四价流感病毒裂解疫苗的稳定性

目的评价四价流感病毒裂解疫苗的稳定性,为疫苗的有效期提供依据。方法分别将A1(H1N1)、A3(H3N2)、B/Victoria和B/Yamagata等4株毒株制备单价原液,生产6批疫苗(不含硫柳汞),评价疫苗分别在(37±2)℃、(25±2)℃和(6±2)℃条件下的稳定性。结果四价流感病毒裂解疫苗在(37±2)℃保存10 d、在(25±2)℃保存3个月、在(6±2)℃保存15个月,疫苗各项指标均符合企业注册标准和《中华人民共和国药典》2015版(三部)的要求。结论四价流感病毒裂解疫苗具有良好的稳定性,在(6±2)℃可稳定保存15个月。     

流感病毒裂解疫苗裂解剂去除方法的研究

裂解剂的残余含量是流感病毒裂解疫苗的主要质控指标之一。实验中采用膜超滤法和透析法做了裂解剂去除的比较研究。结果表明,膜超滤法效果优于透析法。其血凝素抗原纯化收率达到90%,裂解剂去除达98%以上;疫苗生产无菌操作和细菌内毒素易于控制,成本低,易于大规模生产。     

H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗稳定性研究

目的评价H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗的稳定性。方法采用国内自主构建的重组H7N9禽流感病毒疫苗株毒种制备单价疫苗原液,制备含MF59佐剂的成品疫苗。按照企业注册质量标准进行检定,分别放置于(37±2)℃、(25±2)℃和(5±3)℃环境下,观察不同时间疫苗的稳定性。结果经检定,成品疫苗的外观、装量、无菌检查、异常毒性检测、细菌内毒素含量、渗透压质量摩尔浓度及其他检定项目均符合企业注册质量标准。H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗在(37±2)℃保存3 d、在(25±2)℃保存3个月、在(5±3)℃保存30个月,疫苗各项指标均符合企业注册质量标准。结论 H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗具有良好的稳定性。     

CTAB对流感病毒的裂解作用

观察流感病毒膜蛋白 血凝素 (HA)和神经氨酸酶 (NA)在裂解剂CTAB作用下的裂解情况。流感病毒加入一定量的保护剂 ,一定时间后加入裂解剂CTAB ,在 5～ 8℃温度下 ,作用 2个h ,超速离心 ,提取上清液。经电镜观察、SDS PAGE电泳检测 ,表明流感病毒膜蛋白在裂解剂浓度为 4 0 0mg/L的条件下 ,裂解比较完全 ,形态比较完整。CTAB作为流感病毒膜蛋白的裂解剂 ,效果较好 ,浓度为 4 0 0mg/L可作为实际工作的使用浓度。     

四价流感病毒裂解疫苗B型血凝素含量的检测方法

目的建立能准确测定四价流感病毒裂解疫苗中B型血凝素含量(单向免疫扩散法,SRD)的检测方法。方法采用双价抗原参考品SRD法对四价流感病毒裂解疫苗中两种B型血凝素含量进行测定。将B1与B2抗原参考品按质量浓度1∶1混合制备为双价抗原参考品,双价抗原和待检样品与10%裂解剂按9∶1比例裂解30 min,分别加入到含有抗血清参考品的1.5%琼脂糖凝胶板上,每孔10μL,置20~25℃放置18~24 h,经干燥、染色、脱色,测量结果。验证双价抗原SRD法的重复性和准确性。结果双价抗原SRD法测定的血凝素含量平均值比单价抗原SRD法更接近理论配制值,故双价抗原SRD法比单价抗原SRD法能更能准确检测QIV中两种B型血凝素含量,经验证双价抗原SRD法的重复性及准确性良好。结论双价抗原SRD法提高了四价流感病毒裂解疫苗B型血凝素含量检测的准确性,为精确测定四价流感病毒裂解疫苗中B型血凝素含量提供了有效的方法和数据支持。     

