应用扫描隧道显微镜技术观察针对HBsAg基因转录物的核酶的二级结构

核酶(Ribozyme)是具有催化RNA切割反应功能的RNA,它可以特异性地切割RN-A。最近,核酶的一级结构已经被证实,其与底物结合时所形成的二级结构如锤头状(Hammerhead)、发夹型(Hairpin)结构,亦得到初步证实。因此,能够设计并人工合成核酶,通过特异性破坏RNA,阻断其功能,从而有效地阻止病毒的复制和繁殖。这是近年来继反义RNA之后发现的又一个抑制基因表达的有力工具,开辟了分子生物学的一个新领域。     

稳定的RNA发夹结构及其生物学功能

以UNCG、GNRA、CUUG(N=A、U、C或G,R=G或A)为端环能够形成稳定的、保守的发夹结构。高分辨率的溶液结构、晶体结构和计算机模拟等方法从原子水平上解析了这些发夹特殊的结构特征。在体内,它们发挥着重要的生物学功能:在折叠过程中作为折叠的起始位置帮助组织RNA分子正确折叠;与核酸受体结合参与三级相互作用;与蛋白质发生相互作用;阻止逆转录酶的延伸等等。另外,由于C(UUCG)G发夹极其稳定的特征,在体外RNA分子的实验测定中它还是稳定核酸结构的理想工具。这些稳定的发夹广泛分布于体内rRNA、催化RNA和非编码mRNA中。但在对人类编码区mRNA结构特征的研究当中,却未发现C(UUCG)G发夹。     

LINC00665通过激活WNT-CTNNB1/β-catenin信号通路促进HeLa细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化

越来越多的证据表明,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在癌症进展中起关键作用.但是,人们对lncRNA 00665 (LINC00665)在大多数癌症中的作用了解甚少.本研究旨在揭示LINC00665在宫颈癌细胞中的功能.用小发夹RNA (short hairpin RNA,shR...     

条件性RNA干扰的原理和方法

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是通过抑制转录后水平的基因表达而诱导功能缺失表型的有力工具。由于传统RNAi方法不能对小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)或短发夹状RNA(shorthairpinRNA,shRNA)的表达进行调控,在对细胞生存、细胞周期调控和细胞发育起重要作用的基因进行功能分析时受到一定限制。利用药物诱导系统对启动子进行修饰、利用Cre-LoxP系统对启动子或shRNA进行修饰而构建的条件性RNAi系统中,shRNA可根据研究者的需要在特定的时间和空间表达,克服了传统RNAi方法的局限,显著拓展了RNAi技术在功能基因组学和基因治疗等方面的应用范围。     

条件性RNA干扰技术研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种由与靶基因同源的双链RNA引起的,具有序列特异性的转录后基因沉默技术。目前,RNAi已被广泛应用于基因功能的研究中。为了使基因沉默具有时空特异性,可以通过构建基于Cre重组酶的Cre/lox P系统、可被小分子药物诱导的Tet诱导系统以及两者组合形成的高级诱导RNAi系统来条件性的控制小发夹状RNA(sh RNA)的表达,使其靶基因的表达可受外界调控,在特定组织细胞中或者特定的生长发育时期被抑制,从而更好地进行基因功能研究。目前,条件性RNAi基因沉默策略具有多样化,精确性和组合式的特点。本文就条件性RNAi基因沉默技术的多元策略做一综述。     

微小RNA研究进展

MicroRNAs(miRNAs)是一类长度为21-23核苷酸(nt)、进化上比较保守的非编码蛋白质的单链小RNA分子,它们一般通过Dicer酶从具有发夹二级结构的前体RNA加工而来。在真核生物的发育、基因表达等一系列过程中发挥了重要作用。     

