素(rnuEPO)治疗肾性贫血的效果及机制.方法:对38例处于慢性肾脏病(CKD)3～5期的贫血患者给予佳林豪1.2万IU皮下注射,每周1次,连续12周,同时补充铁剂、叶酸和维生素B12;骨髓穿刺进行铁染色和显微图像分析,比较治疗前后血清铁蛋白(SF)、血清铁(SI)及铁粒幼细胞计数,对总红系所占百分数(E(与SI、SF、红细胞压积(Hct)行相关分析,治疗前后取血检测红细胞压积(HCT)、RBC、血红蛋白(Hb).结果:治疗过程中大部分患者在EPO注射12周后HCT、RBC、Hb均比用药前有显著增高,骨髓红系增生较治疗前明显活跃,各类幼红细胞比率及E(总红系所占百分数)均显著升高,其中以晚幼红增生最为明显,SI、SF及铁粒幼细胞计数均明显降低,治疗前后骨髓△E%与血△RBC%、△HCT%呈高度正相关,△E%与△SF%、铁粒幼细胞计数变化率呈中度负相关,△E%与△SI%两者呈低度负相关.结论:大剂量重组人促红细胞生成素治疗肾性贫血效果显著.     

促红细胞生成素与肿瘤

长期以来,促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)仅仅被认为对造血系统有着自己独特的作用。近年来,越来越多的研究表明,EPO及其受体在非造血系统,特别是对肿瘤的发生发展也起着作用。在肿瘤细胞的侵袭、转移、肿瘤血管形成过程中,EPO及其受体都有促进作用,而缺氧环境是肿瘤的一个重要的特征,缺氧诱导因子也可以促使EPO的释放。本文就EPO及其受体对肿瘤发展的影响作综述,为临床更好的利用EPO提供一定的理论基础。     

小鼠胎肝红系细胞在分化过程中形态学观察及时序性表达分析

小鼠胎肝是小鼠发育早期主要的造血器官,红系细胞在胎肝造血过程中形态特征和组成成分等方面发生了明显变化。根据红系细胞体积的变化,利用Countstar细胞计数仪对小鼠E12．5-E17．5胎肝中直径8-14岬细胞进行数量统计,再结合观测到的红系细胞的形态特征和血红蛋白表达量的不同,将E9．5．E17．5胎肝中的细胞分为10类。统计结果显示,随着胎肝造血系统的发育,哺乳类红系细胞在终末分化时出现细胞体积减小、细胞核固缩、排核和血红蛋白表达量增加等时序性变化。红系细胞表面特异标志Terll9和CD71在EryD中高表达而在成体骨髓细胞和外周血细胞中表达较低的结果表明胎肝中红系细胞具有较高的分化能力。这些数据为研究红系分化、克隆红系分化相关基因及探讨红白血病发生的机制提供了理论依据。     

GATA—1红系特异性转录调节因子

ＧＡＴＡ－１是一种红系特异性转录调节因子,其结合基序广泛存在于红系特异表达基因的顺式调节元件中;ＧＡＴＡ－１具有锌指结构;能反式激活携带其结合基序的报告基因,在红系细胞分化发育中起重要作用。     

日本开发促红细胞形成素EPO

EPO是控制红细胞分化、增殖的造血激素,主要由肾产生。肾功能失调病人因EPO产量减少而引起肾性贫血。今后有可能用EPO代替现行的输血法治疗这种疾病。