沙眼衣原体质粒蛋白pgp3的研究进展

沙眼衣原体分泌性蛋白在沙眼衣原体致病过程中起重要作用,质粒编码的蛋白pgp3(即pORF5)是迄今为止发现的唯一由沙眼衣原体质粒编码的分泌性蛋白。pgp3在沙眼衣原体感染早期即可表达,在感染人群中具有很强的免疫原性,且人抗体对pgp3的识别具有高度的结构依赖性,对该蛋白的研究将有助于进一步了解衣原体质粒编码蛋白的作用及衣原体致病机制,以寻找更好的衣原体诊断方法和防治措施。本文就沙眼衣原体质粒编码蛋白pgp3的生物学性质及其致病机制作一简要综述。     

沙眼衣原体GlgA蛋白表达和分泌的调控机制

【背景】沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)的分泌蛋白在Ct与宿主细胞的相互作用、感染发育周期及致病过程中发挥着至关重要的作用。GlgA蛋白是课题组前期研究发现的一种新的Ct分泌蛋白,其表达和分泌的具体机制及作用还不清楚。【目的】寻找调控CtGlgA蛋白表达和分泌的分子机制,为后续Ct致病机制研究提供实验基础和新思路。【方法】采用Signal P 4.1软件对GlgA蛋白N端进行信号肽预测分析,并用细菌分泌蛋白特异性阻断剂C16和C1化合物分别或同时处理Ct感染的He La细胞,观察阻断Ⅱ型、Ⅲ型分泌途径对GlgA蛋白分泌的影响;经新生霉素处理、噬斑筛选及穿梭质粒转染技术,构建Ct质粒缺失株和缺失互补株,并鉴定质粒编码基因在两种菌株的缺失及表达情况;间接免疫荧光法观察质粒缺失对GlgA表达和分泌的影响。【结果】GlgA蛋白N端无信号肽序列,细菌Ⅱ型、Ⅲ型分泌途径特异性阻断剂C16和C1化合物不能阻断GlgA的胞浆分泌;Ct质粒缺失株CTD1的质粒编码基因pgp7丢失,且质粒编码蛋白Pgp3及基因组编码蛋白GlgA的表达和分泌现象均消失;Ct缺失互补株CTD1-pGFP::SW2重新获得pgp7基因,并恢复Pgp3蛋白和GlgA的表达和分泌。【结论】初步证实Ct糖原合酶GlgA蛋白的表达和分泌不依赖细菌Ⅱ型和Ⅲ型分泌途径,而且与衣原体质粒密切相关。     

衣原体质粒的研究进展

衣原体质粒是一个分子量约为7.5 kb,基因序列高度保守,非整合性的DNA分子,广泛存在于沙眼衣原体的各个血清型中,鼠衣原体和鹦鹉热衣原体也携带该质粒.近年来,人们发现衣原体质粒是一种毒力因子,可以导致小鼠输卵管积水.动物实验显示质粒缺失株可作为减毒活疫苗来预防衣原体感染所致的生殖道和眼睛的病变.不仅如此,衣原体质粒还是一种有效的基因操纵工具,可用于沙眼衣原体致病机制的研究.因此,开展对衣原体质粒的研究具有重要的意义.     

沙眼衣原体CT-249基因编码蛋白为一包涵体膜蛋白

使用融合蛋白GST-CT249的抗体对假想蛋白CT249的特性进行研究。使用PCR方法从L2型沙眼衣原体的基因组中扩增编码CT249蛋白的开放读码区基因,限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ消化、T4连接酶连接导入pGEX-6p2载体,进一步把重组质粒pGEX-6p2-CT249转化到XL1-blue细菌,并诱导表达融合蛋白GST-CT249。在融合蛋白GST-CT249免疫小鼠制备抗体后,应用直接免疫荧光技术对衣原体感染细胞内的CT249基因表达的内源性蛋白进行初步定位。成功克隆出沙眼衣原体基因CT249,全长为351bp,并表达了融合蛋白GST-CT249,分子量为38.2kDa。制备了融合蛋白GST-CT249的抗体并初步定位假想蛋白CT249于沙眼衣原体包涵体膜蛋白上。总之,使用融合蛋白GST-CT249的抗体,鉴定假想蛋白CT249为一种新的沙眼衣原体包涵体膜蛋白。该发现将为进一步深入研究衣原体与宿主细胞间某些机制提供了有用的途径。     