流行性感冒裂解疫苗免疫原性试验及电镜观察

实验报告了以三硝基甲苯X-100(Triton X-100)为裂解剂对流行性感冒病毒裂解效果的电镜观察结果及裂解疫苗的免疫原性。通过对病毒纯化、裂解、再纯化制备的3批流行性感冒裂解疫苗样品的电镜观察,表明使用此裂解剂能使疫苗中的病毒裂解完全,无完整病毒颗粒,裂解效果好。安全试验和免疫试验结果表明疫苗的安全性好,免疫效果好。     

流行性感冒裂解疫苗的研制

作为换代产品,流行性感冒裂解疫苗的研制已取得突破性进展,根据WHO有关规程的规定和大量的试验研究结果。完整建立了该疫苗的生产工艺和生产质量控制系统,完成了“流行性感冒裂解疫苗制造及检定规程”等规定性文件的起草和审核工作,以中试规模连续生产了三批疫苗并全部自检合格,通过疫苗稳定性试验,效力试验,异常毒性试验及过敏性试验等观察。进一步肯定了疫苗的质量。     

季节性流感裂解疫苗在小鼠中针对同型与异型流感病毒的免疫保护效力

为了研究季节性流感裂解疫苗在小鼠中针对甲型流感病毒同型同株、同型异株、异型异株攻击的免疫保护效力及其与诱发的血凝抑制(HI)抗体滴度的关系,本研究使用我国2008~2009年度季节性流感裂解疫苗中不同剂量的甲1型流感病毒H1N1(疫苗株病毒A/Brisbane/59/2007(H1N1)-like)和甲3型流感病毒的H3N2(疫苗株病毒A/Brisbane/10/2007(H3N2)-like)疫苗组分免疫BALB/c小鼠,首先确定了能在小鼠中诱发血HI抗体滴度达到40的疫苗免疫剂量;然后以此剂量免疫小鼠,分别使用同型同株流感病毒(鼠肺适应株A/Brisbane/59/2007(H1N1)-like virus(MA))(简称A1)和同型异株流感病毒(鼠肺适应株A/Purto Rico/8/34(H1N1))(简称PR8)攻击H1N1疫苗免疫小鼠,使用异型异株流感病毒A1攻击H3N2疫苗免疫小鼠,通过体重变化和存活率情况,探讨季节性流感疫苗在小鼠中针对甲型流感病毒同型同株、同型异株、异型异株攻击的保护效力。结果显示,季节性流感裂解疫苗H1N1和H3N2组分按照HA不同剂量0.15μg、0.5μg、1.5μg、5μg和15μg免疫小鼠后,所诱发的HI抗体滴度随免疫剂量的增加而增强,1.5μgHA即可以诱发免疫小鼠HI抗体滴度达到40;以此剂量免疫小鼠,分别使用3LD50、10LD50、30LD50、100LD50、300LD50、1 000LD50和3 000LD50的同型同株流感病毒A1进行攻击,1.5μgH1N1疫苗可以100%保护小鼠抵御高至1000LD50同型同株流感病毒A1的攻击,15μg甚至可以100%保护3 000LD50同型同株流感病毒A1的攻击,但是这两个剂量免疫的小鼠在低至3LD50同型异株流感病毒PR8的攻击后都全部死亡;使用可以诱发HI抗体滴度达到140的15μg H3N2疫苗免疫小鼠,在低至3LD50异型异株流感病毒A1的攻击后亦全部死亡。以上结果表明,季节性流感疫苗可使小鼠HI抗体滴度达到40的疫苗免疫剂量为1.5μg,该免疫剂量可以有效保护小鼠抵御同型同株流感病毒的攻击,但是难以保护小鼠抵御同型异株与异型异株流感病毒的攻击,这一结果为建立以季节性流感疫苗为参考的免疫保护评价体系提供了实验依据。     

