新疆土著大豆根瘤菌种群遗传结构的初步分析

应用重复序列REP（repetitive extragenic palindromic,重复基因外回）和ERIC（ente-robaterial repetitive intergenic consensus,肠细菌重复基因间共有序列）结合聚合酶链式反应（ERP－PCR和ERIC－PCR）对从新疆有集的27株土大豆根瘤菌染色体进行指纹分析,发现在相似水平0.5时可基本分为两大聚类群,一个类群主要包括慢生型根瘤菌,另一类群为快生型根瘤菌,来自同一地区的根瘤菌具有较高的遗传相似性,以上结果表明该技术中对大豆根瘤菌进行种群结构和遗传多样性分析的有效手段。     

碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌基因型检测及同源性分析

目的了解福建医科大学附属第一医院耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（KPC）的耐药基因分型及同源性分布情况。方法收集临床分离的29株KPC,改良Hodge试验检测碳青霉烯酶表型。PCR检测碳青霉烯酶blaKPC、blaIMP-1、blaVIM-1、blaOXA-48及blaNDM-基因;阳性结果进行DNA测序,并进行BLAST比对确定其基因型。采用肠杆菌科基因间重复序列（ERIC—PCR）对KPC进行同源性分析。结果29株KPC中Hodge试验阳性27株,阳性率为93．1％（27／29）。PCR扩增和DNA测序显示28株为blaKPC-2,株为blaIMP-1,未检出blaVIM-2、blaOXA-48和blaNDM-1基因。同源性分析发现KPC主要存在两种型别：28株A1和1株A2。结论blaKPC-2型碳青霉烯酶是该院KPC的主要型别,A1型已在该院流行,应加强院感监测和预防。ERIC—PCR是一种简便、快捷的基因分型技术,适合同源性的初步分型筛查。     

重复序列ERIC(IRU)研究进展

重复序列几乎存在于所有生物的基因组中。"肠道细菌基因间重复序列"(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus,ERIC)是主要存在于肠道细菌的一类基因间重复序列,也称为"基因间重复单位"(Intergenic Repetitive Unit,IRU)。ERIC(IRU)首先在大肠杆菌(Escherichia coli)中发现,后来又在多种其他细菌中发现。ERIC(IRU)长127bp,有的还有插入序列。绝大多数ERIC(IRU)都可以转录,mRNA形成茎环结构。ERIC(IRU)局限于基因组可转录区,即多顺反子操纵子基因间区域,或开放阅读框架上、下游非翻译区。ERIC(IRU)很可能调节侧翼基因(flanking gene)的表达。ERIC(IRU)高度保守,可能其变异受到自然选择压力的限制或它本身就可能是"自私的DNA"(selfish DNA)。Versalovic等建立起ERIC-PCR,它可以有效地同时平行分析不同生态系统的结构差异以及动态监测同一生态系统微生物群落结构的变化。近年来这一技术逐渐运用到对动物肠道菌群的研究上。     

黑木相思根瘤菌的系统发育分析及其结瘤效果研究

【目的】针对采集自福建、广东的34株黑木相思根瘤菌进行分类研究,进一步确定其分类地位,丰富我国黑木相思根瘤菌种质资源。【方法】对选取的34株菌株测定了16S rRNA基因、持家基因atpD和glnII序列,以14株菌为代表菌株分析其系统发育情况。而且选取了部分菌株进行结瘤实验。【结果】16S rRNA基因以及持家基因atpD和glnII的系统发育分析结果与16S rRNA PCR-RFLP分型结果基本一致,14株代表菌株被分为10个不同的类群,其中有2个群组属于中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium),其余群组属于慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)。结瘤试验证明,相关的供试根瘤菌能与黑木相思、银合欢、南洋楹和网脉相思结瘤共生,显示出较广的宿主范围,且对黑木相思和银合欢的促生效果较明显。【结论】研究发现黑木相思根瘤菌具有丰富的遗传多样性和共生多样性。     