CT358蛋白在沙眼衣原体感染细胞中的定位及特性分析

确定沙眼衣原体CT358蛋白在衣原体感染细胞中的位置并初步鉴定其生物学功能．采用PCR方法从D型沙眼衣原体的基因组中扩增CT358基因,并克隆入pGEX和pDSRedC1表达载体中．将重组质粒pGEX-CT358转化到XL1-blue宿主菌,并诱导表达融合蛋白GST-CT358．纯化后的CT358融合蛋白免疫小鼠制备抗体,应用间接免疫荧光技术对CT358蛋白在衣原体感染细胞内的定位及表达模式进行分析．同时,pDSRedC1-CT358重组质粒瞬时转染HeLa细胞,观察CT358蛋白对衣原体感染的影响．实验结果证明CT358蛋白为沙眼衣原体包涵体膜蛋白．该蛋白质在衣原体感染12 h后就表达定位于包涵体膜上,直至持续到整个感染周期,转基因在胞浆表达的CT358融合蛋白不影响其后的衣原体感染．该研究为深入研究衣原体与宿主细胞间相互作用提供了新的线索,并可为衣原体性的治疗、预防提供新方向．     

Pgp3生物学特性与致病机制研究进展

衣原体具有广泛的致病谱，能够引起多种疾病，而分泌性蛋白在衣原体致病过程中发挥了重要的作用。Pgp3 (plasmid gene protein 3)是由衣原体质粒基因编码的一种主要定位于宿主细胞质的分泌性蛋白，具有调控炎症反应、细胞凋亡、自噬等多种生物学功能。Pgp3也是一种免疫优势抗原，可用于衣原体疾病的诊断和作为疫苗研制的靶点。全面、深入地研究该蛋白功能将有助于进一步了解衣原体的致病机制，为衣原体感染的诊断和防治提供新的思路。     

衣原体pORF5质粒编码蛋白致病机制的研究进展

衣原体(Chlamydia)是一类具有独特的两相发育周期、专性细胞内寄生的革兰阴性菌,能引起人类多种疾病。pORF5是衣原体隐蔽性质粒编码的分泌性效应蛋白。近年来研究证实,pORF5质粒编码蛋白是衣原体重要的毒力蛋白,与衣原体致病密切相关。现就衣原体pORF5质粒编码蛋白的生物学特性、致炎性作用、抗凋亡作用及促自噬作用作一概述。     

衣原体分泌性蛋白研究进展

衣原体分泌性蛋白是由衣原体基因编码并分泌到宿主细胞胞浆中的具有酶活性蛋白,研究最多的是蛋白酶体样活性因子即CPAF。CPAF能抑制IFN-γ诱导的MHC分子的表达、裂解角蛋白-8并通过裂解宿主细胞唯BH3域蛋白参与抗凋亡作用。2005年又发现两种肺炎嗜衣原体的分泌性蛋白CPn0796和CPn0797,但对其研究不多。     

genistein对沙眼衣原体感染细胞信号转导的影响

研究酪氨酸激酶抑制剂 genistein对IFN γ诱导沙眼衣原体感染细胞内信号转导的影响。以IFN γ作用于沙眼衣原体 (K血清型 )感染的McCoy细胞 ,用 genistein阻断IFN γ对沙眼衣原体感染细胞的作用。用台盼蓝染色法检测沙眼衣原体感染细胞存活率。用免疫印迹法检测蛋白酪氨酸激酶磷酸化及JAK1/STAT1活化的改变。结果显示 :genistein可拮抗IFN γ降低沙眼衣原体感染细胞存活率的作用 ,且具有剂量依赖效应。genistein可抑制IFN γ诱导的沙眼衣原体感染细胞蛋白酪氨酸激酶磷酸化及JAK1/STAT1活化 ,此作用且与genistein作用的剂量有关。     

