圈卷产色链霉菌分化关键基因——saw1的克隆及酶切分析

链霉菌是现代生物学研究中一种重要的微生物,它有两个突出的特征:其一,有无与伦比的合成次生代谢产物的能力,世界上所知数千种抗生素的70％由其产生。其二,有一个复杂的发育分化的生命周期,是微生物分化研究的一个最好的模式材料。链霉菌分化主要为形态分化和生理分化,两者彼此独立又相互关联,构成复杂的分化调控网络,研究分化基因的调控不但有重要的理论意义,而且可用于控制抗生素的生物合成,因此弄清合成途径的分子机制,也有潜在的应用价值。圈卷产色链霉菌是从我国东北土     

圈卷产色链霉菌分化及其特性的研究

链霉菌分化的分子生物学研究是一个饶有兴趣并富有挑战性的世界前沿研究课题.在原核生物的分化研究中,主要以枯草杆菌(Bacillus subtilis)作为模式系统,但枯草杆菌的生命周期尤其是分化过程远比链霉菌简单,不象链霉菌有基质菌丝、气生菌丝、菌丝螺旋和孢子分隔那样的发育分化过程[1].在真核生物中也有分化研究的报道,如构巢曲霉、酵母等.由于真核生物的基因结构比原核生物复杂得多,弄清分化中基因调控的关系就更加困难.因此,选用链霉菌作分化研究的材料有其独一无二的优越性.国际上有关链霉菌的分子生物学研究,近年来主要以链霉菌的抗生素生物合成基因和链霉菌的分化基因两个大的方面作为研究的热点和主攻方向,并展开了一些开拓性的研究.     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因sanK的克隆及功能研究

利用染色体步移策略,以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约10kb的DNA片段。对其中1.8kb的PvuII-SacII片段进行了序列分析,结果表明：此片段中含有一个具有1170个核苷酸的完整开放阅读框,起始密码子为447位的ATG,终止密码子为1614位的TGA,推测其编码一个389个氨基酸的蛋白质产物。利用BLASTX程序进行的分析揭示,此基因编码一个肌氨酸单体氧化酶。基因功能研究结果表明,此基因与圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成直接相关,命名为sanK。     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因-sanK的克隆及功能研究

利用染色体步移策略,以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约１０ｋｂ的ＤＮＡ片段。对其中１．８ｋｂ的ＰｖｕⅡ－ＳａｃⅡ片段进行了序列分析,结果表明：此片段中含有一个具有１１７０个核苷酸的完整开放阅读框,起始密码子为４４７位的ＡＴＧ,终止密码子为１６１４位的ＴＧＡ,推测其编码一个３８９个氨基酸的蛋白质产物。利用ＢＬＡＳＴＸ程序进行了分析揭示,此基因编码一个肌氨酸单体     

圈卷产色链霉菌分化基因sawB的结构与功能

以Sau3AI部分酶切野生型圈卷产色链霉菌7100(Streptomyces ansochromogenes 7100)染色体DNA,回收3～6 kb的DNA片段,插入到链霉菌表达载体pIJ702的BglⅡ位点,转化圈卷产色链霉菌白色突变株W19,得到了近3 000个转化子,从中筛选到了两个具有硫链丝菌素抗性和野生型灰色表型的转化子.进行了质粒提取和酶切分析,两个重组质粒分别命名为pNL-1和pNL-2(分别含有约5.2和5.8 kb的外源片段).通过亚克隆及突变株互补实验,将互补W19的基因定位在了1.25 kb的Pst Ⅰ-Apa Ⅰ片段上.DNA序列分析结果表明,该DNA片段中含有一个完整的可读框(ORF1),编码一个由295个氨基酸组成的蛋白质,该基因命名为sawB.利用Blast程序在蛋白数据库中比较发现,SawB与天蓝色链霉菌的一个转录调控蛋白WhiH具有81%的一致性.利用基因破坏策略研究了sawB的功能,结果发现,野生型菌株的sawB基因破坏后,丧失了孢子形成能力,由灰色表型转变为白色表型.显微镜下观察sawB突变株的气生菌丝长而直,顶部略有波浪形卷曲,螺旋程度有所下降.由此可知,sawB是与圈卷产色链霉菌形态分化有关的一个重要基因,它与菌丝螺旋及孢子形成直接相关.sawB的异源表达分析表明,sawB可互补天蓝色链霉菌whiH突变株C119,使之恢复到野生型表型,产生紧密螺旋及丰富的灰色孢子.     

