敲除集胞藻PCC 6803中编码乳酸脱氢酶的slr1556基因对生物合成乙醇的影响

探究在集胞藻PCC 6803中引入外源乙醇合成基因并敲除集胞藻PCC 6803中编码乳酸脱氢酶的slr1556基因对生物合成乙醇的影响。在集胞藻PCC 6803中引入来源于运动型发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因（pdc）与大肠杆菌的NADPH依赖型醛还原酶基因（yqhD）光强启动子PrbcL的驱动下组合表达,生物合成乙醇。在此基础上进一步敲除集胞藻PCC 6803中编码乳酸脱氢酶的slr1556基因,以提高乙醇合成前体丙酮酸含量,促进乙醇的生产。结果显示敲除slr1556基因可以提高丙酮酸含量并显著增加乙醇的产量。竞争性丙酮酸转化乳酸代谢途径的阻断可以有效促进丙酮酸的累积,进而促进乙醇的生产。     

集胞藻PCC 6803高产精氨酸藻株的紫外诱变选育

精氨酸在医药和食品工业上具有广泛用途。集胞藻PCC 6803是单细胞蓝藻, 能利用工业废气(主要成分是氮氧化物NO_x)与水反应生成的硝酸盐和亚硝酸盐合成氨基酸等化合物, 因而选育高产精氨酸藻株, 不仅能提高精氨酸产量, 而且能去除工业废气中的NO_x, 具有潜在的应用前景。研究在集胞藻PCC 6803中利用紫外诱变, 筛选抗0.8 g/L D-精氨酸和抗0.2 g/L 6-氮尿嘧啶的突变株, 选育到了一株精氨酸产量显著提高的突变株#13807-111-55, 它每OD₇₃₀值细胞的胞外精氨酸产量相比出发株提高了62.3倍, 达到(0.76±0.1) mg/(L·OD₇₃₀), 总精氨酸产量相比出发株提高了6.0倍, 达到(0.82±0.08) mg/(L·OD₇₃₀)。该突变株每OD₇₃₀值细胞的胞外精氨酸产量明显高于胞内, 表明该突变藻株是精氨酸分泌型, 因而具有潜在的应用前景。     

集胞藻PCC6803中基因slr1761突变体的构建

PCR扩增了集胞藻PCC6803的slr1761基因,进一步以PGEM-T为载体将其克隆到大肠杆菌中,构建了P1761质粒。通过DNA体外重组,以卡那霉素抗性基因插入目的基因片段,构建了既含目的基因上游及下游序列、又携带选择性标记卡那霉素抗性的PK1761质粒。该质粒转化野生型集胞藻PCC6803细胞,利用同源重组原理获得了能在含卡那霉素的培养基上正常生长的基因敲除突变株。对该突变株基因组DNA进行PCR扩增,验证了其基因结构的正确性。     

RNA解旋酶基因crhR对于集胞藻PCC6803低温适应的作用

蓝藻对低温胁迫的适应涉及许多基因的表达调控,RNA解旋酶基因crhR即是其中之一。研究检查了该基因在集胞藻PCC6803从30℃转到15℃后的转录情况,观察到在2h内有瞬时诱导表达。该基因失活导致集胞藻在15℃下几乎不能生长,光合作用和呼吸速率大幅下降,脂质过氧化物不能被有效清除。以PrbcL过量表达crhR基因可互补突变株表型,并且在低温下生长略优于野生型。在野生型中,低温诱导脂肪酸脱饱和酶基因desA、desB、desD表达上调,膜脂不饱和度增加;而在crhR突变株中,低温诱导的desB基因的上调表达显著削弱,同时多不饱和脂肪酸含量没有显著增加。推测crhR基因可能影响蓝藻在低温胁迫下的蛋白合成或通过伴侣蛋白发挥影响。       

