白桦APETALA2基因启动子的克隆及其表达分析

APETALA2（AP2）转录因子亚家族普遍存在于植物中,参与植株的生长发育、胁迫应答和多种生理生化反应的信号传导。本研究从白桦（Betula platyphylla Suk.）基因组中克隆了AP2基因2 308 bp的启动子序列,生物信息学分析发现,该序列除具有TATA-box和CAAT box等高等植物普遍具有的保守元件外,还具有大量光响应元件和激素响应元件,如响应赤霉素、脱落酸、茉莉酸甲酯等的元件。将白桦AP2基因启动子克隆至pBI121-35S：：GUS植物表达载体中,命名为pBI121-proAP2：：GUS,用农杆菌介导法侵染白桦和拟南芥,并进行GUS染色分析,结果表明AP2基因启动子驱动下的GUS报告基因在整个拟南芥中都表达,在白桦的营养器官和雌花种翅及花柄中也有表达,说明其具有启动活性,可能参与该器官的发育。     

白桦CESA7基因启动子的克隆与表达分析

克隆得到了一个白桦纤维素合成酶基因（CESA7）GenBanK登录号（EU591531）启动子序列,通过序列分析发现该启动子含有多个不同功能的顺式作用元件,包括光响应元件、激素响应元件、叶片形态发育元件等,推测该启动子在白桦生长发育过程中具有关键作用。将BpCESA7启动子克隆至带有GUS报告基因的植物表达载体,命名为proBpCESA7-121-GUS,并利用农杆菌介导方法侵染白桦和拟南芥,然后通过GUS组织化学染色观察BpCESA7基因启动子的组织表达特性。结果在白桦的根、茎、叶和拟南芥的根,叶,萼片、雌蕊中检测到了GUS活性,说明BpCESA7基因启动子具有启动子活性,并且在白桦的根和叶中染色最深,表明BpCESA7基因在白桦根和叶中表达量较高,并且其存在组织表达特异性。     

虎杖PcMYB1启动子的克隆及其活性分析

获得药用植物虎杖(Polygonum cuspidatum)PcMYB1启动子,并分析其活性,为进一步研究虎杖转录因子PcMYB1的功能奠定基础.通过hiTAIL-PCR方法,从虎杖叶片基因组DNA中克隆PcMYB1启动子并进行生物信息学分析.分别构建由全长启动子或5'端缺失启动子驱动GUS的重组表达载体P1∷GUS、...     

水稻谷蛋白基因GluC启动子的克隆及表达分析

水稻谷蛋白仅在水稻种子胚乳中表达,其启动子是分离胚乳特异性表达启动子的理想材料。本研究克隆了GluC基因启动子pGluC,生物信息学分析表明pGluC内部含有胚乳特异性表达所需要的Skn-1 motif和ACGT-box元件。将pGluC启动子和7个5'端缺失启动子片段构建到pGPTV-GUS载体上,转化水稻愈伤组织,进行组织化学染色和GUS酶活分析。结果表明：全长及截短的-1 911、-1 611、-1 311 bp启动子均能驱动GUS基因在水稻种子胚乳中高效稳定表达。-999、-451、-203、-102 bp启动子失去了胚乳表达特异性,在根、茎或者叶中也检测到GUS表达。该结果为实现外源目的基因在水稻胚乳中特异高效表达提供了理论依据。     

两个水稻胚乳启动子的克隆及表达分析

启动子的克隆对基因表达及基因工程研究有重要意义。根据数据库中EST丰度,从水稻中克隆了两个预测在水稻胚乳中高效表达的启动子Os772和Os359,并将启动子片段与GUS报告基因融合,构建了重组表达载体。通过农杆菌介导方法将其导入水稻愈伤组织细胞。转基因水稻经GUS组织化学分析显示,Os772和Os359能启动GUS基因在水稻胚乳中表达但不能在根、茎、叶和花中表达。该结果表明Os772和Os359为两个水稻胚乳特异性启动子。     

小鼠Daintain/AIF-1 基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因 载体的构建

目的:对Daintain/AIF-1(大炎肽/同种异体移植炎症因子-1)基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法:提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果:PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1(pGL3-Basic-DT)载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论:Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

小鼠Daintain/AIF-1基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的：对Daintain/AIF-1（大炎肽/同种异体移植炎症因子-1）基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法：提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果：PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1（pGL3-Basic-DT）载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论：Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