沙眼衣原体CT135蛋白的表达与抗体制备

目的:在原核表达系统中表达沙眼衣原体CT135蛋白,并制备抗体,建立CT135蛋白免疫检测方法。方法:将沙眼衣原体CT135基因(1083 bp)克隆入带有His标签的pET-32a(+)载体中,通过NdeⅠ/XhoⅠ双酶切构建CT135全长的重组质粒WT,CT135基因N端逐渐缩短的重组质粒MT1、MT2、MT3,以及CT135基因C端逐渐缩短的重组质粒MT4、MT5、MT6,在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达;用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白,然后腹腔注射5周龄BALB/c雌鼠制备抗血清。结果:Western印迹使用高灵敏的二抗通过红外扫描系统检测到所有质粒可表达重组蛋白,但考马斯亮蓝染色结果显示只有MT6可高表达重组蛋白。制备纯化了MT6重组蛋白,通过腹腔注射免疫法制备了小鼠抗MT6血清。结论:大肠杆菌表达系统中,沙眼衣原体CT135蛋白的N端片段(1～374 bp)可以获得高表达。小鼠抗MT6血清的制备为后期检测沙眼衣原体CT135蛋白的表达奠定了基础。     

Comparative PCR-based restriction fragment length polymorphism analysis of the plasmid gene orf3 of Chlamydia trachomatis and Chlamydia psittaci

The BfaI digestion of PCR-based restriction fragment length polymorphism analysis of the plasmid orf3 of Chlamydia trachomatis and Chlamydia psittaci provided evidence for two distinct restriction patterns, respectively. The nucleotide sequences of orf3 genes confirmed these differences. Serum antibodies against recombinant C. psittaci protein (pgp3) encoded by orf3 were detected both in pigeons with C. psittaci infection and in a human patient with psittacosis.     

Expression of Chlamydia trachomatis inclusion membrane protein genes IncB and IncC in Escherichia coli

In this study, we have cloned the Chlamydia trachomatis genes incB and incC into the expression plasmid vectors from pET series for the subsequent isolation of recombinant proteins. As a result, we have obtained the first full-length recombinant C. trachomatis proteins IncB and IncC, which can be used for following antibody production and for study of their protein-protein interaction.     

新型MGB探针在沙眼衣原体实时PCR检测中的应用

为建立基于TaqMan-MGB探针的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测方法,探讨其临床应用价值,用 PCR法扩增沙眼衣原体隐蔽质粒pLVG440 2 464～2 980 nt段,并克隆入pMD18-T载体用作参比模板,设计一对引物和一个TaqMan-MGB探针,优化反应条件,建立沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统,并运用该系统同时应用连接酶链式反应(LCR)法对临床标本进行检测.结果显示所建立的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统,最低检测限度为1 DNA拷贝每反应;在10⁰～10⁹ DNA拷贝每反应范围内,C_t值(每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数）和DNA拷贝数呈线性关系（r＞0.990）;对临床标本检测结果同LCR分析结果吻合率为100%.以上结果表明,所建立的基于TaqMan-MGB探针的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统具有敏感性高、特异性强和线性检测范围广等特点,适用于对沙眼衣原体进行大规模筛选.     

The 7.5-kb plasmid present in Chlamydia trachomatis is not essential for the growth of this microorganism

An L2 serovar of Chlamydia trachomatis, isolated from a patient with proctocolitis, has been identified that does not contain the common C. trachomatis 7.5-kb plasmid. This isolate was propagated in vitro showing that this plasmid is not required for the growth of C. trachomatis.     

Detection by multiplex polymerase chain reaction and typing of Chlamydia trachomatis isolates

Abstract The multiplex polymerase chain reaction (PCR) was applied for the detection of the Chlamydia trachomatis chromosome and plasmid. The multiplex PCR demonstrated a sensitivity of 0.8 fg of chlamydial DNA, corresponding to the detection of about 5 copies of the plasmid. Analysis of 195 genital specimens collected randomly from a female population, showed that the multiplex PCR is more sensitive and rapid than culturing for detecting Chlamydia trachomatis . Moreover, sequencing of the II variable domain of the ompl gene, directly from DNA of the clinical specimens, appears to be a simple and rapid method for determining serovar isolates.