细叶百合LpPEX5基因克隆及蛋白表达纯化

[目的]探究Lp PEX5蛋白表达与纯化的最佳条件。[方法]从细叶百合的鳞茎中克隆出过氧化物酶体生物合成蛋白基因(Lp PEX5),在详细分析该蛋白质同源氨基酸序列比对、进化树、保守区域,二级结构与三级结构预测等生物信息学后,构建到p QE-30原核表达载体上,转化大肠杆菌M15,通过SDS-PAGE凝胶电泳对不同诱导时间、诱导温度、IPTG浓度影响蛋白的表达量进行研究。利用亲核层析树脂纯化获得融合蛋白。[结果]成功克隆出Lp PEX5基因,构建p QE-Lp PEX5原核表达载体并且诱导和纯化出Lp PEX5蛋白。[结论]Lp PEX5蛋白的最佳诱导条件为30℃,1 mmol/L IPTG诱导5h。该研究为分析Lp PEX5蛋白的活性、验证蛋白间的相互作用等后续试验研究奠定了基础。     

栽培细叶百合的传粉生态

对栽培的细叶百合进行传粉生态学的初步观察结果显示：细叶百合2:30～3:00开始开花,5:30～7:00完全开放;单花开放时间3～4 d,群体花期为12 d。花蜜分泌在开花当日,分泌高峰在9:00～11:00,花蜜分泌与昆虫访花谐调一致。花蜜成分主要为葡萄糖、阿拉伯糖和β－D吡喃果糖,花朵挥发物的成分是软脂酸、软脂酸甲酯、肉豆蔻酸、月桂酸、3－叔戊基戊酮、十三烷和1－甲基,2异丙烯基环丁基乙醇。访花昆虫主要是蝶类、蜂类和蝇类;传粉昆虫为绿豹蛱蝶、大红蛱蝶、绢粉蝶及单齿切叶蜂、小齿淡脉隧蜂,其中小齿淡脉隧蜂的传粉活动最为活跃。晴天时小齿淡脉隧蜂访花频率的日变化与光照的日变化呈极显著的正相关,与温度的日变化呈显著的正相关,与湿度的日变化呈显著的负相关;阴天时与空气温度相关极显著,与空气湿度相关显著。细叶百合以异花虫媒传粉为主,部分自交可育。     

细叶百合的生物量和营养分配

 以栽培的2年生细叶百合（Lilium pumilum）为材料,于2000年的生长季从蕾期至种子成熟期进行6次取样,对其各器官生物量和氮、磷元素的配置进行了动态研究。结果表明,细叶百合虽然以种子繁殖为主,但在整个生长季用于生殖器官的生物量投资的比例并不很大,大量干物质分配到地下器官鳞茎中（平均为60.17%）;茎、叶的生物量分配比例仅次于鳞茎;雄蕊生物量分配比例明显高于雌蕊。在叶萌动及展叶初期植株全氮百分含量最高;从春季萌动至秋季果实成熟,叶中的氮呈逐渐递减的趋势;茎和生殖器官的全氮含量在蕾期最大;生殖器官与叶、鳞茎的全氮含量相关显著。磷在生殖器官的含量较高,这与磷在植物有性生殖过程中的重要作用相一致;生殖器官与茎的全磷含量相关显著。地下器官全氮、全磷随季节变化有增多的趋势;地上各器官全氮、全磷相关显著,随季节变化有明显减少的趋势。     

棉花PTS2受体基因(GhPex7)的克隆及表达分析

利用cDNA—AFLP差异片段F010,通过RACE延伸、EST、检索等方法获得了一个棉花过氧化物酶体定位信号2受体蛋白基因(peroxisomal targetingsignal type 2 receptor,GhPex7p)的编码序列。该cDNA包含一个954bp的开放阅读框,编码317个氨基酸,推测其等电点为5．603。同源性分析表明：推测GhPex7与拟南芥、酵母、果蝇、小鼠和人的Pex7p基因存在序列相似性,其中与拟南芥的同源性最高,为83％,并具有3段WD-40蛋白家族的保守域,与拟南芥AtPex7的编码蛋白同类。Southern杂交结果表明该基因在陆地棉基因组中存在两个拷贝。Northern blotting和RT-PCR分析表明该基因在棉花根、茎、叶、花、胚珠和纤维中均表达,但茎、叶组织中的表达水平明显高于胚珠和纤维。     

