缺氧预处理神经干细胞移植对大鼠急性脊髓损伤后神经胶质细胞凋亡及脊髓空洞形成的影响

目的:研究缺氧预处理神经干细胞(NSCs)移植对大鼠急性脊髓损伤(ASCI)后神经胶质细胞凋亡及脊髓空洞形成的影响。方法:将30只SD大鼠分为假手术对照组;脊髓损伤组;去铁敏组;普通NSCs组;缺氧预处理NSCs组。制成脊髓损伤模型,移植后观察脊髓神经胶质细胞凋亡情况及脊髓空洞形成情况。结果:经去铁敏缺氧预处理培养的NSCs与常规培养的NSCs无明显形态学变化。移植术后7d,缺氧预处理NSCs移植能显著减少脊髓损伤周围区神经胶质细胞的凋亡数量,减少脊髓空洞形成。结论:缺氧预处理NSCs移植能明显抑制大鼠急性脊髓损伤后神经胶质细胞凋亡,减少脊髓空洞的形成。     

脊髓损伤治疗中的细胞移植策略及预处理研究进展

急性脊髓损伤是骨科常见的严重疾患,伤后神经功能恢复及重建是近年来研究的热点,其中细胞移植的研究得到广泛的关注并取得较大的研究进展。本文介绍了细胞移植治疗脊髓损伤治疗的研究现状,其中对移植细胞的来源,移植的时机,移植的途径以及细胞移植存活的问题及应对策略做了重点阐述。同时对增加移植细胞存活率的预处理方法做了简要综述。     

胚胎神经干细胞移植及胶质细胞源性神经营养因子对大鼠脊髓损伤的修复作用

将胚胎神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植至成年大鼠损伤的脊髓,观察移植后NSCs的存活、迁移以及损伤后的功能恢复。实验结果显示：动物NSCs移植4周后,斜板实验平均角度和运动评分结果比对照组均有明显增高(P＜0．05),而脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)处的空洞面积显著减小(P＜0．05);在NSCs中加入胶质细胞源性的神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)后,上述改变更加显著。移植后的NSCs不仅能存活,而且向损伤的头端和尾端迁移达3mm之远。这些结果表明,移植的NSCs不仅可以存活、迁移,还可减小SCI空洞面积,促进动物神经功能的恢复;此外,我们的结果还表明GDNF对SCI功能恢复有促进作用。     

骨髓间充质干细胞移植对急性脊髓损伤脱髓鞘病变的保护作用

骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)已被广泛应用于治疗脊髓损伤,但目前对其治疗机制了解甚少。BMSCs被移植至脊髓钳夹损伤模型大鼠,以研究其保护作用。通过LFB(Luxol fast blue)染色、锇酸染色、TUNEL(Td T-mediated d UTP nick-end labeling)染色和透射电镜对白质有髓神经纤维进行观察。免疫印迹检测BMSCs移植对脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)和caspase 3蛋白表达的影响。通过脊髓损伤后1、7、14 d三个时间点移植BMSCs并进行后肢运动评分(Basso,beattie and bresnahan;BBB评分)和CNPase(2′,3′-cyclic-nucleotide 3′-phosphodiesterase)、髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein,MBP)、caspase 3蛋白水平的检测。免疫荧光观察BMSCs移植到受损脊髓后分化情况及CNPase-caspase 3~+共表达情况。骨髓间充质干细胞移植7 d后,部分移植的BMSCs可表达神经元和少突胶质细胞标记物,大鼠后肢运动能力和髓鞘超微结构特征均明显改善。骨髓间充质干细胞移植后BDNF蛋白表达水平增加,caspase 3蛋白表达水平则降低。相对于脊髓损伤后1 d和14 d,7 d移植BMSCs后MBP和CNPase蛋白表达水平最高;caspase 3蛋白表达水平则最低。骨髓间充质干细胞移植后CNPase-caspase 3~+细胞散在分布于脊髓白质。结果表明,急性脊髓损伤后,BMSCs移植到受损脊髓有分化为神经元和少突胶质细胞的倾向,并促进BDNF的分泌介导抗少突胶质细胞凋亡而对神经脱髓鞘病变有保护作用,且最佳移植时间为脊髓损伤后7 d。     