圈卷产色链霉菌分化早期基因——samfR的研究

以链霉菌发育调控启动子PTH4 直接控制的下游部分基因片段为探针 ,在圈卷产色链霉菌中克隆到 1个 4.6kb的DNA片段 ,该片段除含有sawD基因外 ,其中1 .4kb的PvuⅡDNA片段对圈卷产色链霉菌的分化有促进作用 .序列分析及同源性比较表明 ,开放阅读框架 (ORF)由 6 39个核苷酸组成 ,编码 2 1 3个氨基酸的蛋白 ,该蛋白与红球菌 (Rhodococcusgloberulus) 3-羟苯丙基丙酸 ( 3HPP)代谢合成的调控基因hppR所编码的蛋白有 36 %的氨基酸完全相同和 5 2 %的氨基酸类似 ,该基因称之为samfR基因 .基因功能研究表明 ,samfR基因的破坏使圈卷产色链霉菌不能形成气生菌丝和孢子 ,而发育分化停止在基质菌丝阶段 ,出现光秃型的表型 .     

圈卷产色链霉菌分化相关基因samR调控的初步研究

在野生型的圈卷产色链霉菌中,增加单个或多个拷贝数的samR,观察该基因对野生株表型和形态的影响。结果表明,samR的拷贝数的增加会使孢子形成提前,但是增加单拷贝的菌株与增加多拷贝的菌株所表现的增效作用相同。在大肠杆菌中对samR进行了GST融合表达和纯化,通过凝胶阻滞实验证明,SamR蛋白可与其上游的调控区特异性结合。由此推测samR是一个自调控基因。     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因：—sanJ的克隆及功能研究

以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌cosmid基因文库中筛选到１个大约７．５kb的ＤＮＡ片段,交ＤＮＡ片段克隆到载体pBluescripM13-的KpnⅠ位点,得到了重组质粒pNL2200.对pNL2200中外源ＤＮＡ片段进行了一系列的亚克隆及部分核苷酸序列分析。结果表明,２．３kb的SalⅠ－ＢaｍＨⅠＤＮＡ片段中含有１个完整的开放阅读框,起始密码子为２７１位的ＧＴＧ,终止密码子为１９５４位的ＴＧＡ,该基因的大小为１６８６bp,编码１个大小为５６１个氨基酸的蛋白质产物。利用blastx程序的蛋白质数据库中进行同源比较,结果揭示此基因产物与腺苷酸形成酶超家族的连接酶有４４％的一致性,此外,该基因的破坏导致圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成能力的丧失,证明它是尼可霉素生物合成所必需的,命名为其为sanＪ。     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因sanA的克隆、结构和功能

圈卷产色链霉菌是尼可霉素产生菌,经紫外线诱变后,以赤星灰霉为指示菌筛选到遗传稳定的尼可霉素生物合成阻断突变株,选择其中的NBB19为受体,以质粒pIJ702为克隆载体,从野生型圈卷产色链霉菌的DNA文库中克隆到了6kb的DNA片段,能互补NBB19使之恢复尼可霉素的产生能力.对6kbDNA片段中的部分片段进行了序列分析,结果表明2710bpDNA片段包含一个1365bp的完整开放阅读框架,编码一个由454个氨基酸残基组成的蛋白质,该基因命名为sanA.蛋白序列数据库比较结果表明,sanA编码的蛋白质氨基酸序列与Pyrococcus horikoshii的甲基转移酶有较高的同源性,353个氨基酸残基中有25%的一致性.用基因破坏策略研究了sanA的功能,野生型菌株sanA基因被破坏后导致失去合成尼可霉素的能力,表明sanA是尼可霉素生物合成中的一个新的重要基因.     

圈卷产色链霉菌硝基烷类氧化酶的分离纯化及酶学性质

圈卷产色链霉菌硝基烷类氧化酶基因naoA在大肠杆菌中获得了成功表达,从含有重组质粒pNA101(pET23b∷naoA)的工程菌株BL21(DE3)中分离纯化了硝基烷类氧化酶,SDSPAGE检测为均一。对纯酶进行了酶学性质及动力学研究。底物为1硝基丙烷、2硝基丙烷和硝基乙烷时,在04mol/L的磷酸缓冲液中,酶的最适反应pH值为7～8,最适反应温度为48℃～56℃。室温保存6d后,酶的活性保持了43.3%,但对60℃以上的高温敏感。硫醇化合物如巯基乙醇、还原型谷胱甘肽不同程度地抑制酶活性,特别是NADH,其浓度为1mmol/L时,酶活性几乎全部丧失。以1硝基丙烷为底物时,NaoA的Km为357mmol/L,Vmax为0199μmol/(μg.min)。     