ClpP2蛋白失活对集胞藻PCC6803生长、光合作用和蛋白质组的影响

【背景】蛋白酶能够降解细胞中错误折叠或是无功能的蛋白,Clp家族蛋白就是一类重要的蛋白酶复合物。Clp蛋白酶复合物的水解核心是ClpP,集胞藻PCC6803中存在4种不同的ClpP蛋白,分别为ClpP1-ClpP4。作为重要的蛋白水解复合物的功能组分,目前对集胞藻ClpP的研究十分有限,对其生理功能与调控底物的研究甚少。【目的】选择集胞藻为研究对象探究ClpP2蛋白的功能,鉴定其潜在底物,为集胞藻ClpP2作用机制提供实验支撑。【方法】构建集胞藻ClpP2突变株(ΔClpP2),进行其生长实验和光合生理功能研究。通过标记定量蛋白质组学技术(isobaric tag for relative absolute quantitation, iTRAQ)鉴定ClpP2调控的靶标蛋白,生物信息学分析底物蛋白参与的代谢通路,最后利用平行反应监测(parallel reaction monitoring, PRM)技术对部分定量数据进行验证。【结果】ΔClpP2可以在自然条件下光合自养生长至对数生长期,但高光或高温胁迫下则无法正常生长。相较于野生型,ΔClpP2有着显著降低的PSⅡ电子传递效率及P...     

集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803脂质组的分析

以集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803为研究对象,研究建立了基于超高效液相色谱耦合串联质谱技术脂质组学分析方法.鸟枪法脂质组学通过电喷雾离子化有效分离油脂粗提物中所含单个脂质分子,在三重四极杆扫描碎片离子,能够利用特征片段离子鉴定光合甘油酯的种类和酰基组成,具有高效、灵敏度高和质量准确度高等优点.对...     

groESL启动子提高集胞藻6803外源egfp基因表达效率的研究

利用聚球藻7942中热激蛋白基因groESL的启动子(PgroESL)驱动外源egfp基因在集胞藻6803(Syn-echocystis sp.PCC6803)中的表达,通过蛋白免疫印迹技术研究不同温度条件下该外源基因的表达情况。结果表明,42℃诱导30min后,PgroESL启动子能显著提高转基因藻Pg中外源egfp基因的表达,使外源基因的表达量比正常温度条件下提高3.4倍。研究表明,聚球藻7942中groESL操纵子的启动子区域是一类可以受温度诱导的强启动子,能够显著提高宿主细胞中外源基因的表达效率。     

ggpS基因过表达对集胞藻PCC 6803甘油葡萄糖苷和甘油合成的影响

为了研究甘油葡萄糖苷磷酸合成酶(GgpS)在集胞藻PCC 803甘油葡萄糖苷和甘油合成中的作用,本研究在前期获得高产甘油葡萄糖苷藻株的基础上分别过量表达来自于集胞藻PCC 6803自身和聚球藻PCC7002的甘油葡萄糖苷磷酸合成酶基因ggpS,并测定了在不同浓度NaCl胁迫时突变藻株的甘油葡萄糖苷和甘油积累量。结果发现获得的突变株甘油葡萄糖苷合成没有提高,但是甘油合成显著增强。此外,当培养基NaCl浓度从600 mmol/L提高到900 mmol/L时,集胞藻PCC 6803自身ggpS过表达藻株的甘油合成进一步提高75%。这些结果显示了GgpS在将碳代谢流导入集胞藻甘油合成途径中的作用。研究成果也为进一步通过基因工程改造提高集胞藻甘油葡萄糖苷和甘油合成效率奠定了基础。     

集胞藻PCC 6803中丝氨酸/苏氨酸激酶SpkC对高温胁迫的响应

丝氨酸/苏氨酸激酶是蓝藻感知和转导外界刺激的重要元件,但至今蓝藻中很多丝氨酸/苏氨酸激酶的功能尚属未知。【目的】研究集胞藻PCC6803中的丝氨酸/苏氨酸激酶Spk C是否参与对高温胁迫的响应。【方法】本研究采用同源重组的方法构建spC基因完全敲除突变株,检测突变株与野生株在高温胁迫下的生长状况、色素组成,并对高温胁迫下叶绿素荧光参数差异进行分析,比较光合系统Ⅱ活性差异。此外,通过测定生长速率来判断高温胁迫后藻株的恢复情况。【结果】经过42℃高温胁迫后,与野生株相比,突变株ΔspkC生长减缓,光合色素(叶绿素、类胡萝卜素和藻胆色素)的含量降低;45℃高温胁迫下突变株ΔspkC的光合系统Ⅱ活性下降幅度更大;经过5 d 42℃高温处理后,突变株生长几乎停滞,存活率较野生株明显降低。【结论】集胞藻PCC 6803中spkC基因的缺失导致突变株对高温胁迫响应出现缺陷,提示丝氨酸/苏氨酸激酶SpkC参与响应高温胁迫。     

