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凝血酶激活的单链尿激酶型纤溶酶原激活剂的构建、表达、纯化和性质研究 总被引:3,自引:0,他引:3
用Kunkel突变法,将单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(scu-PA)cDNA基因中编码Pro155—Lys158的片段定点突变,并将此突变的scu-PA(tscu-PA)的cDNA克隆到表达载体pCM-β-neo中,与pCM-dhfr共转染CHO/DHFR-细胞.获得的稳定表达株在无血清培养基中24h的表达量为620IU/106细胞.经锌离子螯合Sepharose亲和层析得到tscu-PA纯品.SDS-PAGE显示tscu-PA分子量为53kD左右,与预期的结果相符.tscu-PA是由凝血酶激活而不是由纤溶酶激活,但激活后也能转变为双链分子(tcu-PA).tscu-PA仍保持了scu-PA的血纤维蛋白亲和性.酶动力学研究表明,激活后的tscu-PA水解S2444的Km和Kcat值与高分子量尿激酶(HUK)相似.体外溶栓实验结果表明,tscu-PA可以选择性地溶解富含凝血酶的血凝块,对贫凝血酶的血凝块作用不大 相似文献
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尿激酶型纤溶酶原激活剂的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
尿激酶型纤溶酶原激活剂u-PA(urokinase-type plasminogen activator)属于丝氨酸蛋白酶类,能激活细胞外基质中丰富的纤溶酶原生成纤溶酶,从而催化细胞外基质降解,对纤溶和癌细胞侵染及扩散等一系列生理和病理过程中发生的胞外蛋白水解起重要调节作用。 人u-PA基因位于第10号染色体之上,表达产生一个约54kD的单链糖基化多肽——尿激酶原。尿激酶原经纤溶酶在其158位赖氨酸 相似文献
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本文报道了培养的人黑色素瘤细胞分泌的组织纤溶酶原激活剂(t-PA)的纯化方法。Bowes株人黑色素瘤细胞的分泌产物,经CM-Sephadex C--50层析,赖氨酸-Sepharose 4B,苯甲眯-sepharose 4B亲和层析后,即可得到纯化470倍的蛋白纯品。样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为均一单带,测得其分子量约为72kD。纯化的t-PA与尿激酶相比较,发现前者有更高亲和纤维蛋白的能力。 相似文献
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组织型纤溶酶原激活剂A链与尿激酶原B链嵌合分子的构建与表达 总被引:1,自引:0,他引:1
利用 D N A 重组技术和定位删除技术,将组织型纤溶酶原激活剂(t P A)的 A 链( Serl Thr263)基因与尿激酶原(pro U K)的 B链( Ser138 Leu411)基因相连,得到嵌合分子基因tu pa,并在昆虫杆状病毒系统中进行表达,表达量可达 500 I U/m l.经单克隆抗体免疫亲和层析纯化细胞表达上清液,得到tu P A 嵌合分子,其比活为 200 000 I U/m g 蛋白. S D S P A G E 及 W estern blot 鉴定证明此表达产物分子量约为 60 k D,与预期值相符.纤维蛋白平板测活及纤维蛋白亲和性分析初步证明,此嵌合分子的溶纤活性与pro U K 相近,而纤维蛋白亲和性高于 pro U K. 相似文献
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猪心组织型纤溶酶原激活剂的纯化鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
本文介绍了一种简便易行的纯化组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的方法。新鲜猪心组织经丙酮脱脂脱水,制成干粉,再经醋酸钾缓冲液提取。提取液经阳离子交换柱、肝素柱亲和层析及凝胶柱层析分离纯化。经SDS凝胶电泳分析证明纯化的t-PA只在分子量为67000道尔顿位置出现一条染色带。同时把该蛋白带转移到纤维蛋白板上,也在同一位置出现溶解带。 相似文献
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张震元 《中国生物工程杂志》1991,11(5):54-55
