来源于酸热脂环酸杆菌的嗜酸性α-淀粉酶的表达研究

从嗜酸耐热的酸热脂环酸杆菌Alicyclobacillusacidocaldarius中克隆到α_淀粉酶的基因 (amy) ,该基因全长 390 3bp ,编码130 1个氨基酸 ,理论分子量约 140kD。将基因amy分别克隆到大肠杆菌E .coli表达载体pET-2.2b(+)和毕赤酵母P .pastoris表达载体pPIC9α ,并在大肠杆菌和毕赤酵母中得到了表达 ,表达产物具有淀粉酶的活性。对酵母中表达的酶蛋白AMY进行了纯化 ,并初步研究了它的酶学性质 ,它的作用最适pH3.2 ,在pH 2.5～4.6范围内 ,酶活性保留 50%以上 ,它的最适温度65℃ ,在 70℃下处理 30min ,酶活性维持50%以上 ,基本保留了天然酶蛋白的耐热性和嗜酸性。位于基因amy内部 +1174～+3288bp的基因片段amy′全长 2115bp ,编码705个氨基酸 ,在E .coli表达后依然具有淀粉酶的活性。     

里氏木霉内切葡萄糖苷酶Ⅳ在毕赤酵母中的表达*

进行了内切葡萄糖苷酶Ⅳ(EGⅣ)在毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中的表达。采用RT-PCR的方法从里氏木霉(Trichoderma reesei)中分离到eg4基因。将eg4基因与毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,得到重组质粒pPICZαA-eg4。将该重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115,eg4基因通过同源重组被整合到毕赤酵母的染色体上,并处于酵母α因子的下游,得到重组菌株P.pastoris-EGⅣ1。在甲醇     

汉森酵母表达载体的构建和人血管生成抑制素基因的表达

汉森酵母(H.polymorpha)是一类能以甲醇为唯一碳源和能源的甲基营养酵母,具有高表达外源基因、易于高密度发酵和产业化的特点。应用PCR技术扩增汉森酵母甲醇氧化酶(Methanol oxidase MOX)基因启动子和转录终止序列,并与汉森酵母Leu基因(Hpleu2)和人血管生成抑制素基因一起重组进大肠杆菌质粒pSP72,构建了整合型表达载体pSMA17,采用LiAc法将pSMA17转入汉森酵母A16(leu),筛选出阳性转化子H.polymorpha A16(pSMA17)。转化子在YPGE培养基中培养至对数生长后期,用甲醇进行诱导表达。ELISA和SDSPAGE分析结果证明人血管生成抑制素已获表达,表达产物分泌至培养基中。Western blot结果显示重组的人血管生成抑制素能与抗人纤溶酶原抗血清特异结合,具有免疫原性。     

掷孢菌科的研究II．中国叶表掷孢酵母的初步分类及掷孢酵母属的种类

作者多年来从我国禾本科等植物叶表分离了大量掷孢酵母,本文重点报道70株掷孢酵母与类酵母的初步分类,共分为三属,即掷孢酵母属(Sporobolomyces),布勤掷孢酵母属(Bul-lera)与腥掷孢菌属(Tilletiopsis);其中掷孢酵母属占75％。至于53株掷孢酵母,共分为三种,即攻红掷孢酣母(Sporobolomyces roseus)、赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)、Sporobolomyces shibatanus);经统计,后者最为常见,占此属的84％。这些种在我国尚未见报道,作为新记录。     

克鲁斯假丝酵母及其近似种的脉冲电泳核型分析

用钳位均匀电场脉冲电泳(CHEF)系统分析了克鲁斯假丝酵母(Candida krusei),郎比可假丝酵母(C. lambica)和粗状假丝酵母(C. valiad)的模式菌株的电泳核型,发现这三种表型相似的假丝酵母却具有互不相同的染色体DNA分子带型,为其分类学研究提供了可靠的鉴别依据。在常规分类学研究的基础上,测定了AS 2.75(原定种名为(C. incospicua),AS2.1182(原定种名为 C. lambica)和AS 2.1772(未定种)等三株假丝酵母的G+C含量和脉冲电泳核型。通过对已报道的C. inconspicu的G+C含量及上述三种假丝酵母模式菌株的脉冲电泳核型的比较分析证明,AS 2.75和AS 2.1772为粗状假丝酵母(C. valida),AS 2.1182为克鲁斯假丝酵母(C. krusei)。     