拟南芥莲座叶片发育过程中P1基因的表达特性

该实验对CDF1类似蛋白基因(P1)在拟南芥叶片发育不同阶段的定量PCR结果显示,P1基因在拟南芥叶片发育的所有时期均可表达,但在茎生叶和衰老叶中的表达水平明显高于成熟叶和幼叶。GUS报告基因表达的组织化学染色结果显示,P1启动子在拟南芥叶片中有较高的驱动活性;在营养生长阶段的幼苗和植株(4~5周)的所有叶片中均能检测到GUS表达,但在植株转入生殖生长阶段后(6周及以后),GUS表达主要集中在逐渐衰老的叶中,并随着叶片衰老程度加剧GUS染色程度也越深,这一结果与GUS荧光定量检测结果一致。通过分析P1基因启动子上可能存在的顺式调控元件,发现茉莉酸甲酯、热压、干旱和水杨酸等均能够引起叶片衰老调控元件的响应,证实P1的表达受到这些因素的调控。研究表明,P1在拟南芥莲座叶片中很可能参与了对上游衰老信号的响应,该研究结果为进一步探究P1在叶片衰老过程中的分子功能验证奠定了基础。     

水稻OsWTF1基因启动子的克隆与表达分析

目的：分析水稻OsWTF1基因启动子的功能及核心序列。方法：利用PCR技术从水稻日本晴基因组中克隆了转录因子WTF1编码区5上游大小为2049bp的调控区域,命名为OsWTF1,将它和长度为1631、608、474、415bp的5端缺失体分别与GUS基因融合构建表达载体,并用农杆菌介导法转化水稻。结果：GUS组织化学分析表明,OsWTF1、Os1631能够驱动GUS基因在根、茎、叶、叶鞘、花药、颖壳上的表达,Os608,Os474,Os415能驱动GUS在根、茎、花药、颖壳中表达,在叶鞘中未表达,而且在叶中的表达也很微弱。结论：OsWTF1启动子核心序列可能位于-1bp--415bp之间,在-608bp--1631bp之间可能存在与基因叶肉特异表达相关的重要元件。     

含35S启动子的粟酒裂殖酵母表达载体的构建及功能鉴定

利用PCR技术从植物表达载体pBI121上先后克隆出GUS基因和35S-GUS-NOS基因序列,分别构建粟酒裂殖酵母重组表达载体pESP-2-GUS和pESP-2-35S.GUS.NOS,并将它们转化到粟酒裂殖酵母菌体中.通过对不同液体培养基中两种转化子的不同启动子启动GUS基因表达产物的GUS染色分析与比较,证明连入的35S启动子能够替代pESP-2自身受维生素B1浓度调控的启动子,从而降低了培养基的成本,为今后工业上利用粟酒裂殖酵母发酵生产产品,提高经济效益,奠定了基础.     

一个陆地棉羧基末端蛋白酶cDNA的克隆及其表达分析

利用PCR筛选方法从陆地棉纤维cDNA文库中分离出1个基因序列,命名为ChCtp。该cDNA全长1917bp,编码1个含473个氨基酸残基的多肽。GhCtp蛋白与拟南芥和水稻中的一类羧基末端蛋白酶具有较高的同源性,在GhCtp的N-末端有1个精氨酸富集区,而C-末端有1个Pfam数据库中编号为DUF239的高度保守区域;该蛋白的N-末端还存在1个在拟南芥和水稻羧基蛋白酶中所缺乏的ATP/GTP结合区A序列。亲水性分析表明,GhCtp为1个可能的跨膜蛋白。从表达特征来看,GhCtp不属于纤维细胞特异表达或优势表达基因,并且它在棉花不同组织中或不同纤维发育时期的表达强度均很低。     

陆地棉脂肪酶基因克隆及氨基酸序列分析

根据陆地棉(Gossypium hirsutum L.)EST序列设计一对引物,采用RT-PCR方法从萌发的棉籽中获得了脂肪酶(triacylglycerol acylhydrolases,EC 3.1.1.3)基因,该基因编码483个氨基酸;比对结果显示,棉籽脂肪酶与拟南芥、水稻、蓖麻等脂肪酶相似性较低,具有由Ser-Asp-His组成的三联体催化活性中心,在亲核Ser残基周围有GXSXG保守序列.软件预测显示该脂肪酶为可溶性蛋白,分子量约为55.4 kD,等电点为9.07,不含N端信号肽,亚细胞定位可能是过氧化物酶体或胞质溶胶.     

陆地棉GhPS2基因的克隆和表达分析

卤代酸脱卤酶(HAD)在调节植物生长发育和响应磷缺乏胁迫方面具有重要作用。该研究基于前期陆地棉根部低磷胁迫基因差异表达序列数据分析,以陆地棉新陆早19为材料,对GhPS2基因进行克隆,并对其基因组DNA与cDNA测序分析,借助生物信息学方法分析GhPS2的基因结构和进化关系;采用荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法检测该基因于根、茎、叶、花4个器官的基因表达量变化和低磷胁迫下0,4,12,24,72 h的相对表达。结果表明,(1)成功获得陆地棉GhPS2基因,该基因的开放阅读框序列长度813 bp,编码270个氨基酸,存在3个内含子,属于HAD家族,其中存在1个保守结构域名为Put-Phosphatase。(2)序列比对和进化分析显示,陆地棉GhPS2与其他棉种PS2、榴莲PS2的相似性分别为93%和83.15%。(3)qRT-PCR结果表明,GhPS2基因在根中表达量最高,其次是茎和花,在叶中表达量最低,该基因在低磷胁迫4 h时相对表达量达到最高值,低磷胁迫72 h时是适磷处理的16.66倍。研究表明,GhPS2基因属于低磷胁迫响应基因,在棉花响应低磷胁迫过程中具有重要作用。     