集胞藻PCC6803高效基因表达平台的构建与评价

针对蓝细菌代谢工程改造的需求,成功构建了可以在模式蓝细菌菌株集胞藻PCC6803中高效表达外源基因的3个基因组整合表达平台,以及1个可以在多株蓝细菌中表达的广宿主穿梭表达平台。该表达平台通过选用集胞藻PCC6803中1,5-二磷酸核酮糖缩化酶/氧化酶的启动子驱动外源基因的表达,应用“SD-AUG”翻译融合的策略提高外源蛋白翻译效率,以及加入终止子序列Trbc以提高转录终止效率,实现了对外源基因的高效表达。利用lacZ作为报告基因,检测了所构建表达平台pFQ20在集胞藻中的基因表达效率,结果显示β-半乳糖苷酶的活性为109 Miller。同时,基于pFQ20表达平台在集胞藻PCC6803中表达了来自大肠杆菌的硫酯酶基因tesA’,蛋白印迹实验结果显示了硫酯酶的成功表达。该表达平台为在蓝细菌中开展遗传研究及基因工程改造提供了有用的遗传工具,其构建策略为在蓝细菌中构建高效稳定的外源基因表达元件提供了借鉴。     

增强型绿色荧光蛋白在集胞藻6803中的表达

利用聚球藻7942热休克基因groESL的启动子和报告基因egfp,构建了表达载体pUC-Tegfp并转化集胞藻6803,并通过所制备抗体对转基因藻进行蛋白免疫印迹检测.结果发现,在转基因藻株T-egfp的细胞粗提液中含有能与eGFP抗体特异结合的蛋白质,表明外源增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)在集胞藻6803中成功表达.     

硫代硫酸钠对蓝细菌Synechocystis sp. PCC 6803生长在含葡萄糖培养基中所产生的一种新糖脂的影响

当蓝细菌Synechocystis sp. PCC 6803在添加葡萄糖的BG-11培养基中培养时,细胞出现了一种新脂.这种脂经浓硫酸/α-萘酚染色反应证实为糖脂,记为糖脂-x.这一糖脂的出现伴随着其他脂、尤其是双半乳糖甘油二酯含量的下降.此外,在添加果糖、麦芽糖、乳糖等其他碳源的培养基中生长的细胞中也检测到这一糖脂.活性氧猝灭剂硫代硫酸钠加入到培养基中能有效地抑制糖脂x的出现.当在BG-11培养基中加入0.3%硫代硫酸钠后,糖脂x仅能在培养基中添加高浓度(100 mmol/L)的葡萄糖且细胞生长处于后指数期时检测到.这些结果表明蓝细菌Synechocystis sp. PCC 6803细胞在含葡萄糖的培养基中生长出现的一种新糖脂可能与活性氧有关.     

Proteomic analysis of heterotrophy in Synechocystis sp. PCC 6803

To provide an insight into the heterotrophic metabolism of cyanobacteria, a proteomic approach has been employed with the model organism Synechocystis sp. PCC 6803. The soluble proteins from Synechocystis grown under photoautotrophic and light-activated heterotrophic conditions were separated by 2-DE and identified by MALDI-MS or LC-MS/MS analysis. 2-DE gels made using narrow- and micro-range IPG strips allowed quantitative comparison of more than 900 spots. Out of 67 abundant protein spots identified, 13 spots were increased and 9 decreased under heterotrophy, representing all the major fold changes. Proteomic alterations and activity levels of selected enzymes indicate a shift in the central carbon metabolism in response to trophic change. The significant reduction in light-saturated rate of photosynthesis as well as in the expression levels of rubisco and CO(2)-concentrating mechanism proteins under heterotrophy indicates the down-regulation of the photosynthetic machinery. Alterations in the expression level of proteins involved in carbon utilization pathways refer to enhanced glycolysis, oxidative pentose phosphate pathway as well as tricarboxylic acid cycle under heterotrophy. Proteomic evidences also suggest an enhanced biosynthesis of amino acids such as histidine and serine during heterotrophic growth.     

