芳香族化合物生物降解的研究进展

本文综述了以苯、取代苯、联苯和多环芳烃为代表的芳香族化合物的生物降解途径,其共同之处在于经过两步双加氧酶作用,生成二醇和开环。两步双加氧酶分别为芳环羟基化双加氧酶和芳环断裂双加氧酶。以甲苯途径为代表讨论了芳香族化合物的分子生物学研究情况。代谢工程研究是九十年代兴起的芳香族化合物生物降解的研究内容,通过对甲苯途径的代谢工程研究明确了途径中的关键酶,并通过对关键酶的活性提高使整个途径的代谢流增加。     

邻苯二酚1,2-双加氧酶的结构、功能及同工酶现象研究进展

邻苯二酚是芳香族化合物多条生物降解途径中共有的一种重要的中间产物,根据开环方式的不同,可分为邻位降解途径和间位降解途径,其中邻位降解途径中的关键酶是邻苯二酚1,2-双加氧酶。本文主要综述了邻苯二酚1,2-双加氧酶的结构、酶学性质,以及它在芳香烃降解菌中存在的同工酶现象及其功能研究进展。     

环羟基化双加氧酶α亚基保守序列的克隆及基因定位

利用PCR法成功地克隆了不动杆菌 (Acinetobacter) L2菌株的环羟基化双加氧酶α亚基保守序列310 bp片段,并对其进行测序.序列分析结果表明该片段与3-苯基丙酸盐双加氧酶α亚基、苯1,2-双加氧酶α亚基、甲苯2,3-双加氧酶α亚基的氨基酸序列同源性分别为72%、75%和78%.Southern杂交将菌株L2的环羟基化双加氧酶α亚基基因定位在L2质粒的不同酶切片段上.     

PAHs降解基因及降解酶研究进展

由于环境中的多环芳烃(PAHs)具有高遗传毒性和"三致"性(致癌、致畸和致突变),其生物降解基因和降解功能酶研究备受关注.多环芳烃双加氧酶是近年来研究较多的多环芳烃降解的关键酶系之一,主要由细菌产生,可通过氧化反应使多环芳烃开环生成小分子的中间产物并最终氧化成CO2和水.目前,有关这类酶的理化性质、结构特点、功能等的研究相继开展,本文对PAHs降解基因、降解酶的研究现状与发展趋势进行综述.     

苯甲酸-1,2-双加氧酶高产菌株的筛选和发酵条件的研究

苯甲酸-1,2-双加氧酶(ECl.13.99.2)催化苯甲酸转化成邻苯二酚。该酶是微生物降解芳香烃的一个关键酶,它催化氧化开环的第一步反应,在研究微生物的芳香烃代谢中占有重要位置。近年来,发现该酶可以用来在工业上合成邻苯二酚以及消除芳环化合物的污     

Aeromonas sp.XJ-6双加氧酶基因的克隆、表达及对酪氨酸的降解

目的:从Aeromonas sp.XJ-6中克隆双加氧酶基因,初步探索该酶的功能,为芳香烃化合物的生物降解提供基因资源。方法:PCR扩增双加氧酶基因dio6,并实现该基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中的诱导表达。产物经Ni-NTA柱纯化后,通过薄层层析(TLC)和HPLC检测双加氧酶dio6对Tyr的降解效果,再结合LC-MS检测降解产物,并分析其可能的降解途径。结果:Aeromonas sp.XJ-6双加氧酶基因dio6大小为1 194bp;通过金属鳌合亲和层析(MCAC)纯化后dio6表达产物的大小为44.9k Da。双加氧酶dio6对Tyr具有较强的降解作用。TLC和HPLC检测表明,在60μl酶量和30℃反应温度等条件下,Tyr降解较快;Mg~(2+)、Ca~(2+)略微抑制酶促反应,Mn~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)、Ca~(2+)促进底物降解,其中Mn~(2+)对双加氧酶影响最大。LC-MS分析表明,在双加氧酶dio6作用下,Tyr被降解为延胡索酸。结论:Aeromonas sp.XJ-6双加氧酶dio6是一种苯环开环酶,为芳香烃化合物的生物降解提供了良好的基因资源。     