一、产品概述 TPA是由人的血管内皮细胞产生的527个氨基酸序列组成的糖蛋白,其分子量为3万多至7万。它具有称之为索眼的结构,对构成血栓的纤维蛋白有亲和性。 血栓是血管内产生的血块,血栓一旦产生,身体末端的微细血管堵塞,导致手脚麻痹、脑梗塞、心肌梗塞等病症。 相似文献
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人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体FrGGI的构建、表达及特性分析 总被引:4,自引:0,他引:4
为了获得半衰期延长,特异活性提高及具有PAI—1抗性的新型t-PA溶栓剂,利用基因重组及定位突变技术成功地构建了t-PA的K1、K2区糖基化位点消除,PAI-1结合位点缺失,F与E区连接序列His44~Ser50置换为纤粘蛋白Ⅰ型F区间连接序列GluSerLysProGluAlaGluGlu的t-PA的组合突变体FrGGI,并在中国仓鼠卵巢细胞中获得了高效表达。对表达产物的生物学特性分析表明,FrGGI在大鼠血浆中的半衰期延长了15倍,特异活性提高了40%,并获得了PAI-1抗性,是一株很有希望的新型溶栓剂候选株。 相似文献
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蚯蚓体内一种纤溶酶原激活剂(e-PA)的分离纯化 总被引:21,自引:4,他引:21
为获得一种高效,低廉的溶栓药物,从赤子爱胜蚓(Eiseniafaetida)体内分离纯化出一种可体外激活纤溶酶原从而间接降解纤维蛋白的酶(e-PA).纯化过程包括:粗品的盐析,离子交换层析,凝胶过滤层析及疏水相互作用层析.该组份是由二个亚基通过疏水相互作用维系在一起的.通过凝胶过滤层析,可测得全酶的分子量为45000;SDS电泳显示大、小亚基的分子量分别是26000与18000;而质谱法测得的大、小亚基的分子量分别为24556.7与15546.6.对大小亚基进行了氨基酸组成分析,结果显示大亚基不含Lys而小亚基不含Cys.测定了大亚基N端25个氨基酸序列:VIGGTNASPGEIPWQLSQQRQSGSW.并与部分已知蛋白质序列进行了比较.e-PA在纤维蛋白平板上表现有三种不同的纤溶活性 相似文献
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利用所构建的乳腺表达组织纤溶酶原激活剂突变体(La-tPA)载体.对540枚小鼠受精卵进行显微注射,经PCP和Southernblot检测,获得6只整合有人La-tPA转基因小鼠.为了精确研究转基因在小鼠体内的表达,采用RT-PCP方法测定转基因鼠在泌乳期1~20dLa-tPA基因的转录,结果表明,在转基因鼠乳腺的La-tPAmRNA水平在10~15d最高,在20d时降为最低.外源基因在转基因小鼠乳腺的表达规律研究为未来利用转基因动物生产La-tPA提供依据 相似文献
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用PCR方法从pPAIJ.7中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)cDNA,与pUC18重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人PAI-2cDNA.PAI-2cDNA与原核表达载体重组,构建原核表达质粒并转化大肠杆菌.经温度诱导表达,重组PAI-2占全菌总蛋白的14%,以可溶性形式存在,具纤溶抑制活性.工程菌发酵、压榨后,用硫酸铵分级沉淀,沉淀物经分子筛、离子交换和疏水性色谱的分离,每升菌液可获得约30mg纯度达90%的蛋白质,比活性为11866AIU/mg蛋白质,得率为19.2%. 相似文献
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嵌合蛋白 ut- PA( u- PA与 t- PA的嵌合型纤溶酶原激活剂 )基因删除编码 u- PA中 R1 78—R1 81的 1 2个核苷酸后 ,得到的嵌合分子 ut- PA( 1 )在昆虫细胞 sf- 9中表达 ,通过苯甲脒 -Sepharose 6B亲和柱层析对表达产物进行纯化 .得到的纯品走 SDS- PAGE,结果显示 ,其分子量为60 k D.血凝块溶解实验结果表明 ,嵌合分子 ut- PA( 1 )有良好的体外溶栓能力 .在不同剂量 PAI- 1的抑制条件下测定 ,亲本嵌合蛋白 ut- PA的活力分别下降 2 2 .7%和 1 3.8%时 ,嵌合分子 ut- PA( 1 )只分别下降了 1 2 .9%和 9.1 % .说明突变体 ut- PA( 1 )具有一定的对 PAI- 1抑制作用的抗性 相似文献