海南快生根瘤菌I66的部分16S rRNA序列测定

与豆科植物共生固氮的根瘤菌目前有4个属、10个种.包括Rhizobium(6个种),Sinorhizobium(2个种),Azorhizobium(1个种)和Bradyrhizobium(1个种).其中多数是近年来采用现代分类技术分析后建立的,而且新的类群还在不断被发现.在以前的根瘤菌数值分类及DNA-DNA杂交研究中,我们确定了海南慢生型根瘤菌属于大豆慢生根瘤菌种(B.japonicum).而海南快生型根瘤菌的分类地位则较为分散.其中一些菌株属于已知各根瘤菌种,另有4株银合欢根瘤菌和13株来自不同寄主的菌株分别构成具有独立的分类地位的两个菌群(第2群和第4群)(待发表).为了进一步明确它们的分类地位,我们依据国际系统细菌学委员会根瘤菌分委员会的建议,利用Young等建立的聚合酶链反应(PCR)及测序技术,对第4群的代表菌株166的部分16SrRNA基因片段进行了扩增和测序.     

湖北地区快生型大豆根瘤菌的质粒及结瘤基因的初步定位

从湖北省潜江县和监利县的4个采集点分离纯化了26株快生型大豆根瘤菌。质粒分离分析结果表明:所测快生型大豆根瘤菌中均有1—3条质粒带,分子量范围在50—300 Md之间。从26株快生型大豆根瘤菌中,选出分属两个血清型的5个菌株,依据根瘤菌nodABC基因在所有根瘤菌种中的结构同源性,对快生型大豆根瘤菌的结瘤基因(nod)进行了初步定位,其结果表明:R173、X143、B21、B2,D13菌株的质粒DNA中没有与nod ABC基因同源的片段存在,而R173、X143、B21、D13菌株的总DNA中含有部分no     

黑木相思根瘤菌遗传多样性

[目的]研究分离自广东、福建、江西等15个地点的174株黑木相思(Acacia melanoxylon)根瘤菌的遗传多样性.[方法]采用16S rDNA限制性片段长度多态性分析(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)和16S rDNA基因、持家基因(recA、atpD、glnⅡ)系统发育分析的方进行研究.[结果]16S rDNAPCR-RFLP分析中,在70％的相似性水平上,所有供试菌株分成9个类群 ;16S rDNA基因和持家基因系统发育分析结果基本一致,34株代表菌株主要分布在α-变形菌纲(Alpha-Proteobacteria)的慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、根瘤菌属(Rizobium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium),并与Bradyrhizobium liaoningense、Bradyrhizobium betae、Bradyrhizobium cytisi、Rizobium multihospitium、Mesorhizobium plurifarium亲缘关系较近.[结论]供试菌株被鉴定到属的水平,Bradyrhizobium、Rhizobium或Mesorhizobium为优势菌群,证明了黑木相思根瘤菌具有丰富的遗传多样性.     

湖北地区暴发病池塘中嗜水气单胞菌的遗传多样性和毒力特征研究

为了调查引起鱼类运动型气单胞菌败血症(俗称暴发病)的嗜水气单胞菌的遗传多样性和毒力特征, 阐明其流行规律, 研究于2006-2009年度从湖北省内3个不同地区的6个发病鱼塘中分离了30株嗜水气单胞菌, 其中20株为临床株(分离自血液、肝脏、肾脏或腹水), 6株为肠道株, 4株为池水株。基于所有菌株gyrB基因序列, 构建了系统发育树; 通过ERIC (Enterobacterial repetitive intergenic consensus, 肠道细菌基因间重复序列)指纹图谱进行菌株的遗传分型; 用PCR方法检测了7个毒力基因在菌株中的分布模式。这7个基因包括气溶素(aerA)、溶血素(hlyA)、热不稳定性细胞兴奋性肠毒素(alt)、热稳定性细胞兴奋性肠毒素(ast)、弹性蛋白酶(ahpB)、脂酶(lip)和鞭毛基因(fla)。此外, 以斑马鱼为感染对象, 通过腹腔注射测定了15株代表菌株的毒力。结果表明: 不同来源的20株临床株、1株肠道株和3株池水株具有相同的遗传特性, 体现为在系统树上聚为一枝, 序列相似性为100%, 具有相同的ERIC指纹图谱, 毒力基因分布模式为: aerA+hlyA+alt+ast+ahpB+lip+fla+, 且均为强毒株(LD50 9.74104cfu/尾)。与临床株相比, 其余5株肠道株和1株池水株或具有不同的ERIC指纹图谱或具有不同的毒力基因分布模式, 显示出了遗传多样性, 且毒力均弱于临床株(LD501.01106cfu/尾)。这说明在一定时间、一定区域内, 作为暴发病病原的嗜水气单胞菌为同一克隆系在流行, 不存在明显的变异或遗传多样性。此结果有助于阐明嗜水气单胞菌引起的暴发病的流行规律, 制定相应的防御措施。多种毒力基因在致病性菌株中的联合流行为发病机理的解析奠定了基础。此外, 鉴于毒力基因谱与致病性之间的相关性, 表明毒力基因可作为标记基因, 用于致病性菌株的检测。       

耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌同源性及生物膜形成能力分析

分析耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(Carbapenem Resistant Acinetobacter baumannii,CRAB)的同源性,测定其生物膜形成能力,分析blaOXA基因携带与生物膜形成能力的相关性,探讨CRAB在医院暴发的影响因素。收集佳木斯大学附属第一医院非重复CRAB共35株,全自动微生物鉴定系统VITEK-II及体外敏感实验筛选CRAB,多序列位点分型(MLST)、肠道细菌基因重复序列聚合酶链式反应(ERIC-PCR)分析其同源性,结晶紫染色法定量检测生物膜形成能力。33株CRAB为ST 2型,1株ST 671型,1株ST 1199型为新发现的MLST分型。ERIC可分为A、B、C、D四型,A型9株,B型24株,C型1株,D型1株。CRAB及碳青霉烯类敏感鲍曼不动杆菌(CSAB)组生物膜形成能力差异有统计学意义(0.330±0.258、0.534±0.402,P0.05);blaOXA-23、blaOXA-51、blaOXA-24基因携带与CRAB生物膜形成能力无明确相关性(P0.05)。生物膜形成能力与碳青霉烯类耐药性的获得呈现负相关。ERIC-PCR分辨率较强,且与MLST具有一定相关性。ST2型为主要流行菌株,患者的高危因素以及医护人员的消毒意识可能与CRAB的暴发有关。     

副溶血性弧菌重复序列-PCR分型研究

利用基因外重复回文序列-PCR(REP-PCR)和肠细菌基因间共有重复序列-PCR(ERIC-PCR)技术,对副溶血性弧菌进行了分子分型研究和亲缘关系的探讨,并使用Hunter和Gaston方法计算分辨力指数.结果显示40株副溶血性弧茵分离株均可扩增产生可重复的DNA指纹图谱,并且不同菌株基因组DNA的扩增条带具有多态性.根据SPSS10.0软件得出的树状图结果,REP-PCR可以把40株茵分为21个型,分辨力指数可达到0.953,优势菌型为G1型;ERIC-PCR可将40株菌分成4个型,分辨力指数为0.5.研究显示重复序列-PCR方法可以用于该菌分型分析,REP-PCR具有较好的分型能力.在两种PCR的DNA指纹图谱中,血清型O1群与O3群主条带均非常相似,表明它们之间亲缘关系密切.     

副溶血性弧菌重复序列-PCR分型研究

利用基因外重复回文序列-PCR(REP-PCR)和肠细菌基因间共有重复序列-PCR(ERIC-PCR)技术, 对副溶血性弧菌进行了分子分型研究和亲缘关系的探讨, 并使用Hunter和Gaston方法计算分辨力指数。结果显示40株副溶血性弧菌分离株均可扩增产生可重复的DNA指纹图谱, 并且不同菌株基因组DNA的扩增条带具有多态性。根据SPSS10.0软件得出的树状图结果, REP-PCR可以把40株菌分为21个型, 分辨力指数可达到0.953, 优势菌型为G1型; ERIC-PCR可将40株菌分成4个型, 分辨力指数为0.5。研究显示重复序列-PCR方法可以用于该菌分型分析, REP-PCR具有较好的分型能力。在两种PCR的DNA指纹图谱中, 血清型O1群与O3群主条带均非常相似, 表明它们之间亲缘关系密切。     