沈抚灌区广宿主石油烃代谢质粒的分离及鉴定

本研究采用“三亲配对外源分离法”,从沈抚灌区土壤、底泥和水样中共计分离得到8个广宿主（BHR）石油烃代谢质粒,并通过对其进行抗生素抗性检测和抗性遗传标记,将其转移至大肠杆菌(Escherichia coli)EC100宿主中进行操作.不相容性群分析结果表明: pS3-2C、pS4-6G为Inc P质粒;pS3-2G、pW22-3G、pA15-7G为Inc N质粒;pS7-2G 为Inc W质粒;pA23-1G和 pA10-1C为Inc Q质粒.采用PCR扩增已报道的石油烃污染物降解基因的方法初步分析其石油烃代谢功能,质粒pS3-2G、pS7-2G、pA23-1G、pW22-3G和pA10-1C上含有编码芳香环羟化双加氧酶基因(phdA)和甲苯单加氧酶基因(touA)的片段;pA15-7G含有编码甲苯双加氧酶和甲苯单加氧酶基因片段;pS3-2C含有编码芳香环羟化双加氧酶、苯双加氧酶和甲苯双加氧酶基因片段;pS4-6G仅含有编码芳香环羟化双加氧酶基因片段.通过宿主范围检测,除质粒pS3-2C外,其余7个质粒均可在变形菌纲(Proteobacteria)α-、β-、γ-亚纲的代表性菌株根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)JMP228、大肠杆菌EC100间进行转移并稳定传代.     

代谢工程改造微生物生产芳香族化合物的研究进展

芳香族化合物广泛应用于化学工业。利用代谢工程改造微生物生产各种芳香族化合物越来越受到人们的关注。通过理性改造,微生物可以定向地大量积累人们需要的各种芳香族化合物。此外,通过设计新的反应途径并引入外源基因,可以拓宽微生物生物合成的产物谱,获得某些具有重要应用价值的新的芳香族化合物。这些研究成果对解决化石能源危机和环境可持续发展问题具有积极意义。本文中,笔者主要对近年来微生物生产各种芳香族化合物的最新研究进展及相应的代谢工程改造策略进行综述,为开展相关研究提供参考。     

蜡状芽孢杆菌菌株Jp-A的分离鉴定及其降解苯酚特性

从某钢铁厂处理废水的活性污泥中驯化分离一株能高效降解苯酚的细菌（Jp-A）.通过形态观察、生理生化实验和16srRNA序列分析,初步鉴定Jp A为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）.在实验条件下,该菌在16、24和32 h内能将浓度分别为5、10和15 mmol·L^-1的苯酚完全降解,而30 mmol·L^-1的苯酚则完全抑制该菌的生长.该菌也能以甲苯、氯酚类和硝基酚类等芳香烃类物质作为唯一碳源和能源生长.双加氧酶检测表明,其通过间位途径开环裂解苯酚,该途径的关键酶邻苯二酚2,3 双加氧酶主要定位在细胞膜上,为诱导酶,补加葡萄糖能抑制该酶的产生.     

4株苯系物降解菌菌株的筛选鉴定、降解特性及其降解基因研究

分别以苯、甲苯为碳源,从厦门污水处理厂活性污泥中富集筛选获得了2株苯降解菌B1、B2和2株甲苯降解菌J2、J6。16S rRNA基因鉴定结果表明B1、J2属于假单胞菌属(Pseudomonassp.),B2、J6属于不动杆菌属(Acinetobactersp.)。研究表明,这些菌在pH7~10的碱性范围内能很好生长。在以0.1%(V/V)苯或甲苯为唯一碳源的无机盐培养基中,B1、B2菌在72小时内对苯的降解率分别为67.7%、94.2%,J2、J6菌对甲苯的降解率分别为92.4%、84.8%。简并PCR扩增、序列分析表明,这些菌含有相同的苯双加氧酶基因,表明苯降解基因在这些降解菌中可能存在水平转移。此外,J2,J6两株菌还含有甲苯双加氧酶基因,而且J2能在甲苯浓度为70%(V/V)的LB培养基中生长。这些降解菌在苯、甲苯污染的生物治理中有应用前景。     