四价流感病毒裂解工艺的研究

目的研究流感病毒裂解最佳工艺条件。方法选取BV(NYMC BX-69A)流感病毒毒株,使用BV 1801批纯化液以曲拉通Triton X-100为裂解剂,选取不同浓度、不同裂解时间、不同蛋白质含量等因素,通过每组裂解试验后获得的裂解前后血凝素含量及蛋白质含量,计算血凝素回收率、纯度;40 000倍电镜下观察裂解程度。结果裂解剂曲拉通Triton X-100体积分数为0.5%时,纯度平均值为4.73,血凝素回收率平均值为71.75%;裂解剂曲拉通Triton X-100体积分数为0.7%时,纯度平均值为3.27,血凝素回收率平均值为82.00%;裂解剂曲拉通Triton X-100体积分数为1.0%时,纯度平均值为3.87,血凝素回收率平均值为61.46%。裂解时间为1 h时,纯度平均值为4.17,血凝素回收率平均值为71.75%;裂解时间为2 h时,纯度平均值为3.88,血凝素回收率平均值为82.00%;裂解时间为3 h时,纯度平均值为3.59,血凝素回收率平均值为76.75%。蛋白质浓度为800μg/mL时,纯度平均值为3.80,血凝素回收率平均值为93.00%;蛋白质浓度为1 200μg/mL时,纯度平均值为3.92,血凝素回收率平均值为91.00%;蛋白质浓度为1 600μg/mL时,纯度平均值为4.45,血凝素回收率平均值为77.50%。结论确定了四价流感病毒裂解工艺最佳参数为裂解剂曲拉通Triton X-100体积分数为0.7%,蛋白质含量为800～1 200μg/mL,裂解时间2 h,电镜下观察病毒颗粒完全裂解,血凝素回收率较高,符合工艺标准要求,满足规模化生产。     

流感裂解疫苗生产中沙门菌和微生物限度的监控研究

通过对2008年流感裂解疫苗生产中的监控,结果显示,流感病毒接种鸡胚尿囊液中未检出沙门菌,除菌过滤前微生物限度均小于10CFU/ml、细菌内毒素均小于25EU/ml,纯化过程去除了99%的杂蛋白。表明生产中使用的健康鸡胚尿囊液是符合生物制品规程的要求,现行生产工艺对微生物限度和细菌内毒素的控制是有效的,现行纯化过程对病毒液的纯化是有效的。     

重配技术构建高产H1N1型流感疫苗病毒株

目的以经典重配技术制备高产H1N1流感疫苗病毒株。方法以野生型A1/云南昆明/03/2009(H1N1)作为HA及NA基因的供体株,以WHO疫苗株A/Perth/16/2009(H3N2)作为高产基因供体株,共同感染SPF鸡胚,经抗H3及抗N2血清中和筛选法及终末稀释法筛选高产重配H1N1病毒。结果获得一株重配H1N1流感病毒株,病毒血凝滴度为1∶4 096,病毒滴度为7.8 lg EID50/mL,显示为鸡胚高产病毒株;血凝抑制结果为1∶1 024,单向免疫扩散试验结果为阳性,证明抗原性与野生株一致;基因测序结果表明重配株的HA及NA基因序列与野生株序列一致。结论构建了高产重配H1H1流感疫苗病毒株,并应用经典重配技术建立了制备高产流感疫苗病毒株的技术平台。     