缺氧预处理对神经干细胞间隙连接蛋白的表达及半通道功能的影响

目的:检测缺氧预处理对神经干细胞间隙连接蛋白的表达情况及半通道功能的影响,为探究缺氧预处理后神经干细胞间细胞通讯提供理论依据。方法:采用免疫组织化学方法检测对照组及缺氧预处理1小时组、缺氧预处理4小时组、缺氧预处理8小时组、缺氧预处理12小时组神经干细胞中cx43、cx36、cx47的表达情况。通过激光共聚焦激光扫描显微镜测量钙黄绿素滤过情况以评估半通道功能的变化。结果:与对照组(1.03±0.14%)比较,在0.5%氧气条件下暴露8小时(3.05±0.40%)和12小时(5.51±0.31%)的神经干细胞坏死率较显著升高(P0.05)。与对照组相比,缺氧预处理4、8、12小时组神经干细胞中cx43、cx36、cx47的表达显著增加,且随着缺氧预处理时间的延长而显著增加(P0.05)。与对照组及加入半通道阻滞剂组相比,缺氧预处理组半通道滤过功能显著增强(P0.05)。结论:缺氧预处理可以以时间依赖性方式提高神经干细胞间隙连接蛋白的表达和半通道滤过功能。神经干细胞暴露于低氧环境而不引起坏死显著增加的最佳时间为4小时。     

新生大鼠脊髓神经干细胞的分离培养及鉴定

目的　从新生大鼠的脊髓中分离培养神经干细胞并观察其增殖和分化能力。方法　采用细胞培养技术结合间接免疫荧光细胞化学法。结果　分离的细胞生长旺盛 ,单克隆化生成的细胞团 ,BrdU掺入呈强阳性。分离培养获得的细胞团呈Nestin强阳性 ,至今已在体外连续传代 8个月。培养的细胞团经 1%小牛血清诱导可分化为神经元和星形胶质细胞。结论　成功分离培养了新生大鼠脊髓神经干细胞     

G-CSF对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡及caspase-3表达的影响

目的:通过观察粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对大鼠急性脊髓损伤后神经细胞凋亡及Caspase-3的表达的影响,探讨其对脊髓保护的作用机制.方法:32只Vistar大鼠随机分成2组:对照组和治疗组,每组16只,采用改良的Allen's装置制成大鼠急性脊髓损伤模型.在术前及术后对大鼠进行BBB功能评分观察大鼠的神经功能变化;用免疫荧光法检测脊髓损伤后个时间点Caspase-3表达;原位脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Tunel法)检测凋亡细胞.结果:大鼠急性脊髓损后Caspase-3表达与细胞凋亡均呈现先升高后下降的趋势,损伤后3d可见大量的Caspase-3和TUNEL阳性细胞,7d时达到高峰,此后表达逐渐减少,21d时仍可见少量阳性细胞.与对照组比较,G-CSF治疗组各时间点Caspase-3表达和细胞凋亡显著降低,功能恢复显著优于对照组,差异具有统计学意义.结论:G-CSF可以减轻大鼠脊髓损伤后的神经元凋亡,从而发挥神经保护作用,其作用可能是通过抑制Caspase-3的表达使脊髓损伤周围神经细胞凋亡显著下降而实现的.     

小鼠脊髓损伤模型的建立及神经干细胞移植后运动功能恢复情况的研究

目的制作小鼠脊髓损伤打击模型,观察神经干细胞(NSCs)移植对脊髓损伤小鼠运动功能恢复及Nestin表达的影响。方法将50只小鼠随机分为空白组(5只)、模型组(15只)、对照组(15只)、治疗组(15只),运用改良Allen's法制备小鼠T10脊髓损伤模型并立即在损伤节段进行NSCs移植,于损伤后1、3、7、14、21d进行BBB评分,并通过免疫荧光法及荧光定量PCR检测Nestin的表达情况。结果所有脊髓打击后小鼠均出现双后肢瘫痪,但随时间延长运动功能可有不同程度恢复,NSCs移植14d后治疗组较模型组及对照组BBB评分显著增高(P0.05),且治疗组Nestin表达量也高于模型组及对照组。结论成功建立了小鼠脊髓损伤打击模型;移植的外源性神经干细胞在脊髓损伤处存活并促进损伤后小鼠运动功能的恢复。     