高效菌株S对TNT的降解条件和机理初探

确立了筛选菌株S对TNT的降解条件并初步探讨了TNT的降解机理.研究表明,葡萄糖的加入显著促进了TNT的生物降解,培养16h后100mg/L的TNT去除率达100%;但不加入葡萄糖时TNT仍有12%的去除,S菌也有微量生长.硝酸钾的加入同样促进了TNT的完全降解,而不加入硝酸钾时TNT有80%的去除.TNT浓度的增加并没有影响其去除效果,高达200 mg/L的TNT仍可完全降解.TNT的降解过程包括TNT生物转化为缩合产物A和A物质的开环分解.生物催化体系中硝基还原酶、甲苯双加氧酶和邻苯二酚双加氧酶的检出为这一降解途径的存在提供了有力的酶学支持.     

邻苯二酚2,3-双加氧酶的结构和功能研究进展

邻苯二酚是所有芳香族化合物降解过程中的重要的中间产物,其降解有邻位和间位裂解两条裂解途径,分别由邻苯二酚1,2-双加氧酶(C12O)和邻苯二酚2,3-双加氧酶(C23O)催化裂解。本综述简要介绍了邻苯二酚2,3-双加氧酶的结构和功能的研究进展。     

芳香族化合物微生物代谢工程研究进展

代谢工程从20世纪90年代初期发展至今已有近30年历史,对微生物菌种改良和选育工作起到了极大的推动作用.芳香族化合物是一类可以通过微生物发酵生产的化学品,广泛应用于医药、食品、饲料和材料等领域.利用代谢工程手段对莽草酸和芳香族氨基酸合成途径进行理性改造,微生物细胞可以定向地大量积累人们需要的各种芳香族化合物.笔者对近3...     

假单胞菌甲苯双加氧酶在手性亚砜合成中的活性分析

[目的]从蒙氏假单胞菌CCTCC M2013683中克隆出甲苯双加氧酶基因,通过基因克隆与重组表达,获得重组酶,初步探讨其在手性亚砜合成中的活性。[方法]利用基因克隆技术获得甲苯双加氧酶基因的重组质粒,通过热激法转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行可溶性蛋白的诱导表达,用SDS-PAGE凝胶电泳检测可溶性蛋白的表达情况。将表达有重组蛋白的整细胞作为催化剂,催化氧化苯甲硫醚,用气相色谱检测苯甲亚砜的产率。[结果]基因tod-c1和基因tod-c2成功地连接在了p ETDUET-1载体上,重组表达菌株表达出了大量可溶性蛋白(Tod-C1/C2)。甲苯双加氧酶催化氧化2 mmol/L苯甲硫醚底物,最终得到了产率为0.6%的苯甲亚砜。[结论]获得了甲苯双加氧酶重组蛋白,并应用该蛋白催化获得了产率为0.6%的苯甲亚砜。     

人参皂苷生物合成和次生代谢工程

人参皂苷属于植物三萜皂苷类化合物,是传统名贵药材人参和西洋参的主要活性成分,具有抗炎、抗氧化作用,还有广泛的抗肿瘤作用。人参皂苷与植物甾醇共享前期代谢途径,通过2, 3-氧化鲨烯环化步骤进入三萜代谢分支途径,在三萜碳环骨架复杂修饰的基础上形成人参皂苷。综述了近年人参皂苷生物合成途径及关键酶基因研究的最新进展,揭示了人参皂苷生物合成的基本途径,对途径中关键酶的基因进行了综述,并结合次生代谢工程技术, 探讨了该技术在人参皂苷生物合成中的应用前景。     

