人类博卡病毒(HBoV)非结构蛋白NS1基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

目的:克隆、表达、纯化人类博卡病毒(HBoV)非结构蛋白NS1,制备抗NS1多克隆抗体。方法:利用PCR扩增HBoV非结构蛋白NS1基因,将其克隆至pMAL-c2X表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌DH10B,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经Amylose Resin亲和层析柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。用间接ELISA法检测抗体效价。结果:原核表达融合蛋白MBP-NS1,并获得了其多克隆抗体,抗体效价达到1∶32000。结论:在原核表达系统中表达、纯化了融合蛋白,制备抗NS1多克隆抗体,为进一步研究该病毒非结构蛋白基因的转录和翻译机制提供可靠的工具。     

小鼠黑色素瘤相关抗原MART1的原核表达及抗体制备

目的:利用基因重组技术获得鼠黑色素瘤相关抗原MART1,并制备兔抗鼠多克隆抗体。方法:采用RT-PCR方法从小鼠黑素瘤B16-F1细胞株总RNA中扩增MART1的编码c DNA序列,并构建p ET32a-MART1原核表达质粒,将此质粒转化大肠杆菌Rosseta(DE3)菌株后用IPTG诱导表达,获得的MART1融合蛋白依次用Ni-NTA亲和层析和制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化,纯化的MART1融合蛋白用SDS-PAGE和Western印迹鉴定;以纯化的MART1融合蛋白为抗原,皮内接种日本大耳白兔,制备多克隆抗体,采用ELISA、Western印迹和细胞免疫荧光法分别检测兔血清中抗体的效价及抗原的特异性。结果:构建出MART1原核表达质粒,小鼠MART1基因在大肠杆菌Rosseta(DE3)中可诱导性表达并有效纯化;用纯化的MART1蛋白在日本大耳白兔中制备出高效价的多克隆抗体(效价1∶1 024 000),该抗体可与原核及真核表达的MART1蛋白特异性结合。结论:建立了鼠MART1蛋白原核表达和纯化技术,制备出的高效价和特异性抗MART1多克隆抗体将为黑色素瘤的防治研究提供技术支撑。     

棉蚜His-CYP6J1融合蛋白的分离纯化及多克隆抗体的制备

通过亲和层析法纯化棉蚜His-CYP6J1融合蛋白,制备及鉴定其多克隆抗体。采用镍离子金属螯合亲和层析柱分离纯化棉蚜His-CYP6J1融合蛋白,SDS-PAGE检测纯化产物。用纯化得到的His-CYP6J1融合蛋白免疫小鼠,制备抗棉蚜P450CYP6J1多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体效价;免疫组化法检测抗血清特异性。结果表明,纯化的His-CYP6J1融合蛋白免疫小鼠后得到多抗血清,ELISA法检测抗血清效价达1∶200 000。免疫组化结果显示,此多克隆抗体能够与棉蚜P450 CYP6J1天然蛋白特异性结合,却在棉铃虫没有发现相应的结合反应。上述结果对研究棉蚜单一P450蛋白结构、功能及其在棉蚜抗药性形成过程的作用奠定基础。     

Tamdy病毒糖蛋白基因的重组表达及抗体制备

原核表达Tamdy病毒（Tamdy virus,TAMV）糖蛋白Gn和Gc,分别制备兔抗融合蛋白Gn和Gc多克隆抗体。利用RT-PCR扩增Gn和Gc基因片段,分别构建原核表达质粒pET-28a-Gn和pET-32a-Gc,并在E.coli BL21(DE3)中诱导表达,镍柱亲和层析纯化融合蛋白Gn和Gc之后,以皮下注射方式分别免疫新西兰兔,制备兔抗融合蛋白Gn和Gc多克隆抗体。经Western Blotting和间接免疫荧光（IFA）鉴定多克隆抗体抗原识别能力,ELISA法测定抗体效价。结果显示,pET-28a-Gn、pET-32a-Gc原核表达质粒构建正确,融合蛋白Gn和Gc大小分别约为45 kD、74 kD,制备的兔抗融合蛋白Gn和Gc多克隆抗体能够分别识别原核表达的融合蛋白Gn和Gc和真核表达产物,效价分别为1∶409 600、1∶204 800。制备的多克隆抗体效价高,能够特异性识别原核系统和真核系统表达的TAMV糖蛋白,为TAMV的流行学分析提供基础。     