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蚯蚓体内一种纤溶酶原激活剂(e-PA)对ATEE的降解 总被引:3,自引:0,他引:3
赤子爱胜蚓(Eiseniafetida)体内的一种纤溶酶原激活剂(e-PA)能够降解人工合成底物N-乙酰-L-酪氨酸乙酯(ATEE),该降解反应的最适pH为8.5,而且在0.2mol/LNa2HPO4中的活性要强于在0.05mol/LTris-HCl(pH8.5)中.分别测定了e-PA的大小亚基及全酶在0.2mol/LNa2HPO4与0.05mol/LTris-HCl(pH8.5)两种体系中的Km和Kcat.结果表明,在0.2mol/LNa2HPO4中,全酶的ATEE活性远远高于大小亚基单独的ATEE活性,而在0.05mol/LTris-HCl(pH8.5)中则没有这种现象.从蛋白质结构的角度对这一结果作了解释.用不同抑制剂和e-PA作用,结果表明,pepstatin,E-64和EDTA对e-PA的ATEE活性都有不同程度的抑制,这一点与e-PA的BAEE活性不同. 相似文献
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蚯蚓体内一种纤溶酶原激活剂(e-PA)对BAEE的降解 总被引:2,自引:0,他引:2
以苯甲酰-L-精氨酸乙酯(benzoyl-L-arginineethylester,BAEE)为底物,研究了蚯蚓体内纤溶酶原激活剂(plasminogenactivatorfromEiseniafetida,e-PA)的酶学性质.酶促反应的最适pH为8.4,e-PA降解BAEE的Km为1.24±0.16×10-5mol/L,Kcat为13.80±4.02s-1.测定了构成e-PA的大,小亚基分别降解BAEE的Km和Kcat.结果表明,大亚基的Km与全酶的Km相差不多,但比小亚基小约10倍,即对底物的亲和力比小亚基强约一个数量级.大小亚基的Kcat比较接近,分别是全酶的1/6和1/3.研究了8种抑制剂对e-PA降解BAEE活性的影响,其中pepstatin和E-64(一种巯基抑制剂)对酶促反应有激活作用,TPCK,TL-CK,PMSF,chymostatin和leupeptin对其有不同程度的抑制作用,EDTA对e-PA的活性没有影响.对e-PA的BAEE活性和e-PA的纤溶活性之间作了比较. 相似文献
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为了获得半衰期延长,特异活性提高及具有PAI-1抗性的新型t-PA溶性剂,利用基因重组及定位突变技术构建了t-PA的K1、K2区糖基化位点消除,PAI-1结合位点缺失,F与E区连接序列His44 ̄Ser50置换为纤粘蛋白I型F区间连接序列Glu Ser Lys Pro Glu Ala Glu Glu的t-PA组合突变体FrGGI,并在中国仓鼠卵巢细胞中获得了高效表达,对表达产物的生物学特性分析表明 相似文献
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构建了二氢叶酸还原酶(dhfr)选择基因启动子上游无增强子(cnhancer)的组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)组合突变体FrGGI真核表达质粒pZLFrGGI。将pZLFrGGI酶切线性化,采用大剂量DNA电击介导法,转染dhfr基因缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-dhfr~-)。用氨甲喋呤(MTX)筛选转染细胞。混合加压后,挑选克隆,在1×10~(-7)mol/L MTX压力下,得到了表达水平达1500~2500IU/10~6细胞·24小时的细胞株。此细胞株表达水平稳定,形态良好,倍增时间为36小时,且有进一步提高表达水平的潜能,有望发展为工程细胞株。 相似文献
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重组组织型纤溶酶原激活剂的纯化和鉴定 总被引:3,自引:0,他引:3
介绍一种简便高效的两步纯化重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)的方法,产rt-PA的CHO工程细胞SGG培养上清,经微孔玻璃珠(MPG)吸附和赖氨酸-Sepharose 4B柱亲和吸附色谱纯化,纯化倍数平均达到380倍,比活性为390 000 U/mg蛋白,rt-PA活性回收率达到140%,经SDS-PAGE还原电泳分析主要为t-PA蛋白,其中高分子t-PA占80%左右.用纤维蛋白自显影法检测均有溶纤活性,蛋白质印迹证实具有t-PA的抗原性. 相似文献