盐胁迫条件下玉米萜类合成相关基因的表达分析

萜类是植物生长发育中具有重要作用的次级代谢产物,某些萜类可被生物和非生物胁迫诱导产生。用200 mmol/L NaCl溶液处理商用玉米品种天塔五号（F1）及其父母本三叶期幼苗,qRT-PCR结果发现萜类合成途径中的萜烯合酶基因2（terpene synthase 2, TPS2）、萜烯合酶基因3（terpene synthase 3, TPS3）、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因4（geranylgeranyl diphosphate synthase 4, GGPS4）在三组材料中表达量随胁迫时间延长均先上调再下调,且F1表达量显著高于亲本。F1自交F2代耐盐性及基因表达情况分析表明,F2代中三个基因表达仍与耐盐性呈正相关。对盐胁迫条件下总类胡萝卜素及各成分含量、生物量、光合指标、叶绿素和脯氨酸含量进行测定,发现F1耐盐能力明显优于亲本,表明 TPS2、TPS3、GGPS4 基因高水平表达与F1发挥耐盐优势、抵御逆境胁迫有一定相关性。     

甲醇营养型酵母表达系统的研究进展

甲醇营养型酵母越来越被人们用作外源基因的表达系统。本文综述其在表达质粒构建,表达株的筛选,表达产物的糖链加工以及它分拣外源蛋白进入过氧化物酶体等的特点,不仅具有广泛的商业用途,而且在理论研究特别是膜蛋白结构与功能方面也有潜在应用价值。     

拟南芥在盐胁迫环境下SOS转录调控网络的构建及分析

研究拟南芥在高浓度盐处理环境下的基因调控网络, 有助于了解其在盐胁迫环境下保持正常生长的防御机制。针对目前广泛研究的SOS (Salt Overly Sensitive)耐盐机制, 文章整合公共数据库中盐胁迫相关的拟南芥基因组表达谱芯片, 通过反向工程方法构建了拟南芥在盐胁迫状态下的SOS转录调控网络。所获得的调控网络包含70个盐胁迫相关且高度互作的互作基因, 其中27个转录因子为主要调控节点。进而根据SOS核心基因的表达特性, 所得调控网络内的不同表达模式得到了鉴别。     

PEX5参与调控拟南芥根系抗逆性的初步研究

以拟南芥过氧化物酶体生成蛋白突变体pex5和野生型为试验材料,初步研究PEX5对拟南芥根系抗逆性的影响。结果表明,在MS基础培养基中,突变体pex5的根长相较于野生型根长显著变短;同时,拟南芥pex5突变体株高也低于野生型,说明PEX5基因功能缺失影响了拟南芥根系和茎的生长。pex5突变体在添加氯化钠或甘露醇的MS培养基上培养时,萌发和根伸长受到的抑制显著高于野生型,突变体幼苗的SOD和POD活性也显著低于野生型,说明PEX5参与调控拟南芥根系的抗逆性。本研究为解析PEX5在植物抗逆中的调控机制提供了重要参考。     

拟南芥AtJ2和AtJ3基因表达对环境胁迫的响应

用PCR的方法获得AtJ2和AtJ3基因的3'非编码区的核甘酸片段作为探针,Northern杂交结果表明:AtJ2和AtJ3基因在植物的根、茎、叶、花蕾、花和长角果中都有表达,并在植物整个生长周期中都有表达,但随着植株的衰老表达量有所下降.不同环境胁迫的实验结果表明:热激使AtJ2和AtJ3基因的表达迅速升高;冷胁迫也能诱导这两个基因表达的明显增加,但需要的时间比热激要长得多,达9 h;水分胁迫能引起AtJ2和AtJ3基因表达量的微弱增加;可盐胁迫对AtJ2和AtJ3基因的表达没有影响.说明AtJ2和AtJ3基因可能参与对除盐胁迫以外多种环境刺激的响应.     