甲型流感病毒核壳蛋白在BALB／c小鼠中酶联免疫斑点法表位的筛选及其与CTL表位的相关性研究

目的：利用甲型流感病毒A／Johannesburg／33／94（H3N2）核壳蛋白（NP）全长肽库筛选BAI卫／c（H-2^d）小鼠中NP酶联免疫斑点法（EUSPOT）表位,研究其和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位的一致性关系,为使用ELlSPOT评价流感病毒NP疫苗的细胞免疫效果提供实验依据。方法：以甲型流感病毒A／PR／8／34（H1N1）（PR8）感染BALB／c（H-2^d）小鼠后,通过检测T细胞分泌γ-干扰素（IFN-1）的ELISPOT法和体内CTL法检测NP所诱发的细胞免疫反应,综合分析ELlSPOT和CTL表位肽之间的关系。结果：Pep36（NP第141-155位氨基酸残基,SNLNDTTYQRTRALV）和Pep37（NP第145-159位氨基酸残基,DTTYQRTRALVRTGM）可以诱发较强的ELlSPOT反应,根据Pep36和Pep37共有序列合成的Pep147-155（NP第147-155位氨基酸残基,TYQRTRALV）可以诱发与这2条多肽相同强度的ELlSPOT反应,表明Pep147-155为NP诱发ELlSPOT反应的最强表位,体内CTL也表明它是最强的CTL表位;Pep95（NP第377-391位氨基酸残基,STLELRSRYWAIRTR）、Pep96（NP第381-395位氨基酸残基,LRSRYWAIRTRSGGN）和其他表位肽诱发的ELISPOT反应较弱,体内CTL反应也较弱。结论：BALB／c（H-2^d）小鼠中,甲型流感病毒NP诱发ELlSPOT反应和CTL反应的表位肽高度相关;实验结果为使用ELlSPOT评价流感病毒NP疫苗的细胞免疫效果提供了实验依据。     

一种含不同流感病毒血凝素抗原表位的核酸疫苗

流感病毒表面抗原血凝素( hemagglutinin,HA)是流感核酸疫苗重要的靶抗原,针对HA的保护性中和抗体主要由HA上的五个抗原表位诱导产生.在本文中,我们构建了一种以新甲型H1N1流感病毒HA1为骨架的含2个A/PR/8( H1N1)流感病毒HA抗原表位和3个新甲型H1N1流感病毒HA抗原表位的核酸疫苗,并在B...     

肺炎克雷伯杆菌疫苗中试生产中细菌培养工艺的改进及优化

目的中试生产中对肺炎克雷伯杆菌培养工艺进行改进及优化。方法采用液体综合培养基代替半综合培养基在10L和100L中国丽生物反应器中对肺炎克雷伯杆菌进行培养,在10L中国丽生物反应器探讨不同的培养基配方、pH值、培养温度、搅拌转速、溶氧,工艺参数稳定后,扩大培养到100L中国丽生物反应器,并探讨培养过程中补加葡萄糖的浓度及补加方式等对细菌浓度及荚膜多糖含量的影响。结果肺炎克雷伯杆菌液体综合培养基可代替半综合培养基用于该菌的培养,培养过程中维持pH值7．2、温度37℃、通气60L／h、搅拌转速250r／min、培养到2h时开始以恒速补加30mL／L40％葡萄糖溶液、培养时间为5h,细菌长势最好,收获的荚膜多糖含量最高。结论肺炎克雷伯杆菌的培养工艺放大到100L中国丽生物反应器中,经过多次试验初步建立了稳定的肺炎克雷伯杆菌中试培养工艺。     

A群C群脑膜炎球菌结合疫苗稳定性

目的评价A群C群脑膜炎球菌结合疫苗原液和成品的稳定性。方法分别将A群、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液及A群C群脑膜炎球菌结合疫苗各选取连续3批,分别放置于37℃、20~25℃和2~8℃3种温度下,在一定的时间取样进行主要项目测定,在关键时间点进行全面检测。结果 A群结合疫苗原液于2~8℃保存9个月,20~25℃保存4周,37℃保存4 d;C群结合疫苗原液于2~8℃保存9个月,20~25℃保存6个月,37℃保存4周;A群C群脑膜炎球菌结合疫苗于2~8℃保存2年3个月,20~25℃保存6个月,37℃可以保存9周;各项检测指标均符合质量标准的要求。结论在2~8℃条件下,A群、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液存放6个月,A群C群脑膜炎球菌结合疫苗存放2年,其质量稳定。     

