利用Cre/LoxP系统删除转基因山羊体内的选择标记基因

在制备转基因家畜过程中的一个关键步骤是使用选择标记基因 (Selectable marker genes,SMGs) 将转基因整合细胞从大量的正常细胞中筛选出来,这导致了SMGs整合入家畜的基因组内持续传递给后代。SMGs已被证明能够显著影响基因组内整合位点处的基因调控,也增加了对转基因动物安全评价的复杂性。为了确定转基因山羊制备过程中SMGs的删除时机和删除方法,在体细胞克隆前后两个时段内,利用Cre/loxP系统删除SMGs的可行性,同时比较了蛋白转导和质粒共转染两种Cre导入方式的删除效率。结果表明：尽管在首次对山羊成纤维细胞进行遗传修饰后即可进行SMGs删除,但两次遗传修饰导致细胞严重老化,无法用于后续的体细胞克隆羊制备。在转基因山羊的成体细胞中删除SMGs不存在上述问题,成功率高,缺点是试验周期长、耗资增大。Cre表达质粒瞬时转染能够删除SMGs,但有超过30%的无SMGs细胞克隆中整合有质粒序列。TAT-CRE蛋白质转导方法可以避免引入的新外源基因,SMGs删除率达到43.9%~72.8%,是一种较佳的SMGs删除手段。     

系统代谢工程改造树干毕赤酵母生产琥珀酸

为提高树干毕赤酵母发酵生产琥珀酸的产量,借助基因组规模代谢网络模型iTL885获得琥珀酸合成的最佳代谢途径为扩增icl1基因和敲除sdh1基因。在此基础上,借助代谢工程策略构建过量表达异柠檬酸裂解酶基因icl1的重组菌株FPLicl、缺失琥珀酸脱氢酶基因sdh1的重组菌株FPLΔsdh和缺失sdh1基因同时过量表达icl1基因的重组菌株FPLΔsdh-icl。结果表明:3株重组菌的异柠檬酸裂解酶活性由0.33 U/mg分别增加为1.6、5.6和6.6U/mg;而琥珀酸脱氢酶活性则从13.8 U/mg分别降为10.7、0.3和0.3 U/mg。在以木糖为C源的培养基中,3株重组菌生产琥珀酸的能力分别是0.30、1.20和1.60 g/L。     

树干毕赤酵母木糖还原酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据NCBI中的木糖还原酶基因序列设计引物,利用高保真聚合酶克隆树干毕赤酵母木糖还原酶基因,加A后克隆到质粒pGM-T中,测序验证.然后将目的基因克隆到舍有强启动子的穿梭表达载体p424GPD中,构建含有XYL1基因的重组质粒p424GPD-XYL1.将p424GPD-XYL1转化到大肠杆菌中,提取总蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析.酶活测定确定木糖还原酶基因XYL1在大肠杆菌中得到活性表达,表明表达载体构建成功.表达载体的成功构建为后续构建重组酿酒酵母利用木糖发酵奠定基础.     

毕赤酵母重组菌株直接基因缺失方法的研究

毕赤酵母重组菌在表达外源蛋白时往往存在比较严重的蛋白降解现象,一种可供选择的解决办法就是将其中起作用的某种蛋白酶基因缺失,但目前国内外研究主要集中于非重组毕赤酵母的基因缺失,直接对重组菌进行基因缺失的研究较少。以现有的毕赤酵母基因重组菌(GS115Hir)为宿主菌,分别采用有标记的插入替换方法和无标记的Pop-In/Pop-Out方法直接缺失其PRC1蛋白酶基因和KEX1蛋白酶基因。缺失菌株经测序分析,结果显示发生了理论的基因缺失。在此基础上本文比较了这两种方法的各自优缺点,探讨了它们的不同的用途,为直接在毕赤酵母重组菌中进行基因缺失提供了有益的参考。     

Cre/LoxP系统在转基因小鼠上的应用策略

Cre/LoxP位点特异重组酶系统已发展为在体内外进行遗传操作的一个新的有力工具.该系统在转基因小鼠上的应用,可使转基因的表达或靶基因的缺失/突变的位点特异DNA重组不仅发生在小鼠发育的某一阶段或特定的组织器官,而且,若与控制Cre表达或功能的诱导系统结合,则可以时空方式体现.这些基于重组的策略可能对基因功能的研究和人类疾病的动物模型的建立产生深刻影响.     