不同山丹居群在保定的生长特性分析

对25个居群的山丹在保定地区的物候期、生长期特性进行了调查分析。结果表明,不同山丹居群的物候期存在明显差异。萌芽期和开花期最早的为辽宁居群,最晚的为易县和邯郸居群,萌芽期相差37～39 d,开花期相差将近3个月。25个居群的不同生长发育阶段(花蕾发育期、花期天数、生长周期)所需的时间长短不一。不同居群山丹生长曲线基本一致,均为慢-快-慢的生长趋势。相关分析表明纬度与山丹的萌芽期、现蕾期、始花期、末花期、果熟期、枯萎期之间均呈极显著负相关。山丹的自然物候期也存在明显早、晚差异,这为百合育种提供了良好的资源。     

陕北野生山丹丹染色体数目与核型分析研究

首次采用酸解去壁低渗法,以陕北地区野生山丹丹根尖为材料,观察染色体并对野生山丹丹的染色体数目与核型进行研究分析。结果表明:陕北野生山丹丹的染色体数目为2n=24,核型公式为2n=2x=8m+2sm+12st+2t,相对长度变化范围为5.84%～12.75%,核型不对称系数为72.16%,属"3B"型。     

山丹不同居群花粉形态研究

为掌握山丹居群在孢粉学方面的遗传多样性,在扫描电子显微镜下对25个居群的山丹花粉进行了形态观察,结果表明:山丹花粉粒形态为单花粉粒,极面观为椭圆体,具单萌发沟。不同居群的花粉粒在大小、网眼直径、萌发沟宽、P/E值和外壁纹饰等方面存在不同程度的差异,且居群间花粉性状的变异大于居群内的变异,最大变异系数达25.52%。     

西伯利亚蓼钙调蛋白基因的克隆及其在盐胁迫下的表达

已从西伯利亚蓼叶中cDNA文库中获得的钙调蛋白EST序列,采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了具有完整编码区的钙调蛋白基因的cDNA序列（GenBank登录号GQ988382）,命名为PsCaM。该基因全长615bp,编码区为450bp,编码149个氨基酸,5＇非翻译区为63bp,3＇非翻译区为102bp。同源性分析表明,该蛋白与其他植物钙调蛋白高度保守,氨基酸同源性高达98%。用实时荧光定量PCR研究3%NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼基因表达的结果显示,自然条件下,该基因在叶中表达量最高,地下茎次之,茎中最低;盐胁迫下CaM在西伯利亚蓼的地下茎、茎和叶中均有表达,表达模式不同。     

山丹不同居群花器官的形态多样性研究

为掌握山丹种质资源花器官的多样性,对国内山丹资源进行引种种植观测。结果表明,25个山丹居群的花器官性状表现出一定差异。差异主要来源于花蕾毛的有无、花瓣宽、反卷度及花色等性状,其中花朵直径、花药长与地理因子(经度、纬度、海拔)存在显著或极显著相关性;根据主要花器官性状对25个居群进行类平均UPGMA聚类,可以分为5类,结果表明山丹居群花器官性状的聚类与地理位置及海拔都有一定的关系。     

拟南芥盐胁迫应答相关基因AtGRP9的克隆及表达

利用拟南芥cDNA文库在裂殖酵母中的功能性表达 ,从拟南芥中分离了一个编码富甘氨酸蛋白 (glycine richprotein ,GRP)的cDNA克隆 (其基因被命名为AtGRP9)。在裂殖酵母中大量表达AtGRP9cDNA能显著提高细胞的耐盐性。在拟南芥中 ,AtGRP9基因的表达受盐胁迫诱导 ,其表达具有根器官特异性 ;而且 35S启动子组成形成超量表达植株的耐盐性明显提高。这些实验结果表明拟南芥AtGRP9可能是一盐胁迫应答相关基因。     

Somatic embryogenesis and direct as well as indirect organogenesis in Lilium pumilum DC. Fisch., an endangered ornamental and medicinal plant