抑菌试验用于测定T-2毒素

本文从镰刀菌中提取T-2毒素,对不同的酵母菌进行抑菌试验,结果证明红酵母属(Rho-dotorula)的三个种,即红酵母(R.glutrnis)、深红酵母(R.ruber)和小红酵母(R.minuta)对T-2毒素最敏感,被定为测毒敏感菌。将抑菌试验与家兔皮肤反应试验、豌豆发芽抑制试验进行对比,结果有部分重合,但不能相互取代。由于抑菌试验具有快速、简便、准确的优点,可做为测定T-2毒素的方法之一。     

重组毕赤酵母表达工程植酸酶发酵过渡相参数相关分析

微生物发酵是一个涉及不同尺度的互相关联的复杂生物系统的过程 ,将重组毕赤酵母表达工程植酸酶过渡相的在线和离线参数进行了相关分析研究。通过对发酵过程的在线细胞代谢生理参数 (OUR)和环境参数 (DO)的变化进行相关分析表明 :甘油和葡萄糖碳源对AOX合成的阻遏强度不同 ,葡萄糖的阻遏性明显强于甘油 ,相对于醇氧化酶启动子 ,葡萄糖为强阻遏性底物。根据甲醇代谢途径关键酶酶活性变化 ,推测出各代谢途径流量分布的变化 ,即甲醇诱导后糖酵解途径和三羧酸循环途径代谢流比例下降 ,而磷酸戊糖途径中代谢流通量上升 ,甲醇完全氧化代谢流成为主要代谢流 ,与过渡相在线参数pH、OUR(CER)和RQ等相关分析的甲醇代谢途径的变化结果一致。此外 ,建立了生产过程在线控制与分析的标准 :当OUR和CER逐渐增大 ,则可判断甲醇已被利用和启动子已被甲醇成功诱导 ,即工程植酸酶开始启动表达.     

透明颤菌血红蛋白在肉桂地链霉菌中的表达对其细胞生长及抗生素合成的影响

肉桂地链霉菌(S.cinnamonensis)是莫能菌素(Monensin)的产生菌。大肠杆菌链霉菌穿梭表达载体pHZ1252中的透明颤菌血红蛋白基因(vhb)位于硫链丝菌素诱导启动子P_tipA之下,它在肉桂地链霉菌中的结构不稳定,发生了重组缺失,缺失的片段包括大肠杆菌质粒部分和vhb基因。但来自阿维链霉菌(S.avermitilis)中缺失了大肠杆菌质粒部分却保留了完整的vhb基因及tipA启动子的pHZ1252,可在肉桂地链霉菌中稳定复制,不再发生缺失,经硫链丝菌素诱导表达出了有生物活性的VHb蛋白。摇瓶发酵实验证明,VHb蛋白在氧限条件下可明显促进肉桂地链霉菌的菌体生长和抗生素合成。     

苏云金芽孢杆菌δ－内毒素crylA?基因在大肠杆菌和变铅青链霉菌中表达

利用合成的寡聚核苷酸片段,从质粒pOS1000中分离出具有适合克隆位点的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis )δ－内毒索crylA?全长基因。将该基因与大肠杆菌表达载体pKK223-3重组,并引入大肠杆菌JMl09中,经IPTG诱导．获得了超量表达的CryIA?蛋白。将crylA?全长基因插入链霉菌表达载体pHZl272中,得到重组质粒pHZl256,将该质粒引入变铅青链霉菌(Streptomyces　lividans)JT46中,经硫链丝菌素诱导．通过Westerablotting测定表明,重组变铅青链霉菌JT46(pHZl256)已表达出相应的CrylA?蛋白。杀虫试验表明,大肠杆菌和链霉菌所表达出的δ－内毒索crylA?对小菜蛾均有毒杀作用,其致死率分别为93％和57％。     

人工合成的黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母系统中的高效表达

本文以黑曲霉(Aspergillus niger)NRRL3135菌株植酸酶基因为对象,通过基因人工合成的方法去除了该基因的内含子与信号肽编码序列,换用在毕赤酵母(Pichia pastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。该人工合成植酸酶基因(PhyA-as)以N端融合的方式正确插入到毕赤酵母表达载体pPICZαA。通过电击将重组表达载体整合入酵母染色体DNA中得到重组转化子。SDSPAGE结果与表达产物酶学性质研究表明植酸酶得到分泌表达,且与天然产物性质基本一致。筛选得若干株高产基因工程菌,其中SPANⅢ菌株达到了在摇床培养条件下,每毫升发酵液产生165000u植酸酶的水平,基本满足工业化生产的要求。