克雷伯杆菌甘油脱氢酶和1,3-丙二醇氧化还原酶的动力学机制

本研究主要对克雷伯杆菌甘油转化1,3-丙二醇代谢途径中的2个关键酶甘油脱氢酶(GDH)、1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)反应机制和动力学进行了研究。首先,通过初速度和产物抑制动力学研究确定了GDH、PDOR双底物酶促反应机制为有序BiBi机制,明确了由反应物消耗到产物生成之间的历程。其次,建立了GDH、PDOR双底物酶促反应动力学模型,由动力学模型可知,在偶合反应中,如果GDH和PDOR酶量相同,GDH氧化反应成为限速反应,而辅酶I将主要以氧化型NAD+形式存在。动力学信息为酶法合成1,3-丙二醇和代谢工程研究提供理论指导。     

三氯卡班降解菌株Sphingomonas sp. YL-JM2C中多个邻苯二酚双加氧酶的功能

【目的】研究Sphingomonas sp.YL-JM2C菌株的生长特性,确定以三氯卡班作为碳源的生长情况。挖掘菌株YL-JM2C潜在的邻苯二酚1,2-双加氧酶及邻苯二酚2,3-双加氧酶基因,在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达邻苯二酚双加氧酶基因并研究其酶学性质。【方法】优化S.sp.YL-JM2C菌株以三氯卡班作为碳源时的培养条件,并利用全自动生长曲线测定仪测定菌株生长情况,绘制生长曲线。通过生物信息学方法挖掘潜在的邻苯二酚双加氧酶基因,并分别在Escherichia coli BL21(DE3)中进行异源表达,通过AKTA快速纯化系统纯化蛋白,分别以邻苯二酚、3-和4-氯邻苯二酚为底物检测重组蛋白的酶学特性。【结果】菌株在pH为7.0-7.5时生长最优。在以浓度为4-8 mg/L的三氯卡班做为底物时,菌株适宜生长。当R2A培养基仅含有0.01%酵母提取物和无机盐时,加入终浓度为4 mg/L的三氯卡班可促进菌株生长。挖掘到6个潜在的邻苯二酚双加氧酶基因stcA1、stcA2、stcA3、stcE1、stcE2和stcE3,表达并通过粗酶液分析证明其中5个基因stcA1、stcA2、stcA3、stcE1和stcE2编码的酶均具有邻苯二酚双加氧酶和氯邻苯二酚双加氧酶的活性;纯化酶的底物范围研究揭示了StcA1、StcA2和StcA3均属于Ⅱ型邻苯二酚1,2-双加氧酶,StcE1和StcE2为两个新型邻苯二酚2,3-双加氧酶;它们酶动力学分析研究证明了5个酶对邻苯二酚的亲和力和催化效率最高,4-氯邻苯二酚次之。【结论】在同一菌株中发现了5个具有功能的邻苯二酚双加氧酶基因,stcA1、stcA2和stcA3编码的酶均属于Ⅱ型邻苯二酚1,2-双加氧酶,stcE1和stcE2为两个新型邻苯二酚2,3-双加氧酶编码基因。5个酶均具有催化邻苯二酚和氯邻苯二酚开环反应的功能,这为更好地理解微生物基因组内代谢邻苯二酚及其衍生物氯代邻苯二酚基因的多样性奠定了基础。     