兔抗人热激蛋白70样蛋白1多克隆抗体的制备与初步鉴定

目的：制备兔抗人热激蛋白70样蛋白1（HSP70L1）的多克隆抗体并进行初步鉴定。方法：在大肠杆菌中重组表达融合蛋白GST-HSP70L1和His-HSP70L1并纯化;将GST-HSP70L1融合蛋白用于免疫新西兰大耳白兔获得多克隆抗体,用His-HSP70L1对抗血清进行分离纯化,得到抗HSP70L1多克隆抗体,用Western印迹、免疫沉淀对其进行初步鉴定。结果：获得了高表达的GST-HSP70L1和His-HSP70L1重组融合蛋白;纯化获得抗HSP70L1抗体,此抗体可用于Western印迹和免疫沉淀实验。结论：获得了兔抗人HSP70L1的多克隆抗体,为进一步研究HSP70L1的生物功能提供了有用的工具。     

Nono蛋白的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

目的表达和纯化带多聚组氨酸（6×His）标签的Nono （ non-POU-domain-containing, octamer-binding protein ）融合蛋白并制备抗Nono多克隆抗体。方法构建pET-28a（＋）-Nono重组表达质粒,转入Rosetta（DE3）大肠埃希菌,以IPTG诱导6×His-Nono融合蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化出的蛋白免疫BALB／C小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA检测多克隆抗体的效价,Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-Nono融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫小鼠,获得了高特异性的抗Nono抗血清。结论成功构建pET-28a（＋）-Nono原核表达质粒,表达并纯化出高纯度的目标蛋白,制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体。     

牙鲆HRI多克隆抗体的制备及病毒诱导的组织表达分析

血红素调节的eIF2a激酶HRI是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,在血红素缺乏和热休克等胁迫存在时,通过磷酸化底物eIF2a调控真核细胞的蛋白合成。牙鲆PoHRI是在鱼类鉴定的第一个HRI基因。PCR克隆编码PoHRI蛋白1-200氨基酸的cDNA片段,定向插入pET32a构建表达载体。IPTG诱导,随后利用Ni^2＋-NTA亲和层析柱纯化,成功获得预期大小的融合蛋白。将纯化的融合蛋白免疫小鼠获得抗PoHRI多克隆抗体,抗体中和实验进一步证实了抗PoHRI多克隆抗体对PoHRI蛋白的特异性识别。在健康的牙鲆组织中能检测到PoHRImRNA和蛋白的组成型表达。人工感染大鳞鲆弹状病毒SMRV诱导相应组织PoHRI的表达明显上调。结果表明,PoHRI是一种在牙鲆组织中广泛表达的蛋白,可能在抗病毒免疫反应中发挥某种功能。     

家蚕GAPDH内参蛋白多克隆抗体的制备及其检测

制备家蚕GAPDH内参蛋白多克隆抗体,并对该抗体进行检测。利用PCR技术从家蚕中克隆GAPDH基因,构建其原核表达载体,转化大肠杆菌,诱导表达重组蛋白并纯化。纯化后的蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔制备GAPDH多克隆抗体。用酶联免疫吸附法和Western blot检测抗体的效价和特异性。结果显示,成功构建GAPDH/p ET-28a原核表达载体,获得高纯度的GAPDH重组融合蛋白;经SDS-PAGE和抗His单抗检测,纯化后蛋白的分子量大小与预测的一致;以该蛋白为免疫抗原,采用4次免疫方式对新西兰大白兔进行免疫,获得GAPDH多克隆抗体血清。酶联免疫吸附检测结果表明,GAPDH抗体的效价为1:8000,并能与天然家蚕蛋白特异性结合。成功制备了家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体,为深入研究家蚕中不同蛋白的生理功能和作用奠定了坚实的基础。     

JC病毒衣壳蛋白VP1多克隆抗体的制备

目的制备pET-32a(+)-VP1蛋白的多克隆抗体。方法用纯化后的VP1蛋白分4次免疫兔子,颈动脉插管法取血,制得多克隆抗体。结果用ELISA法和Western blot鉴定多克隆抗体的效价得1?320000。该抗体可以用Western blot法检测出59 kD左右的VP1蛋白。结论成功制备高效价的JC病毒衣壳蛋白VP1多克隆抗体。     