甲型H1N1流感病毒佐剂疫苗小鼠免疫效果

为了探讨甲型H1N1流感病毒氢氧化铝佐剂疫苗对小鼠的免疫作用及对小鼠繁殖性能的影响,以不同剂量、不同免疫程序免疫小鼠后定期采血;用血凝抑制(HI)方法检测血清H1N1流感病毒HI抗体滴度,观察H1N1流感病毒佐剂疫苗对小鼠受孕、产仔、哺乳的影响;比较孕鼠及非孕鼠的抗体滴度,免疫后孕鼠所产仔鼠的体重及H1N1胎传抗体水平。结果显示,以0.5μg组开始的不同剂量、不同免疫程序均可使小鼠产生90倍以上水平的H1N1流感病毒抗体;免疫后的小鼠不影响受孕、产仔及哺乳;仔鼠保护性抗体可持续1个月以上。H1N1流感病毒佐剂疫苗是一种高免疫原性的制剂,用低剂量免疫,即可产生90倍以上持续时间较长的保护性抗体。这种佐剂疫苗对小鼠的繁殖性能无明显影响,免疫产生的抗体经胎盘可垂直传递给仔鼠。     

季节性流感疫苗对小鼠感染 H7N9 禽流感病毒的保护效力简

目的 评价季节性流感裂解疫苗对流感病毒H7N9的免疫保护效力.方法 用我国2012～2013年度季节性流感裂解疫苗,以腹腔注射方式免疫BALB/c小鼠,并设PBS免疫模型组,末次免疫14 d后以5 LD50 A/Anhui/1（H7N9）进行攻试验.感染后观察记录小鼠临床表现,体重变化,并分别于第2天和第4天每组处死3只小鼠,取肺组织和鼻甲骨测病毒滴度和载量.结果 感染后疫苗与模型组小鼠体重下降明显,疫苗组存活率为10%,模型组全部死亡.感染后第4天疫苗组鼻甲骨滴度显著低于模型组.血凝抑制试验及中和实验表明免疫小鼠血清无中和H7N9病毒抗体.结论 季节性流感疫苗在小鼠中对于H7N9流感病毒感染无明显保护作用.     

口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(人二倍体细胞)的稳定性研究

目的评价细胞工厂工艺连续生产的口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(人二倍体细胞)的稳定性。方法疫苗在-20℃放置24个月,检测病毒滴度、外观、抗生素残留量、无菌性,及对病毒血清型进行鉴别;2~8℃放置12个月检测疫苗稳定性;室温放置7周、37℃放置7 d检测加速热稳定性并冻融的稳定性。结果该疫苗-20℃可贮存24个月以上,2~8℃有效期可延长至12个月,且冻融不会影响疫苗的稳定性。结论疫苗质量稳定,各项检测结果均符合《中华人民共和国药典》三部(2010版)及企业《口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(人二倍体细胞)注册标准》。     

应用细胞工厂建立人用狂犬病疫苗连续培养多次收获工艺

目的为提高生产效率、增加原代地鼠肾细胞单产量及狂犬病病毒产量,建立人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）连续培养多次收获工艺。方法选用12-14日龄SPF地鼠,无菌取肾经消化,制备成细胞悬液,分装到40层细胞工厂并培养细胞成单层;接种狂犬病病毒固定毒aG株,连续培养病毒并多次收获。分别对同一细胞批制备的多个单次病毒收获液的免疫原性、病毒滴度和地鼠肾细胞蛋白质含量进行检测。结果用40层细胞工厂培养原代地鼠肾细胞和狂犬病病毒,细胞接种浓度为1．0×10。～1．5x10。cells／mL,（36±1）℃培养72h成致密单层;按0．1MOI病毒接种,可进行6次收获病毒;多个单次病毒收获液病毒滴度均不低于6．0lgLD50／mL;免疫原性检查保护指数不低于100;地鼠肾细胞蛋白质残留量随着收获次数的增加而不断降低。结论用细胞工厂建立了人用狂犬病疫苗连续培养多次收获工艺,能显著提高地鼠。肾单产量,增加产能。