圈卷产色链霉菌分化相关基因——saw1的结构和功能

用双脱氧链终止法进行了分化基因——saw1的双链测序.结果表明在1500bp的DNA片段中有一个完整的开读框架(ORF),其编码区是在419bp至1252bp处.其产物与已知的天蓝色链霉菌whiG的氨基酸序列有89%的同源性.当把1500bp的saw1DNA片段插入到链霉菌表达质粒载体pIJ702后,构建的重组质粒转化天蓝色链霉菌孢子形成缺陷突变株C71,可使C71形成孢子和灰色色素.用基因破坏的策略进一步研究了该基因的生物学功能,结果表明saw1在圈卷产色链霉菌气生菌丝到孢子形成的发育转变中有重要作用,是分化中控制孢子发育起始的一个重要基因.     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因—sanL的结构与功能

利用染色体步移策略,以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约10kb的DNA片段。序列分析表明此片段中除含有sanK外,在sanK的上游还有一个完整开放阅读框——sanL。sanL与sanK的转录方向相同,具有1281个核苷酸,起始密码子为345位的ATG,终止密码子为1623位的TGA。利用Blastx程序进行的分析揭示,此基因可能编码一个赖氨酸2氨基转移酶。基因功能研究表明,该基因是圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成所必需的。     

一种来源于链霉菌的纤溶酶的纯化及其基因的克隆

链霉菌C3662的发酵液上清经 80 %硫酸铵沉淀 ,DEAE Sepharose和CM Sepharose层析分离后纯化出一种纤溶酶。SDS PAGE显示为单一的条带 ,分子量约为 30kD。以 pIJ699为载体 ,S .lividansTK2 4为宿主菌 ,鸟枪法克隆纤溶酶基因 ,从 30 0 0个转化子中挑选到 1个具活性转化子 ,经亚克隆 ,序列测定得到一个 90 3bp的完整ORF ,其GC %为 68.33% ,密码子第三位GC %为 95.6% ,符合链霉菌基因的典型特征。与多种蛋白酶具有较高的同源性     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因——sanH和sanI的研究

通过反向遗传学方法克隆到圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因簇中约7.0kb的DNA片段。该片段除含有尼可霉素生物合成基因sanF外,对sanF上游约22kb的BglⅡDNA片段进行序列测定及分析表明,还含有两个完整的开放阅读框(ORF)。ORF1由1233个核苷酸组成,ORF2由195个核苷酸组成,它们分别编码由410个氨基酸残基和64个氨基酸残基组成的蛋白质,依次命名为sanH和sanI。蛋白序列数据库比较结果表明,SanH和SanI与浅灰链霉菌(\%Streptomyces griseolus)\%中共转录的细胞色素P450(cytochrome P450)和铁氧还蛋白(ferredoxin)有较高的同源性,一致性分别为46%和56%,相似性分别为62%和70%。基因功能研究表明,sanH基因的破坏虽不影响圈卷产色链霉菌产生的尼可霉素的生物活性,但该基因可能参与了尼可霉素羟基化反应的生物合成。     

牲畜链霉菌异青霉素N合成酶基因的克隆与序列分析

产生含硫卜-内酰胺类抗生素的不同微生物种属间(包括原核和真核)的异青霉素N合成酶(IPNS)基因存在着明显的同源性。利用S. lipmanii IPNS基因探针验证了牲畜链霉菌(S. cattleya)染色体DNA中确实含有与之同源的区带,通过与牲畜链霉菌无活性阻断突变株互补克隆的方法,获得了同时含有硫霉素环化酶及IPNS基因的重组质粒。经基因序列分析表明牲畜链霉菌中IPNS基因,由963bp组成,起始密码子为ATG,终止密码子为TGA,共编码321个氨基酸,所克隆的牲畜链霉菌IPNS基因编码蛋白与已知的S. clavuligerus的IPNS相似性为56％,与S. lipmanii的IPNS相似性为64％。     