真核细胞表达单纯疱疹病毒Ⅰ型包膜糖蛋白B及其抗原性与免疫原性分析

为在真核细胞中表达并纯化I型单纯疱疹病毒(HSV I)包膜糖蛋白gB,并分析其抗原性和免疫原性,化学合成了包膜糖蛋白gB1胞外区基因片段,构建真核表达载体,并转染至HEK293细胞,表达的蛋白用羊抗HSV1+HSV2血清作为一抗,用ELISA检测其抗原性;用纯化的gB1蛋白免疫昆明小鼠,观察诱发抗体产生的时间及其效价,并用ELISA和Western blot检测小鼠抗gB1多克隆抗体特异性识别重组gB1抗原的能力,评价其免疫原性。结果显示在HEK293细胞中成功表达重组gB1蛋白,ELISA证实羊抗HSV1+HSV2多抗能够识别重组gB1蛋白;重组gB1蛋白免疫小鼠7周后,小鼠血清中多克隆抗体效价达到5×103,表明在真核细胞中高效表达并纯化的重组gB1蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,为HSV检测试剂和疫苗研究提供了理论基础。     

鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的用RT-PCR技术扩增鸭坦布苏病毒(DTMUV)AH-F10株E基因,并克隆至pET32a(+)载体,构建重组表达质粒pET32a-E,表达E蛋白。方法重组表达质粒转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导后,获得含6个His标签的融合蛋白,大小约54kDa。表达的蛋白以包涵体形式存在。对目的蛋白进行纯化,用纯化的E蛋白免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体血清。结果SDS-PAGE和Western blot试验结果表明E基因在大肠埃希菌中成功表达,并能与抗DTMUV多克隆抗体产生特异性反应,具有良好的反应原性。间接免疫荧光试验表明免疫小鼠后获得的多克隆抗体能与DTMUV反应。结论本研究为DTMUV新型疫苗和诊断试剂盒的进一步研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌flaA基因表达载体的构建和产物免疫性的鉴定

采用高保真PCR从幽门螺杆菌Y0 6株DNA中扩增全长flaA基因片段 ,T A克隆后测定核苷酸序列 ,构建 pET32a的flaA表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达 ,采用Hp全菌抗体的westernblot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。所克隆的flaA基因核苷酸和氨基酸序列与文献报道的同源性分别为 96 .2 8%～ 97.13%和 99.4 1%～ 10 0 %。pET32a flaA BL2 1DE3系统表达的FlaA融合蛋白量高达细菌总蛋白的 4 0 %～ 5 0 %。FlaA融合蛋白能与Hp全菌抗体及家兔免疫血清发生结合反应。     

兔抗肠道病毒71型截短VP1抗体的制备及鉴定

目的制备兔抗肠道病毒71型(EV71)截短VP1多克隆抗体,为EV71基础研究奠定基础。方法 RT-PCR扩增EV71VP1-N160基因(480 bp),以p GEX-6p-1为表达载体,构建重组表达质粒p GEX-6p-1-VP1-N160,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-VP1-N160融合蛋白,并对其进行纯化。以纯化的GST-VP1-N160融合蛋白作为免疫原,经背部皮下免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,ELISA检测多克隆抗体效价,间接免疫荧光法和免疫印迹检测抗体特异性。结果经双酶切鉴定,表明重组表达质粒p GEX-6p-1-VP1-N160构建正确;GST-VP1-N160融合蛋白相对分子质量为35 000~55 000,主要为不可溶性包涵体形式,其在大肠杆菌中高效表达;纯化后目的蛋白纯度约为95%,蛋白质量浓度1.9 mg/m L;免疫家兔后,免疫血清效价可达1012,抗VP1-N160多克隆抗体可以识别EV71原核表达的重组蛋白及天然病毒抗原中的VP1,特异性好。结论成功制备了抗EV71截短VP1多克隆抗体。     