人耐药白血病细胞多药耐药基因-1小干扰RNA的构建及功能研究

目的:构建人耐药白血病细胞多药耐药基因-1小干扰RNA并研究其功能.方法:人工合成编码mdrl小发夹状双链RNA的DNA片段,与pSilencer4.1-CMV质粒连接构建RNAi真核表达栽体,采用脂质体介导法转染人耐药白血病细胞K562/A,经潮霉素B筛选转基因阳性克隆细胞,RT-PCR和Western Blotting检测转基因细胞中mdrl基因的表达量,MTT法检测转基因细胞对阿霉素的敏感性.结果:RT-PCR结果显示,与未转基因组和阴性对照组比较,RNA干扰组mdrl基因在mRNA水平上表达量降低43.55%;Western Blotting检测显示,RNA干扰组mdrl基因在蛋白水平上表达量降低69.46%;MTT法检测显示mdrl干扰细胞对化疗药物柔红霉素的敏感性提高23倍.结论:mdrl小发夹状RNA可显著抑制K562/A细胞中的mdrl基因的表达,提高白血病细胞对化疗药物的敏感性,对白血病多药耐药性的逆转和白血病的治疗具有重要理论和实际意义.     

miRNA 的生物合成过程

MicroRNA (miRNA) 是一类真核生物内源性的小分子单链 RNA ,通常为 18 ～ 25 nt 长,能够通过与靶 mRNA 特异性的碱基配对引起靶 mRNA 的降解或者抑制其翻译,从而对基因进行转录后的表达调控 . 近几年来,在动物细胞和植物组织中,上百种 miRNA 被陆续发现 . 这些小分子调控 RNA 是从 60 ～ 200 nt 的具有发夹状结构的前体中被切割出来而成熟的,在动物细胞中, miRNA 基因的转录初产物 (pri-miRMA) 很快被一种核糖核酸酶Ⅲ Drosha 加工成为 miRNA 前体 (pre-miRNA) ,然后由细胞核转运至细胞质中,经另一种核糖核酸酶Ⅲ Dicer 识别剪切为成熟 miRNA. 对这一过程进行了简要的综述,并且对植物 miRNA 的成熟过程也进行了探讨 . 对 miRNA 的生物合成过程的深入了解,将有助于研究这一类起重要调控作用的 RNA 是如何行使功能的,从而进一步研究其在生长发育及各种疾病中所起的重要作用 .     

活细胞RNA动态成像技术进展

RNA是生命“中心法则”的主要成员,广泛参与细胞内各种生命活动. RNA在活细胞内的区室定位和动态过程与RNA功能息息相关.因此,需要开发活细胞内RNA成像技术,追踪RNA时空动态过程,原位阐明RNA活性和功能,进一步解析RNA相关生命过程和疾病的关系.本文系统阐述两大活细胞RNA成像体系:(i)RNA发夹:荧光蛋白体系;(ii)荧光响应RNA适配体:小分子探针体系.并介绍其他可用于动态示踪RNA的技术,概述不同技术在追踪活细胞RNA方面的特点和问题,讨论RNA动态成像技术未来的发展方向.     

发夹状核酶研究进展

发夹状核酶是一种具有催化功能的RNA,能够特异识别并切割底物,它的切割效率较高,对金属离子和pH值变动的依赖较小。在抗病毒和抗疾病相关基因表达的基因治疗领域有很高应用前景,本文对它的结构,反应动力学,催化机理和应用方面的研究进展作一综述。     

刺激猫中缝核对海马内脏伤害性单位放电的影响

实验在氯醛糖和氨基甲酸乙酯麻醉猫上进行,用箭毒制动。以玻璃微电极记录背海马CA1区神经元放电。观察刺激中缝核(NR)对伤害性刺激内脏大神经引起的海马单位放电的影响。在记录的104个单位中,对伤害性刺激发生显著反应的82个。其中伤害性兴奋单位(NEU)38个;伤害性抑制单位(NIU)44个。伤害性无关单位(NUU)22个。刺激NR后,检测了63个单位,其中NEU的自发放电和伤害性放电出现抑制效应的,分别占单位数的40％和60％。26个NIU出现抑制加强的占60％;出现脱抑制的占25％。12个NUU,有的转变为NEU,有的转变为NIU,有的则维持原状。结果表明,海马CA1区存在内脏伤害性相关单位,该神经元分为NEU和NIU两类,刺激NR对它们中的多数均起抑制作用,并对其机制进行了讨论。     