根瘤菌新类群代表菌株的16SrDNA全序列测定及其系统发育地位

用双脱氧法测定了一个根瘤菌新类群代表菌株SH2672的16S rDNA全序列,将此全序列与根瘤菌各已知种及相关种的16S rDNA全序列进行了比较及聚类分析,得到系统发育树状图。在系统发育树状图中,菌株SH2672与百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti),华癸中慢生根瘤菌(M. huakuii)、天山中慢生根瘤菌(M. tianshanense)、地中海中慢生根瘤菌(M. mediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(M. ciceri)共同构成一个分支,与各已知种的模式菌株16S rDNA相似性分别为:96.3％,96.4％,97.2％,95.1％,95.6％,均在95％以上,它们应归属于同一属。且分支内各种间DNA同源性低于70％,表明它们分别为不同的种,菌株SH2672代表着一个新的根瘤菌种。     

采用PCR-RFLP技术在不同水平上鉴定大豆根瘤菌

采用16S rRNA基因PCR扩增与限制性酶切片段多态性分析(RFLP)技术对选自弗氏中华根瘤菌(S.fredii)、大豆慢生根瘤菌(B.japonicum)和埃氏慢生根瘤菌(B.elkanii)的19株代表菌进行了比较分析,根据用3种限制性内切酶的RFLP分析结果,可将供试菌株分为S.fredii,B.japonicum, B.elkanii Ⅱ和B.elkanii Ⅱa等4种基因型。各类菌株之间没有交叉,因此本研究采用的PCR-RFLP技术不失为一种快速鉴别大豆根瘤菌的新方法。采用本技术已将分离自中国的22株快生菌和19株慢生菌分别鉴定为S.fredii和B.japonicum。对供试参比菌株和野生型菌株进行的16S～23S基因间隔DNA(IGS)的PCR-RFLP分析结果表明：S.fredii和B.japonicum菌株的IGS长度不同,所有供试S.fredii菌株的IGS为2.1 kb,而供试B.japonicum菌株则为2.0 kb。依据RFLP的差异,可将来自中国两个不同地区的S.fredii株区分为2个基因型,而来自中国东北黑龙江地区的19株B.japonicum菌株则可分为11个基因型。对上述野生型菌株还进行了REP-PCR和ERIC-PCR分析并确定其具有菌株水平的特异性。     

山蚂蝗慢生根瘤菌的遗传多样性及系统发育

摘要:【目的】研究我国亚热带和温带地区与山蚂蝗共生的慢生根瘤菌遗传多样性和系统发育。【方法】采用BOX-PCR 和多位点基因序列分析(nifH,nodC 和recA 基因) 方法对分离自我国不同地区的29 株山蚂蝗慢生根瘤菌进行遗传多样性和系统发育分析。【结果】BOX-PCR 分析表明供试的山蚂蝗慢生根瘤菌形成25个基因遗传型,具有丰富的基因组多样性。多位点基因序列分析发现代表菌株位于慢生根瘤菌的3 个分支上,分别与埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii) ,大豆慢生根瘤菌( Bradyrhizobium japonicum) 和圆明慢生根瘤菌(Bradyrhizobium yuanmingense) 亲缘关系近。【结论】我国山蚂蝗慢生根瘤菌具有丰富的遗传多样性,共生基因系统发育分析表明它们多与持家基因共同进化,并以垂直进化为主。     

甘草根瘤菌的16S rDNA全序列测定及系统进化分析

通过对西北干旱半干旱地区68株甘草根瘤菌的表型多样性和抗逆性分离研究,发现1个新类群和1个具有较高抗逆性的菌株。对其中心菌株CCNWGX022和高抗性菌株CCNWGX035进行16S rDNA全序列测定及系统进化研究。结果表明,CCNWGX022和CCNWGX035与中慢生根瘤菌属内参比菌株的16S rDNA相似性分别大于96．8％和98．3％,因此它们均属于中慢生根瘤菌属。     

黄华属根瘤茵的16S rDNA-RFLP分析

采用16S rDNA-RFLP及序列分析方法,对分离自黄华属的披针叶黄华、喀什黄华和光叶黄华根瘤菌进行分析研究.结果表明,分离得到的33株根瘤菌在种水平上具有丰富的遗传多样性,它们分别归属于中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、根瘤菌属(Rhizobium)和土壤杆菌属(Agrobacterium).其中,以CCNWGS0011和CCNWGS0010-1为代表的5株根瘤菌构成独立的分支,可能为潜在的新种.     