棉花GhCCR1基因结构及表达分析

根据棉花GhCCR1基因的cDNA序列设计引物,采用PCR技术从棉花中克隆了GhCCR1基因的DNA序列,并采用半定量RT-PCR方法分析了GhCCR1基因在不同发育阶段棉纤维中的表达情况.结果表明:GhCCR1编码区DNA序列长度为1 161 bp,包含4个外显子和3个内含子,内含子富含AT,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则.半定量RT-PCR检测表明,GhCCR1基因在不同发育阶段的棉纤维中均有表达,在开花后20 d的棉纤维中表达量最高,说明该基因可能参与调控棉纤维细胞的伸长和次生壁的增厚过程.     

陆地棉纤维优势表达基因GhRACK1的克隆与序列分析

纤维品质改良是我国棉花育种的主要目标之一,纤维特异或优势表达基因的挖掘是利用基因工程手段改良纤维品质的关键。根据苏棉12纤维中优势表达的GhRACK1 EST序列设计引物,通过RACE技术克隆了GhRACK1基因的全长cDNA。推导的氨基酸序列含有4个串联的WD基序,属于WD40重复家族,与已知的RACK1蛋白同源性达70％以上,PDB模拟的蛋白三维结构也与已知的RACK1蛋白结构相似。荧光定量PCR分析表明GhRACK1在纤维中的表达量比叶片中高20倍以上。研究结果为棉花纤维品质改良基因工程提供了新的基因资源。     

棉花咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的克隆及表达

根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术首次从棉花中克隆了一个CCoAOMT基因,命名为GhCCoAOMT1(GenBank登录号为FJ848871).研究结果表明:GhCCoAOMT1基因cDNA全长960 bp,具有一个753 bp的开放阅读框,5'非编码区为9 bp,3'非编码区为198 bp,编码250个氨基酸,预测分子量约为28.306 kDa,等电点为5.39.利用PCR方法克隆了GhCCoAOMT1基因的基因组序列,长度为1 311 bp,包含5个外显子和4个内含子.氨基酸同源性分析发现,GhCCoAOMT1与来自毛白杨、烟草和苎麻的CCoAOMT同源性较高.半定量RT-PCR检测表明,GhCCoAOMT1基因在棉花各个组织中都有表达,其中茎部的表达量最高,其次表达量依次为根>花瓣>子叶>10 d纤维>雄蕊>胚珠>叶.     

陆地棉干旱胁迫相关基因GhTrx的克隆及表达

采用RACE和RT-PCR技术,克隆了陆地棉干旱胁迫硫氧还蛋白基因,利用荧光定量PCR技术分析该基因在不同组织和不同时期的表达情况.结果表明,陆地棉硫氧还蛋白基因(GhTrx)的cDNA全长1 340 bp,其中ORF 864 bp,推测编码288个氨基酸.该基因编码蛋白与杨树、蓖麻、拟南芥的相似性分别为70%、72%和76%,系统发育树分析显示,GhTrx与蓖麻中该蛋白的亲缘关系最近.RT-PCR分析显示,GhTrx基因表达受干旱胁迫诱导,在干旱诱导下,该基因在抗旱材料中H177中上调表达,在根中的表达量明显高于叶.研究表明,GhTrx基因在干旱胁迫时根部进行大量表达,对抵御外界的干旱威胁起到关键作用,可能对提高陆地棉抗旱性方面具有一定的作用.     

棉花Gh4CL1基因克隆及表达

根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的4-香豆酸辅酶A连接酶基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术从棉花中克隆了1个4CL基因,命名为Gh4CL1(GenBank登录号为FJ479707).结果表明:Gh4CL1基因cDNA全长2 331 bp,具有1个1 722 bp的开放阅读框,5′非编码区为64 bp,3′非编码区为445 bp,编码573个氨基酸,预测分子量约为61.951 kD,等电点为5.70.氨基酸同源性分析发现,Gh4CL1与来自白杨、大豆和紫草的4CL同源性较高.半定量RT-PCR检测表明,Gh4CL1基因在不同发育阶段的棉纤维中均有表达,在开花后20 d的棉纤维中表达量最大,说明该基因可能参与调控棉纤维细胞的伸长和次生壁的增厚.Gh4CL1基因在棉花花瓣中表达量最高,在其他组织中低水平表达或不表达.