Cre/lox位点特异性重组系统在高等真核生物中的研究进展

来自于P1噬菌体的Cre/lox系统通过位点特异性重组可以迅速而有效地实现各种生理环境下的基因定点插入、删除、替换和倒位等操作。Cre/lox系统作为目前基因打靶技术的核心工具,已被广泛应用于拟南芥、水稻、小鼠、果蝇、斑马鱼等高等真核模式生物。文章较为全面地介绍了Cre/lox系统的基本概况及其在高等真核生物中的应用,讨论了Cre/lox系统在研究中存在的主要问题和今后的发展方向,为利用该系统在不同高等生物中进行基因操作提供有用的参考。     

从伪狂犬病病毒中删除Cre/LoxP介导的报告基因

根据pEGFP-C1序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出两端各含一个同向LoxP位点的GFP表达盒,克隆于转移载体pSKLR获得pSKLR-G-LoxP。通过经典同源重组方法,得到表达GFP的TK基因缺失伪狂犬病毒重组毒株S03109。该重组病毒在转染了pOG231(表达Cre重组酶)的293T细胞上连续传代,筛选得到重组病毒株S0419。荧光显微镜观察、Western blot及PCR检测结果表明,S03109感染细胞后持续表达GFP,而S0419不表达GFP。PCR证实S0419为含单个LoxP位点的TK基因缺失病毒,并且在细胞培养上遗传稳定,测序结果(GenBank登录号AY822465)表明,在Cre重组酶的作用下,两个同向LoxP序列之间的GFP表达盒被正确除去。对BALB/c小鼠的半数致死量(LD50)及免疫保护实验结果表明,S03109和S0419对BALB/c小鼠的LD50值均大于3×105PFU,免疫BALB/c小鼠,攻毒后平均存活率分别为67.5%与70%。以上结果表明,利用Cre/LoxP位点特异性重组系统,成功去除了插入重组伪狂犬病病毒基因组中的GFP报告基因。     

Cre/lox位点特异性重组系统在高等真核生物中的研究进展

来自于P1噬菌体的Cre/lox系统通过位点特异性重组可以迅速而有效地实现各种生理环境下的基因定点插入、删除、替换和倒位等操作。Cre/lox系统作为目前基因打靶技术的核心工具, 已被广泛应用于拟南芥、水稻、小鼠、果蝇、斑马鱼等高等真核模式生物。文章较为全面地介绍了Cre/lox系统的基本概况及其在高等真核生物中的应用, 讨论了Cre/lox系统在研究中存在的主要问题和今后的发展方向, 为利用该系统在不同高等生物中进行基因操作提供有用的参考。     

重组线虫抗凝肽在毕赤酵母中的表达

目的：获得具有抗凝活性的重组线虫抗凝肽（NAP）蛋白, 为新型抗凝药物的开发奠定基础。方法：将pPIC3.5K-rNAP质粒转化毕赤酵母菌株GS115,筛选出阳性菌株后,用甲醇诱导表达。收集酵母培养上清,用SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,通过测定PT(血浆凝血酶原时间)、INR（血浆凝血酶原国际标准化比率）和APTT（活化部分凝血活酶时间）来验证其生物学活性。结果：获得了稳定表达NAP的重组酵母菌株。重组NAP被分泌表达,其分子量比预计分子量（8.7KD）稍大,约为10KD左右,可能与糖基化有关。体外活性检测证实其有较强的抗凝活性。结论：在毕赤酵母中成功表达了具有生物学活性的重组线虫抗凝肽,可用于新型抗凝药物的开发。     