中华苜蓿根瘤菌噬菌体的分离及主要壳蛋白基因g23的系统进化分析

【目的】揭示苜蓿根瘤菌噬菌体的形态学特征及主要壳蛋白g23基因的分布地位,为根瘤菌噬菌体的生态学研究提供数据支持。【方法】以中华苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti USDA1002T)为宿主,采用双层平板法分离土壤环境中的苜蓿根瘤菌噬菌体,利用电子显微镜观察纯化的噬菌体形态特征;提取噬菌体DNA,PCR扩增编码噬菌体壳蛋白的g23基因,构建系统进化树,以形态学鉴定和分子生物学相结合的方法,明确分离获得的苜蓿根瘤菌噬菌体g23基因的系统进化地位。【结果】分离获得了3株噬菌体,头部均呈二十面体,直径大小为81–86 nm,尾部有收缩尾鞘,长度大约为54–70 nm。克隆测序结果显示,获得的3株噬菌体g23基因株间相似度较高,但与可培养的Exo T-、Schizo T-、T-、Pseudo T-evens相似度较低。系统进化分析表明,获得的3株噬菌体不隶属于目前已划分的不同环境噬菌体g23基因的分类类群中。【结论】3株噬菌体均属于肌尾噬菌体科的裂性噬菌体,与目前获得的所有噬菌体g23基因相似性较低,属于新的侵染中华苜蓿根瘤菌的噬菌体株。     

根瘤菌可溶性蛋白和酯酶的电泳图谱分析

我们分析行了二十株根瘤菌可溶性蛋白和酯酶的电泳图谱。菌株中14株分离自野大豆的快生型大豆根瘤菌和3株慢生型大豆根瘤菌;另外3株根瘤菌分别分离于苜蓿、豌豆和三叶草。根据它们电泳谱带的Rf值,计算了各根瘤菌可溶性蛋白图谱间的相似性系数。快生型大豆根瘤菌的电泳图谱均不同于慢生型大豆根瘤菌和其他根瘤菌。鉴于各菌株有其独特图谱,以此作为根瘤菌分类和鉴定的依据,是较可靠的方法。     

ERIC-PCR及其指纹图谱技术的研究

肠杆菌基因间重复共有序列（Enterobacterial repetitive intergenic consensus,ERIC）是主要存在于肠道细菌中的一类基因间重复序列,长度为127 bp,该序列在肠道细菌染色体上的分布和拷贝数有种间的特异性。根据ERIC序列建立的ERIC-PCR实际上是一种半随机性质的PCR,广泛应用于细菌分型、流行病学调查和分子微生态学研究。本文简介了ERIC-PCR反应的特点及其应用的原理,详细阐述目前广泛应用的ERIC-PCR琼脂糖凝胶电泳（PCR-PCR-AGE）技术的不足,指出该方法所获电泳图谱中相同位置的DNA条带可能包括不同的DNA序列,指纹图谱分析时可能夸大模板DNA的相似性。强调ERIC-PCR变性梯度凝胶电泳（PCR-PCR-DGGE）技术是其应用的一个新方向,所得的指纹图谱能够更加敏感、准确、有效地展示底物序列的差异,其中的DNA条带不需测序就可直接用于科研和生产实践中。     

花生根瘤菌在根瘤菌系统分类中的地位研究

用12株分类地位已知的代表菌为对照,采用现代细菌分类学方法,对从四川省4个花生产区的天府3号和地方品种上分离的花生根瘤菌,从系统发育方面,探索了花生根瘤菌在根瘤菌系统中的分类地位。多聚酶链反应(PCR)扩增的16S rRNA的4种限制性内切酶长度多态(PCR-RFLP)以及16S rRNA部分碱基序列测定结果同时表明:四川花生根瘤菌与慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)相似性极高。由此推论它们在系统发育及进化方向上是基本一致的。该结果为研究花生根瘤菌的确切分类地位打下了基础。