钙离子与缺氧性神经干细胞凋亡的相关性研究

目的检测钙离子浓度在缺氧性神经干细胞凋亡过程中的变化,以探讨缺氧性神经干细胞凋亡的发生机制。方法从大鼠胚胎神经管获取神经干细胞,经无血清悬浮培养技术获得神经球。对所获神经球行干细胞克隆试验、Br-dU掺入标记试验、nestin、NSE和GFAP免疫荧光染色,以确认神经干细胞的生物学特性。三气培养箱予以缺氧干预,按缺氧程度分为5%O2组、10%O2组和正常对照组(20%O2),每个实验组又依缺氧干预时间的不同,分为24h、48h、72h、96h、120h5个亚组。用激光扫描共聚焦显微镜和Fluo-3荧光探针标记技术检测神经干细胞内钙离子浓度;采用An-nexinⅤ-FITC/PI检测细胞凋亡率。结果5%O2120h组和10%O2120h组中神经干细胞凋亡率显著高于正常对照组和其他缺氧干预组,并且伴随有胞内钙超载。结论细胞内钙超载可能是缺氧性神经干细胞凋亡机制中的一个重要环节。     

缺氧培养对大鼠神经干细胞体外增殖影响及其机制的研究

目的：研究应用缺氧对体外培养的大鼠神经干细胞增殖的影响。方法：将细胞分为4小时缺氧组、12小时缺氧组、促红细胞生成素（EPO）中和抗体组、IgG组以及对照组．测定大鼠神经干细胞经缺氧培养后的各组细胞克隆形成率以及EPO的表达变化。结果：单细胞培养条件下,与对照组相比,4小时缺氧组和IgG组克隆形成率明显增高;中和抗体组无明显变化;12小时组克隆形成率降低。但无统计学意义。缺氧4小时后,EPO蛋白在预处理后即刻出现表迭,4h达高峰,8h仍有部分表达。结论：短时间缺氧可以促进神经干细胞增殖．长时间缺氧则作用相反。缺氧对NSCs增殖作用的影响可能是由EPO介导产生。     

低氧与心肌细胞凋亡

细胞凋亡是心肌细胞低氧损伤的主要死亡形式之一。低氧引起心肌细胞凋亡可以通过外部的死亡受体通路以及内部的线粒体通路,两条通路之间又存在复杂的交互作用,其中,线粒体通路在低氧诱导的心肌细胞凋亡中起重要作用。另外,心肌细胞本身也具有多种内源性的凋亡抑制因子。因此,低氧时心肌细胞凋亡的产生是多种因素综合作用的结果,Bcl-2家族蛋白、线粒体通透性改变、细胞色素c的释放以及caspases的活化等参与了低氧引起的心肌细胞凋亡的调控。对低氧时心肌细胞凋亡的认识和深入研究,为人类在缺血性心脏病的防治中提供了一个新的治疗措施。     

Nur77 在缺氧/ 复氧诱导的心肌细胞凋亡中的作用及其机制的研究

目的:观察Nur77通过线粒体转位对缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞凋亡的影响。方法:原代培养l-2天SD大鼠心肌细胞,建立H/R模型。随机分为正常对照组、H/R组、Nur77组,采用免疫荧光检测横纹肌肌动蛋白(α-actin)鉴定心肌细胞;采用TUNEL染色法及Caspase-3酶活性检测心肌细胞凋亡情况;采用Western blot检测细胞核及线粒体Nur77蛋白表达、线粒体及胞浆Omi/HtrA2蛋白表达。结果:H/R组细胞核中Nur77蛋白表达明显低于正常对照组;而在线粒体中则相反。Nur77组线粒体中的Omi/HtrA2蛋白表达明显低于正常对照组;而在胞浆中则相反。结论:在心肌细胞H/R损伤时,Nur77线粒体转位促使Omi/HtrA2蛋白从线粒体释放入胞浆,从而导致心肌细胞凋亡。     

Prenatal Hypoxia Is Associated with Long-Term Retinal Dysfunction in Rats

Background

Intra-uterine growth restriction (IUGR) has been associated with increased predisposition to age-related complications. We tested the hypothesis that rat offspring models of IUGR would exhibit exacerbated, age-related retinal dysfunction.