CLONING AND EXPRESSION OF SPODOPTERA LITURA UBIQUITIN GENE

Abstract Ubiquitin (UBI) plays a very important role in regulated non-lysosomal ATP dependent protein degradation. In the present work, the coding sequence of Spodoptera litura UBI gene was isolated (GenBank Accession No. AF436066). The length of this ORF is 228bp, encoding a protein with Mr of 8.56 kD and isoelectric point of 6.56. Multiple sequence alignment indicated that S. litura UBI is very similar to the homologous proteins of other eukaryotic species and it has 84% identity with S. litura nucleopolyhedrovirus (SpltMNPV) UBI at amino acid level. RT-PCR analysis showed that S. litura UBI gene is ubiquitously expressed in larva tissues which are susceptible to SpltMNPV infection. By constructing E. coli expression vector, S. litura UBI was highly expressed and the recombinant protein was purified using Ni-NTA resin column, and currently further study on the function of S. litura UBI in SpltMNPV infection is underway.     

浑球红细菌谷氨酸合酶基因(glt)的克隆和图谱分析

利用转座子Tn5随机插入诱变筛选得到12株浑球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)氨同化缺陷突变株(Asm~-)。这些突变株胞内均无GOGAT活性,同时它们均无固氮酶活性(Nif~-),并且具有氮代谢多效性缺失表型(Ntr~-)。将含有Azorhizobium sesbaniae ORS571的完整glt基因的质粒pHB10转入突变株中能互补上述表型。通过筛选携带Tn5的R-prime质粒克隆了glt::Tn5片段。Southern杂交证明所克隆glt::Tn5片段与E. coli的gltBD基因有同源性。用此片段与以pLAFR3为载体所构建的R. sphaeroides 601基因文库进行菌落原位杂交筛选到了携带glt基因的cosmid pLT27。pLT27能互补所有12株R.sphaeroides氨同化缺陷突变株。酶切分析表明在该cosmid中插人的染色体DNA片段大小约为26.5kb。以pRK415为载体亚克隆了4.0kb与10.5kh的pLT27的Hindlll酶切片段,分别命名为pLTRK271与pLTRK272。pLTRK272能互补变种GT6、GT10、GT11,pLTRK…     

斜纹夜蛾泛素基因的克隆及表达

泛素介导的蛋白质降解途径对脑内蛋白的选择性降解起着重要作用。设计一对简并引物,从斜纹夜娥(Spodoptera litura)细胞中克隆了泛素基因的编码区,CenBank登录号AF436066。序列分析表明,该编码区的长度为228bp,编码由76个氨基酸组成的、分子质量为8．56kD的蛋白,其等电点为6．56。同源性比较发现,斜纹夜峨泛素基因不仅与其它真核生物的泛素基因在氨基酸水平上具有96％以上的相似性,而且与斜纹夜蛾核多角体病毒(SpltMNPV)泛素基因的同源性为84％。RT—PCR分析发现,泛素基因在所检测的斜纹夜蛾幼虫多种组织,尤其是脂肪体中均有表达。采用构建的原核表达载体pQEUB,在大肠杆菌M15中诱导并高效表达出了带有His—tag的重组融合蛋白,薄层扫描分析得知靶蛋白约占总蛋白的37％。利用Ni—NTA亲和层析胶纯化得到重组融合蛋白,经SDS—PAGE鉴定为单一区带,为进一步研究S．litura泛素在SpltMNPV感染中的作用打下了基础。     

林可链霉菌黑色素生物合成基因的克隆与表达

以pIJ702的melCl－C2基因为探针杂交林可链霉菌（Streptomyceslincolnensis）78－11染色体DNA,呈现出3．2kb的BamHI片段和2．6kb的SphI片段等一系列阳性条带。构建了含3．0～3．5kbBamHI片段的林可链霉菌78-11基因文库,从中分离克隆了黑色素生物合成基因melCl和melC2,并测定了含有mel基因的重组子pRSB336插入片段的全部DNA顺序。3152bpBamHI片段含有5个开放阅读框架,其中melCl和melC2与链霉菌属三个种的相应基因具有较高的同源性。此外,林可链霉菌78－11的melC2基因产物与人和鼠的酪氨酸酶轻微同源,分别为17．3％和24．5％。种种迹象表明,melCl、melC2和orf3组成黑色素生物合成操纵子结构。为了进一步鉴定上述克隆的林可链霉菌78-11黑色素生物合成基因,构建了分别含有新霉素抗性基因启动子和正反方向mel基因的重组质粒pPZ518和pPZ519,并转化变铅青链霉菌TK23。随机挑选的12个pPZ518转化子在R2YE培养基上均能分泌淡褐色色素,而所有的pPZ519和pES1转化子则都呈白色。