真核细胞表达单纯疱疹病毒I型包膜糖蛋白B及其抗原性与免疫原性分析

为在真核细胞中表达并纯化I型单纯疱疹病毒（HSV I）包膜糖蛋白gB,并分析其抗原性和免疫原性,化学合成了包膜糖蛋白gB1胞外区基因片段,构建真核表达载体,并转染至HEK293细胞,表达的蛋白用羊抗HSV1+HSV2血清作为一抗,用ELISA检测其抗原性;用纯化的gB1蛋白免疫昆明小鼠,观察诱发抗体产生的时间及其效价,并用ELISA和Western blot检测小鼠抗gB1多克隆抗体特异性识别重组gB1抗原的能力,评价其免疫原性。结果显示在HEK293细胞中成功表达重组gB1蛋白,ELISA证实羊抗HSV1+HSV2多抗能够识别重组gB1蛋白;重组gB1蛋白免疫小鼠7周后,小鼠血清中多克隆抗体效价达到5×103,表明在真核细胞中高效表达并纯化的重组gB1蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,为HSV检测试剂和疫苗研究提供了理论基础。     

HIV-1 tat基因改造及其蛋白表达、纯化与抗体制备

目的:为了方便实验室工作中HIV-1B'/C亚型及C亚型Tat蛋白的检测,制备了相应的Tat蛋白及其抗体。方法:将我国HIV-1B'/C亚型流行株tat基因的第1个外显子和HIV-1C亚型tat基因的第2个外显子融合在一起,将密码子替换为大肠杆菌的优势密码子,通过合成引物、PCR拼接的方法,获得目的基因序列;在原核系统中与pET32a 载体中的His·Tag、Trx·Tag及S·Tag进行融合表达;目的蛋白经Ni 金属螯合层析柱纯化后,用于免疫家兔,制备多克隆抗体。结果:PCR拼接获得306bp的目的基因序列;在原核系统中融合表达得到相对分子质量约31000的融合蛋白,占菌体总蛋白的21%。纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗体,Western印迹结果显示,获得的多克隆抗体与HIV-1B'/C亚型的Tat蛋白反应良好;间接免疫荧光结果表明,获得的多克隆抗体与HIV-1B'/C亚型和C亚型的Tat蛋白都能产生特异性反应。结论:制备的多克隆抗体能够使用间接免疫荧光方法检测HIV-1C亚型的Tat蛋白,使用Western印迹方法和间接免疫荧光方法都能检测HIV-1B'/C亚型的Tat蛋白。     

丙型肝炎病毒复合高变区1模拟表位蛋白的免疫原性分析

将丙型肝炎病毒高变区1(HVR1)模拟表位融合基因插入原核表达载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,经亲和层析和凝胶过滤层析获得HCVHVR1模拟表位融合蛋白。用Westernblot和ELISA检测融合蛋白与HCV抗体阳性血清的结合情况。皮下注射免疫BALB/c小鼠,用ELISA检测小鼠血清中的抗HCV抗体水平及其与天然HCV高变区1合成肽的交叉反应。结果表明融合蛋白能与HCV抗体阳性血清特异结合,融合蛋白与HCV抗体阳性血清的结合频率为71.6%(25/35)。融合蛋白免疫小鼠后能有效诱导免疫应答,其诱生的特异性抗体最高滴度达104(免疫后第8周),且该抗体能同2条天然HCVHVR1合成肽发生交叉反应。本研究提示,HCV复合HVR1模拟表位融合蛋白在丙型肝炎疫苗的研发中可能具有潜在应用价值。     

富含半胱氨酸蛋白61多克隆抗体的制备及其在子痫前期胎盘检测中的作用

目的:制备兔抗人富含半胱氨酸蛋白(Cyr61)多克隆抗体,并用该抗体检测Cyr61蛋白在重度子痫前期(PE)和正常妊娠胎盘中的差异表达.方法:用RT-PCR法从Hela细胞中克隆Cyr61全长mRNA,并在大肠杆菌中表达获得重组蛋白,免疫新西兰白兔得到兔抗人Cyr61多克隆抗体.然后用此抗体对14例重度子痫前期胎盘进行检测,并与孕周匹配的14例正常胎盘比较.结果:Cyr61DNA测序结果与参考序列一致;Western blot竞争法证实制备的兔抗Cyr61抗体与商品化的羊抗Cyr61抗体有共同的靶点;用制备的兔抗人Cyr61蛋白抗体Western blot检测发现,在重度PE胎盘中Cyr61蛋白含量较正常胎盘含量降低(14.2±1.0 vs.29.2±1.1 P＜0.05).结论:本研究成功地在大肠杆菌中表达出Cyr61融合蛋白,并制备了特异性高的兔抗人Cyr61抗体.重度PE胎盘中Cyr61蛋白表达水平降低.     