硫代硫酸钠和葡萄糖对Synechocystis sp.PCC 6803细胞甘油酯及其脂肪酸组成的影响

对生长在添加有不同浓度的葡萄糖、硫代硫酸钠培养基中的蓝细菌Synechocystis sp.PCC 6803中的甘油酯及其脂肪酸组成进行比较.结果表明:硫代硫酸钠能有效地增加膜脂中硫代异鼠李糖二酰基甘油(SQDG)和磷脂酰甘油(PG)的百分含量,培养基中同时添加葡萄糖时能抵消硫代硫酸钠的这一效应.此外,硫代硫酸钠能显著增加单半乳糖甘油二酯(MGDG)、双半乳糖甘油二酯(DGDG)中十六碳酸(C16:0)的百分含量,这一效应也能为葡萄糖消除.硫代硫酸钠不能显著地改变SQDG中C16:0的百分含量,加入葡萄糖时能降低C16:0的百分含量.这些结果说明硫代硫酸钠可能充当一种还原剂使膜脂处于一种低的不饱和状态,同时加入葡萄糖时能降低硫代硫酸钠的还原力.此外,硫代硫酸钠还可作为SQDG合成中的硫供体.     

A large-scale protein protein interaction analysis in Synechocystis sp. PCC6803.

Protein-protein interactions (PPIs) play crucial roles in protein function for a variety of biological processes. Data from large-scale PPI screening has contributed to understanding the function of a large number of predicted genes from fully sequenced genomes. Here, we report the systematic identification of protein interactions for the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. Using a modified high-throughput yeast two-hybrid assay, we screened 1825 genes selected primarily from (i) genes of two-component signal transducers of Synechocystis, (ii) Synechocystis genes whose homologues are conserved in the genome of Arabidopsis thaliana, and (iii) genes of unknown function on the Synechocystis chromosome. A total of 3236 independent two-hybrid interactions involving 1920 proteins (52% of the total protein coding genes) were identified and each interaction was evaluated using an interaction generality (IG) measure, as well as the general features of interacting partners. The interaction data obtained in this study should provide new insights and novel strategies for functional analyses of genes in Synechocystis, and, additionally, genes in other cyanobacteria and plant genes of cyanobacterial origin.     

集胞藻6803NdhO蛋白多克隆抗体制备及其初步应用

蓝藻NADPH脱氢酶(NDH-1)是一种重要的光合膜蛋白复合体,参与CO2吸收、围绕光系统I的循环电子传递和细胞呼吸.迄今为止,人们在蓝藻细胞中已鉴定出17种NDH-1复合体亚基(NdhA-NdhQ).最近,人们还获得了NdhO亚基的缺失突变株.然而,人们对NdhO亚基的研究还不充份,至今仍不清楚它的功能角色.通过PC...     

蓝细菌6803agp基因的分子克隆和缺失突变株的构建

PCR扩增了蓝细菌集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC6803)的agp基因（编码ADP－葡萄糖焦磷酸羧化酶）,进一步以pUC118为载体将其克隆到大肠杆菌中,构建了pUCA质粒。通过DNA体外重组,以红霉素抗性基因部分取代agp基因片段,构建了既含agp基因上游及下游序列、又携带选择性标记－红霉素抗性的pUCAE质粒。该质粒转化野生型集胞藻6803细胞,获得了能在含红霉素的培养基上正常生长的agp基因缺失突变株。对该突变株基因组DNA进行PCR扩增,验邝了其基因结构的正确性。突变株细胞生长速度较野生型细胞快,胞内的叶绿素含量比野生型细胞高,表明该突变株具有较高的光合效率。在突变株中未检测到糖原的存在,进一步从生理水平上验证了突变株构建的正确性。