Somatic embryogenesis and organogenesis in Lilium pumilum were successfully regulated by picloram, α-naphthaleneacetic acid (NAA), and 6-benzyladenine (BA). In organogenesis, the highest shoot regeneration frequency (92.5%) was obtained directly from bulb scales on Murashige and Skoog (MS) medium containing 2.0 mg L^?1 BA and 0.2 mg L^?1 NAA, while organogenic callus (OC) formed from leaves on MS medium supplemented with 1.0 mg L^?1 BA and 0.5 mg L^?1 NAA. Following subculture, 76.7% of OC regenerated shoots. In somatic embryogenesis, the combination of picloram and NAA increased the amount of embryogenic callus (EC) that formed with a maximum on 90.7% of all explants which formed 11 somatic embryos (SEs) per explant. Differences between EC and OC in cellular morphology and cell differentiation fate were easily observed. SEs initially formed via an exogenous or an endogenous origin. The appearance of a protoderm in heart-shaped SE and the bipolar shoot–root development in oval-shaped SE indicated true somatic embryogenesis. This protocol provides a new and detailed regulation and histological examination of regeneration pattern in L. pumilum.     

蝴蝶兰PhTSJT1基因的克隆及在低温胁迫下的表达分析

本研究从蝴蝶兰叶片中克隆了茎部特异基因Ph TSJT1的全长序列(GenBank登录号为MF797883),并分析了其在不同组织及低温胁迫下的表达特性。结果表明,Ph TSJT1基因全长994 bp,编码239个氨基酸,属于Class-Ⅱ谷氨酰胺酰胺基转移酶超家族成员;同源性分析表明,该蛋白与多种植物的茎部特异蛋白和铝诱导蛋白有较高的同源性,进化上与小兰屿蝴蝶兰的茎部特异蛋白亲缘关系最近;该基因在营养器官中表达水平较高,在花器官中表达水平较低;13℃/8℃(昼/夜)的低温胁迫抑制PhTSJT1基因的转录表达,并随着低温胁迫时间的延长,Ph TSJT1基因的表达水平逐渐降低,在温度恢复正常时其表达水平升高;4℃冷胁迫低温条件下,PhTSJT1基因在处理1 h时,表达水平升高,处理8 h时表达水平最高,16 h后表达水平逐渐降低。由此推测,PhTSJT1参与4℃冷胁迫的分子调控。本研究不但有助于理解热带亚热带植物的耐冷机制,也为蝴蝶兰新品种的遗传改良提供帮助。     

小麦盐胁迫相关基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR方法,从小麦中克隆获得1个盐诱导小麦MYB类转录因子基因TaSIM（Triticum aestivum salt-induced MYB）,该基因cDNA全长1 213bp,具有1个831bp的开放阅读框,编码276个氨基酸,预测分子量约为29.903kD,等电点为10.12,推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域。系统发生树分析表明,TaSIM与二穗短柄草XP₀03576185亲缘关系最近。半定量RT-PCR检测结果显示,TaSIM基因受盐胁迫诱导表达。亚细胞定位结果显示,TaSIM-hGFP融合蛋白定位于细胞核中。研究结果表明,小麦TaSIM基因编码的蛋白可能在细胞核内参与小麦对盐胁迫的应答反应。     

岷江百合类萌发素蛋白基因LrGLP2的克隆及表达特性分析

类萌发素蛋白是植物中普遍存在的一类可溶性糖蛋白,在植物抗逆胁迫中起着重要作用。依据岷江百合编码GLP的EST序列设计引物,采用快速扩增cDNA末端技术,从岷江百合犯ilium regale Wilson）克隆得到一个新的GLＰt基因的全长eDNA序列,命名为LrGLP2。LrGLP2全长cDNA为921bp,含有654bp的开放阅读框,49bp5’非编码区以及218bp3’UTR,编码217个氨基酸的蛋白质。LrGLP2编码蛋白质与已知植物GLPs家族成员间的同源性和聚类分析表明LrGLP2与来源于水稻（Oryza sativa）、节节麦似egilopstauschii）、葡萄（Vitis vinifera）中的GLPs具有较高的相似性。qRT-PCR分析显示,LrGLP2在岷江百合正常生长发育的根中有一定量的表达,而在茎和叶中几乎检测不到表达量。水杨酸、茉莉酸以及H202处理均不同程度抑制LrGLP2的转录水平,但乙烯处理能明显诱导LrGLP2的表达。此外,岷江百合接种尖孢镰刀菌（Fusari—umoxysporumfsp．tiliO后,LrGLP2在接种后2h表达迅速上调,12h表达量急剧上升,至24h表达量达到最大值,之后表达量下降,可见￡rGLP2参与岷江百合对尖孢镰刀菌的防卫反应。