Methods

Female Sprague-Dawley rats (maintained at 11.5% O₂ from gestational day 15 to 21 to induce IUGR) and control offspring (maintained at 21% O₂ throughout pregnancy) had retinal function assessed at 2 months (young) and 14 months of age (aged) with electroretinogram (ERG) recordings. Retinal anatomy was assessed by immunofluorescence.

Results

Deficits in rod-driven retina function were observed in aged IUGR offspring, as evidenced by reduced amplitudes of dark-adapted mixed a-wave V_max (by 49.3%, P<0.01), b-wave V_max (by 42.1%, P<0.001) and dark-adapted peak oscillatory potentials (by 42.3%, P<0.01). In contrast to the rod-driven defects specific to aged IUGR offspring, light adapted ERG recordings revealed cone defects in young animals, that were stationary until old age. At 2 months, IUGR offspring had amplitude reductions for both b-wave (V_max by 46%, P<0.01) and peak oscillatory potential (V_max by 38%, P<0.05). Finally, defects in cone-driven responses were further confirmed by reduced maximal photopic flicker amplitudes at 2 (by 42%, P<0.001) and 14 months (by 34%, P = 0.06) and critical flicker fusion frequencies at 14 months (Control: 42±1 Hz, IUGR: 35±2 Hz, P<0.05). These functional changes were not paralleled by anatomical losses in IUGR offspring retinas.

Conclusions

These data support that the developing retina is sensitive to stressors, and that pathways governing cone- and rod-driven function differ in their susceptibilities. In the case of prenatal hypoxia, cone- and rod-driven dysfunction manifest at young and old ages, respectively. We must, therefore, take into account the specific impact that fetal programming might exert on age-related retinal dystrophies when considering related diagnoses and therapeutic applications.     

Enhanced Synaptic Vesicle Traffic in Hippocampus of Phenytoin-Resistant Kindled Rats

Aim: Intractable epilepsy is characterized of seizure resistance to the anti-epileptic drugs. The underlying mechanisms are still elusive. Alterations of synaptic vesicle traffic may be one of the candidate mechanisms. Methods: Phenytoin-resistant and phenytoin-non resistant epileptic rats were selected in the amygdala kindled adult male Wistar rats. Synaptotagmin-I and clathrin were determined by cDNA microarry analysis and Western blotting in the hippocampus of phenytoin-resistant and phenytoin-nonresistant kindled rats, which were associated with the exocytosis and endocytosis of the synaptic vesicle traffic. Results: Microarry analysis showed both synaptotagmin-I and clathrin mRNA were up-regulated at least 3.06 fold accompanied with their correspondent proteins increased by 52.3 ± 6.4 % and 76.7 ± 12.4 % respectively in the hippocampus of phenytoin-resistant rats as compared with those in phenytoin-nonresistant rats. There were no significant differences in plasma phenytoin concentrations between the two groups. Conclusions: The increased expressions of synaptotagmin-I and clathrin in the hippocampus of phenytoin-resistant kindled rats play a role in the development of intractable epilepsy.     