嗜盐古菌Haloferax volcanii WFD11中龙胆酸1,2-双加氧酶HagA的研究

【目的】研究嗜盐古菌Haloferax volcanii WFD11菌株以不同芳香酸作为碳源的生长情况;鉴定其通过龙胆酸途径代谢芳香酸过程中的开环酶龙胆酸1,2-双加氧酶的基因,并对其进行生化水平的研究;初步揭示古菌和细菌代谢芳香酸的可能差异。【方法】分别以4 mmol/L的6种不同芳香酸为唯一碳源培养菌株WFD11,利用全自动生长曲线分析仪测定菌株生长情况并绘制生长曲线;利用高效液相色谱检测菌株WFD11代谢3-羟基苯甲酸的中间产物;对菌株WFD11的基因组进行生物信息学分析,寻找潜在的龙胆酸1,2-双加氧酶编码基因,并在Haloferax volcanii H1424中异源表达;通过快速纯化系统(采用Ni2+-NTA亲和层析柱)纯化异源表达的蛋白,以龙胆酸为底物通过紫外分光光度计检测粗酶液和纯化后的龙胆酸1,2-双加氧酶和相关酶学特性;通过实时定量PCR观察hag A的表达类型。【结果】菌株WFD11能以4 mmol/L的3-羟基苯甲酸和3-羟基苯丙酸为唯一碳源和能源生长;高效液相色谱检测证明菌株WFD11通过龙胆酸代谢3-羟基苯甲酸(3HBA);克隆和异源表达了龙胆酸1,2-双加氧酶基因hag A;Hag A粗酶液和纯化蛋白均具龙胆酸1,2-双加氧酶的活性,催化龙胆酸开环生成顺丁二酸单酰丙酮酸;Hag A的龙胆酸1,2-双加氧酶比活力为0.024 8 U/mg,且其活性不依赖于Fe2+;荧光定量PCR实验结果证明hag A是组成型表达。【结论】嗜盐古菌H.volcanii WFD11可能是通过龙胆酸途径代谢芳香酸类物质,为进一步研究古菌和细菌代谢芳香酸的可能差异打下了基础。     

恶臭假单胞菌ND6菌株catA基因的克隆和表达及其儿茶酚裂解途径探讨

恶臭假单胞菌ND6菌株的萘降解质粒pND6-1中编码儿茶酚1,2-双加氧酶的catA基因在大肠杆菌中进行了克隆和表达,并研究表达产物的酶学性质。结果表明:酶的Km为0.019μmol/L,Vmax为1.434μmol/(min.mg);具有很好的耐热性,在50℃保温45min后仍能够保留酶活力的93.7%;Fe2 对酶活性有显著的促进作用,其比活力是对照反应的292%;酶对4-氯儿茶酚的催化活性非常低,属于Ⅰ型儿茶酚1,2-双加氧酶。以萘为底物生长时,ND6菌株的细胞提取液中既存在催化邻位裂解途径的儿茶酚1,2-双加氧酶活性,也存在催化间位裂解途径的儿茶酚2,3-双加氧酶活性。以苯甲酸、对羟基苯甲酸和苯乙酸为唯一碳源生长时,ND6菌株细胞提取液的儿茶酚1,2-双加氧酶活性远远大于儿茶酚2,3-双加氧酶活性。表明ND6菌株既能通过儿茶酚间位裂解途径降解萘,也能通过儿茶酚邻位裂解途径降解萘,而以苯甲酸、对羟基苯甲酸和苯乙酸为诱导物时只利用儿茶酚邻位裂解途径。     

1株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)1217石油降解特性及相关基因分析（英文）

从石油污染土壤中分离得到1株石油降解菌1217,经细菌形态学、生理生化及16S rD NA序列分析初步鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。在温度5~65℃,pH 2~10,盐度0~9%的条件下菌株能很好生长,在以正十二烷、正十八烷、苯、甲苯、二甲苯和萘为唯一碳源的培养基中生长良好。在10℃和30℃条件下培养7 d,对原油的降解率分别为21.57%和15.15%。菌株产生的生物表面活性剂可以将表面张力从72.20 mN/m降至35.14 mN/m。利用特异性PCR扩增,在菌株中检测到烷烃单加氧酶、甲苯双加氧酶、联苯双加氧酶、芳香烃双加氧酶和氧化还原酶基因,并成功克隆出烷烃单加氧酶和芳烃双加氧酶基因,同相关基因比对分析,与铜绿假单胞菌PAO1的相应基因相似度分别为99.91%和99.22%。研究表明,菌株在生物修复和石油烃污染环境中具有潜在的应用价值。