树干毕赤酵母NLP31发酵产乙醇的研究

研究了树干毕赤酵母NLP31在木糖质量浓度为45 g/L的3种发酵培养基Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ上发酵3轮的发酵性能以及在45 g/L木糖或混合糖(葡萄糖30 g/L,木糖15 g/L)的发酵培养基Ⅲ上的代谢历程。结果表明:树干毕赤酵母NLP31在发酵培养基Ⅲ上,乙醇浓度和乙醇得率均达到最高,分别为(17.29±0.15)g/L和(84.65±0.58)%。在45 g/L木糖或混合糖(葡萄糖30 g/L,木糖15 g/L)的发酵培养基Ⅲ上的代谢历程表明:混合糖发酵达到最大乙醇得率的时间仅为12 h,要比单一木糖发酵缩短了8 h。树干毕赤酵母NLP31在以廉价的无机N源为发酵培养基上的乙醇发酵性能高,能够降低燃料乙醇的生产成本。     

Establishment of Cre/LoxP recombination system in transgenic rats

The rat has offered an important animal model in biomedical research including surgical procedure. However, advanced genetic manipulation has progressed less far in the rat than in the mouse. Here we report the Cre/LoxP transgenic rat system, demonstrating conditional chromosomal translocation both in the fertilization and adult stage, spatio-temporal gene controlling by catheter-based adenoviral gene transfer, and muscular fusion events in the limb transplant. Taking advantage of the larger body size of the rat than the mouse, this rat system provides a potential value to evaluate biomedical and therapeutic significance for gene therapy and regenerative medicine.     

Smad2条件基因剔除载体的构建及LoxP位点有效性鉴定

Smads家族是最新发现的TGF－β信号转导途径中一个重要的新基因家族,SMAD2属于受体激活的SMADs。Smad2在某些肿瘤中发生突变,是一种可能的肿瘤抑制基因。Smad2基因完全剔除小鼠在胚胎期E6．5天死亡,为了研究Smad2在成体各组织器官及肿瘤发生中的可能作用,构建了Smad2条件基因剔除载体,将LoxP置于Smad2基因组序列C末端功能域两侧,并在组成型表达Cre重组酶的大肠杆菌中检测了LoxP位点的功能,该载体的构建为进行Smad2组织特异性基因剔除研究了奠定了基础。     

用Cre/LoxP和CRISPR基因工程技术构建猪肌肉生长抑制素双等位基因敲除细胞系

肌肉生长抑制素 (myostatin,Mstn)基因失活可引起哺乳动物的肌肉增生,但其调控机制尚不清楚,且缺乏可靠的试验材料验证Mstn相关分子通路的变化。本研究所用PK3108细胞系是在野生型PK15细胞系的基础上成功靶向敲除一条等位基因,在其靶位点敲入标记基因,敲除了204 bp的外显子3序列, LoxP锚定在其标记基因两侧。利用Cre/LoxP重组酶删除系统删除插入PK3108Mstn靶位点的标记,借助流式细胞仪和荧光蛋白甄别得到无标记的过渡型细胞系PK3108-2。将Cas9/sgRNA表达载体和供体DNA共转染PK3108-2,借助G418抗性筛选和倒置荧光显微镜挑选出仅带阳性标记的克隆L18,对其基因组进行PCR产物凝胶电泳与PCR产物测序,证明克隆L18在预设位点发生同源重组;对其蛋白质进行Western 印迹实验表明,Mstn被成功地敲除失活。综上结果证明,本研究实现了双等位基因的精准敲除,构建了Mstn双敲除梯度回复表达细胞系。本研究为揭示Mstn的作用机制提供理想的实验材料,也为双等位基因的敲除提供了可借鉴的技术路线。     

去除选择标记基因的Cre/lox重组系统在植物中的应用

获得无选择标记基因的转基因植物越来越受到研究者的重视。目前,应用得较广泛的去除选择标记基因的方法有共转化法和位点特异性重组法,其中位点特异性重组系统中Cre/lox重组系统研究最多。以下介绍了Cre/lox位点特异性重组系统的原理、特点及其近几年在植物中的应用,针对本实验室在这一领域的研究情况,重点阐述了Cre/lox系统的应用前景。随着植物反应器研究领域的不断壮大,去除筛选标记基因是植物反应器研究的必然趋势。