CircITGA7对缺血性心律失常大鼠心肌细胞凋亡的影响

研究环状RNA ITGA7(circITGA7)在心律失常大鼠心肌细胞中的表达,并探讨其对心律失常大鼠心肌细胞凋亡的影响及机制。40只SPF级SD雄性大鼠,分为4组,分别为假手术组、心律失常组、circITGA7干扰心律失常组和对照干扰心律失常组,尾静脉注射circITGA7干扰腺相关病毒构建circITGA7干扰大鼠模型,并通过手术结扎冠状动脉前降支建立缺血性心律失常大鼠模型。通过荧光定量PCR法(Q-PCR)检测circITGA7在心律失常大鼠心肌组织中的表达水平。分别检测circITGA7对心律失常大鼠心肌氧化应激和凋亡的影响;Western blotting检测circITGA7对心律失常大鼠心肌细胞p-AKT和ITGA7蛋白表达的影响。Q-PCR结果显示circITGA7在心律失常大鼠心肌组织中的表达显着高于假手术组大鼠;与对照干扰心律失常组比较,circITGA7干扰心律失常组大鼠心律失常评分显著降低,差异具有统计学意义(p<0.01)。与假手术组比较,心律失常组大鼠心肌细胞SOD活力显著降低,MDA含量显著升高;与对照干扰心律失常组比较,circITGA7干扰心律失常组大鼠心律失常组大鼠心肌细胞SOD活力显著升高,MDA含量显著降低,差异具有统计学意义(p<0.01)。TUNEL检测结果显示,与假手术组比较,心律失常大鼠心肌细胞凋亡程度显著升高;与对照干扰心律失常组大鼠比较,circITGA7干扰心律失常组大鼠心肌细胞凋亡率为显著降低(p<0.01);Western blotting结果显示,与假手术组比较,心律失常大鼠心肌细胞p-AKT和ITGA7的蛋白表达水平均显著升高;与对照干扰心律失常组比较,circITGA7干扰心律失常组大鼠心肌细胞p-AKT和ITGA7的蛋白表达水平均显著下降(p<0.01)。干扰circITGA7能够抑制AKT路径,抑制心律失常大鼠心肌细胞氧化应激和细胞凋亡,缓解大鼠心律失常。     

The Soluble Guanylate Cyclase Stimulator Riociguat Ameliorates Pulmonary Hypertension Induced by Hypoxia and SU5416 in Rats

Background

The nitric oxide (NO)–soluble guanylate cyclase (sGC)–cyclic guanosine monophosphate (cGMP) signal-transduction pathway is impaired in many cardiovascular diseases, including pulmonary arterial hypertension (PAH). Riociguat (BAY 63–2521) is a stimulator of sGC that works both in synergy with and independently of NO to increase levels of cGMP. The aims of this study were to investigate the role of NO–sGC–cGMP signaling in a model of severe PAH and to evaluate the effects of sGC stimulation by riociguat and PDE5 inhibition by sildenafil on pulmonary hemodynamics and vascular remodeling in severe experimental PAH.

Methods and Results

Severe angioproliferative PAH was induced in rats by combined exposure to the vascular endothelial growth factor receptor antagonist SU5416 and hypoxia (SUHx). Twenty-one days thereafter rats were randomized to receive either riociguat (10 mg/kg/day), sildenafil (50 mg/kg/day) or vehicle by oral gavage, for 14 days until the day of the terminal hemodynamic measurements. Administration of riociguat or sildenafil significantly decreased right ventricular systolic pressure (RVSP). Riociguat significantly decreased RV hypertrophy (RVH) (0.55±0.02, p<0.05), increased cardiac output (60.8±.8 mL/minute, p<0.05) and decreased total pulmonary resistance (4.03±0.3 mmHg min⁻¹ ml⁻¹ 100 g BW, p<0.05), compared with sildenafil and vehicle. Both compounds significantly decreased the RV collagen content and improved RV function, but the effects of riociguat on tricuspid annular plane systolic excursion and RV myocardial performance were significantly better than those of sildenafil (p<0.05). The proportion of occluded arteries was significantly lower in animals receiving riociguat than in those receiving vehicle (p<0.05); furthermore, the neointima/media ratio was significantly lower in those receiving riociguat than in those receiving sildenafil or vehicle (p<0.05).

Conclusion

Riociguat and sildenafil significantly reduced RVSP and RVH, and improved RV function compared with vehicle. Riociguat had a greater effect on hemodynamics and RVH than sildenafil.     