人抗酶抑制因子-1的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

原核表达纯化人抗酶抑制因子-1((antizyme inhibition factor-1,AZIN1),制备并鉴定抗AZIN1多克隆抗体。p ET-28a/AZIN1表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG诱导蛋白表达,利用Ni-NTA树脂于变性条件下亲和层析纯化人AZIN1蛋白。将重组AZIN1蛋白用作抗原免疫BALB/c小鼠以制备多克隆抗体,ELISA检测抗AZIN1抗体效价,Western bloting、细胞免疫荧光、细胞免疫化学方法检测抗体的应用。结果显示,重组p ET-28a/AZIN1表达质粒经酶切及测序鉴定构建正确。细菌内重组AZIN1蛋白可被IPTG诱导表达并以包涵体的形式存在。用亲和层析法能有效纯化原核表达的AZIN1蛋白,该蛋白在小鼠体内能够诱导抗AZIN1特异性抗体产生,血清效价达到1640 000。制备抗体能够特异性识别和结合人及小鼠瘤细胞中表达的AZIN1蛋白,并可有效用于AZIN1的Western blotting、细胞免疫荧光和细胞免疫化学分析。成功原核表达和纯化了人AZIN1蛋白并制备了抗AZIN1多克隆抗体,为深入研究AZIN1在调控细胞增殖及在疾病防治中的作用提供了研究基础。     

棉铃虫组织蛋白酶B多克隆抗体制备及鉴定

介绍了用重组的棉铃虫组织蛋白酶B(HCB)制备兔多克隆抗体的方法。用已经克隆得到的pGEX 4T 1 HCB重组质粒转化的大肠杆菌 (Escherichiacoli)BL2 1菌株进行诱导表达 ,获得融合表达的包涵体产物。经过变性、复性等方法处理包涵体 ,获得可溶性融合蛋白。用凝血酶裂解融合蛋白 ,再经SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化目的蛋白HCB ,用做抗原免疫家兔。产生的抗血清经硫酸铵沉淀 ,最后得到了抗棉铃虫组织蛋白酶B的多克隆抗体。用间接酶联免疫吸附测定法测得该抗体对重组表达的组织蛋白酶B和棉铃虫体内的组织蛋白酶B的效价分别为 1∶5 1 2 0 0和 1∶2 5 60 0。通过免疫印迹检测证明此抗体不仅可以识别重组表达的棉铃虫组织蛋白B ,而且可以识别棉铃虫卵巢匀浆液中的棉铃虫组织蛋白酶B。     

肺炎链球菌假想蛋白SPD0873的表达纯化及保守性分析

目的通过构建原核表达载体,获得纯化的肺炎链球菌S．pn重组假想蛋白SPD0873,并制备多克隆抗体,进一步分析其在常见S．pn菌株中的保守性。方法分离培养D39型肺炎链球菌,获取其基因组DNA。利用PCR方法扩增去除信号肽的spd0873序列,采用基因体外重组法将spd0873序列克隆到原核表达载体pET-32（a）内,测序鉴定。将重组质粒转化到E．coli Rossetta（DE3）中,经IPTG诱导大量表达融合6个组氨酸标签的SPD0873重组蛋白,经Ni—NTA树脂纯化后,获得的重组蛋白用SDS—PAGE和Western印迹鉴定;将鉴定后纯化的蛋白免疫BALB／C小鼠制备多克隆抗体,并用间接ELISA检测多克隆抗体的效价,Western印迹方法分析多克隆抗体的特异性,同时,鉴定该蛋白在5种常见肺炎链球菌分离株的保守性。结果克隆的spd0873序列与GenBank中的数据相符,并实现了SPD0873蛋白高水平的可溶表达。纯化蛋白免疫BALB／C小鼠获得高滴度、高特异性的的多克隆抗体,Western印迹验证SPD0873蛋白在5株常见肺炎链球菌菌株中均有表达。结论成功制备了高滴度、高特异性的SPD0873蛋白多克隆抗体,同时,检测到SPD0873蛋白在5种常见的肺炎链球菌菌株中非常保守,为研究该蛋白的生物学功能及肺炎链球菌多肽联合疫苗的研制奠定了基础。