缺氧对食管癌细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨缺氧对人食管癌细胞Eca109增殖及凋亡的影响及其作用机制,为食管癌的诊断和治疗提供新的思路和路径。方法:以终浓度为250μmol/L氯化钴模拟缺氧环境,将人食管癌细胞Eca109于常氧及缺氧条件下分别培养12 h、24 h、36 h、48 h,采用倒置相差显微镜观察细胞生长情况,MTT法检测细胞增殖情况,利用细胞活力分析仪NC-3000检测各组细胞凋亡情况。结果:相对于常氧对照组而言,缺氧后各组Eca109细胞增殖减弱,凋亡细胞比率明显升高,其中以缺氧24 h的凋亡细胞比率最高,缺氧36 h的凋亡细胞比率较缺氧24 h时有所回落。结论:缺氧可以抑制人食管癌细胞Eca109的增殖并诱导其凋亡。     

雷帕霉素对低氧下人HL-60细胞增殖和凋亡的影响

本研究拟通过小分子化合物氯化钴（CoCl2）模拟的低氧环境,探讨雷帕霉素（RPM）对该低氧下人急性髓细胞白血病HL-60细胞的生物学行为的影响。低氧模拟组、低氧雷帕霉素处理组、常氧雷帕霉素处理组HL-60细胞分别采用CoCl2、CoCl2／RPM、RPM进行处理,对照组为常氧下常规培养的HL-60细胞,处理及培养24h、48h、72h后收集细胞,采用倒置相差显微镜观察细胞生长状况,常规瑞氏染色后光学显微镜下观察细胞形态;MTT比色法检测各组细胞的活性和增殖能力;AnnexinV—FITC／PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡。结果表明,与对照组细胞形态规则,胞核呈圆形或椭圆形相比,低氧模拟组和低氧雷帕霉素处理组细胞密度降低,生长明显受抑,细胞胞核呈不规则形或杆状,染色质粗糙,伴扭曲折叠等变化。各组间不同时问细胞增殖抑制率差异显著（P〈0．05）,低氧模拟组和低氧雷帕霉素处理组增殖抑制率随着处理时间延长而增大,且低氧雷帕霉素处理组的增殖抑制率大于低氧模拟组。与常氧下的对照组及雷帕霉素处理组比较,低氧的模拟组和雷帕霉素处理组诱导细胞发生较明显的凋亡,且后期72h低氧雷帕霉素处理组凋亡率显著高于模拟低氧处理组。以上结果表明,模拟低氧环境下,HL-60细胞生长明显受抑制,且诱导细胞凋亡;雷帕霉素可增强对低氧对细胞的生长抑制和诱导凋亡作用。     

急性胰腺炎大鼠腺泡细胞凋亡及X连锁凋亡抑制蛋白XIP的表达

目的:研究急性胰腺炎(AP)大鼠腺泡细胞凋亡,X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的表达及其与疾病严重程度的关系。方法:通过胰胆管逆行注射不同浓度的牛黄胆酸钠,制备急性水肿型胰腺炎(AEP)和急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠模型,同时设假手术(SO)组为对照。收集各模型组3,6和12h标本,对胰腺组织进行病理学评分,并测定血清淀粉酶和腹水量;用TUNEL染色检测胰腺腺泡细胞的凋亡,分别RT-PCR和Western Blotting法测定大鼠胰腺组织XIAP mRNA及蛋白的表达。结果:成功建立了大鼠AP模型。同SO组相比,ANP和AEP组胰腺组织在各时间点均有不同程度的病理损害,血清淀粉酶也显著增高(P均<0.01)。且ANP组显著高于AEP组(P均<0.01)。造模成功3h后,各组大鼠胰腺腺泡细胞均出现少量凋亡,但ANP和AEP组凋亡显著多于SO组(P<0.05),ANP和AEP组间没有差别(P>0.05)。同SO组相比,ANP和AEP组在6h和12h时凋亡均增多(P<0.01),且AEP组显著高于ANP组(P<0.01)。造模成功3h后,各模型组XIAP mRNA表达没有差异(P>0.05);6h和12h时AEP组XIAP mRNA表达明显下降,而ANP组明显升高,两组间差异有显著性(P<0.01)。XIAP蛋白表达水平与mRNA表达水平相一致。结论:急性胰腺炎大鼠胰腺组织XIAP表达与腺泡细胞凋亡情况相反,且与疾病严重程度平行。XIAP可能负性调控AP大鼠胰腺腺泡细胞的凋亡。