桑花叶萎缩类病毒基因组结构特征及聚类分析

桑花叶萎缩类病毒(Mulberry mosaic dwarf viroid, MMDVd)是近些年发现的桑花叶型萎缩病的病原物,本研究利用Mfold等软件和保守序列分析了MMDVd的二级结构及其中存在的核酶,并进一步对类病毒和卫星RNA进行了聚类分析,以期解决其分类和进化地位。结果表明MMDVd的正链存在典型的锤头型核酶结构,自切割位点为AUC,负链存在有疑似发夹型核酶的二级结构,是目前发现的第四个发夹核酶。聚类分析研究中,Pospiviroidae科类病毒单独形成一分支,Avsunviroidae科PLMVd和CChMVd首先与v LTSV聚合,而本研究MMDVd首先与卫星RNA s TRSV、s ArMV聚合,结合MMDVd正负链不同于已知Avsunviroidae科的两个锤头型核酶的结构,表明MMDVd应为一个新的未分类属,对于其核酶的自切割活性及其复制机制,则需要进一步的实验研究来验证。     

沉默MDR1基因增强SGC7901/ADM细胞对姜黄素的敏感性

本研究利用短发夹RNA(sh RNA)沉默SGC7901/ADM细胞MDR1基因表达,增强人胃癌SGC7901/ADM细胞对姜黄素的敏感性。根据MDR1基因序列设计3对编码sh RNA的DNA模板,克隆到p Silencer 3.1-H1 neo(p3.1)上构建3种sh RNA表达载体,转染SGC7901/ADM细胞,q RT-PCR和Western blotting检测MDR1基因沉默效果,用荧光显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞活力。结果显示,3种sh RNA表达载体转染细胞后均能不同程度沉默MDR1基因的表达,增强了细胞对姜黄素的敏感性。     

催产素受体基因沉默的大鼠子宫平滑肌原代细胞模型的构建及鉴定

目的建立催产素受体(oxytocin receptor,OXTR)基因沉默的细胞模型,为催产素受体相关的研究提供技术基础。方法设计3个阳性RNA干扰(RNA interference, RNAi)序列(Oxtr-RNAi-1、Oxtr-RNAi-2、Oxtr-RNAi-3)及一个阴性序列(con-RNAi),合成短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)干扰片段用于实验。以慢病毒为载体,构建绿色荧光蛋白(green-fluorescent protein,GFP)标记的Oxtr干扰体系。将Oxtr-RNAi慢病毒感染原代大鼠子宫平滑肌细胞,通过观察GFP荧光表达比较各组的转染效率,并用Western blot和荧光定量PCR分别检测OXTR蛋白和m RNA表达水平,来比较各组的干扰效率。结果慢病毒感染5d后,感染Oxtr-RNAi-1病毒的细胞GFP荧光表达细胞比例最高,OXTR蛋白和m RNA水平最低。结论成功构建了沉默Oxtr的子宫平滑肌细胞,为进一步研究催产素受体相关的分子机制奠定实验基础。     

生物的核酶及其功能

核酶是有催化功能的RNA,目前发现的核酶可分为两大类（大分子核酶,小分子核酶）,共7种（大分子核酶包括第一类内元,RNase的RNA组分;小分子核酶包括锤头型,发夹型,肝炎δ病毒核酶,VS核酶）。本文概括了这些核酶的功能及其在理论和实际（主要是医学）方面的应用情况。     

靶向端粒酶逆转录酶（hTERT）RNAi载体的构建及活性评价

RNA干涉是由与特定基因同源互补的双链RNA,在体内以序列特异的方式引发靶基因的mRNA降解,从而导致转录后基因沉默的过程.为研究内源性的siRNA对靶基因的抑制效果,用pPUR/U6载体构建用于细胞内转录靶向hTERT基因的短发夹状siRNA表达质粒,并评价其对hTERT基因的抑制效果.将hTERT cDNA 3 565～3 583一段19 bp的DNA序列及其反向重复序列,用9 bp的连接序列连接后再接上5个T碱基,将此段DNA序列克隆至pPUR/U6载体U6启动子的下游,形成能在体内合成hTERT特异性短发夹状RNA的重组质粒载体pPUR/U6/hTERT.将pPUR/U6/hTERT与对照质粒pPUR/U6分别转染HepG2细胞.采用嘌呤霉素筛选和富集转染具有抗性的细胞.收集存活的细胞接种12孔板、提取RNA和蛋白质.以细胞计数法测定细胞的生长速度,RT-PCR和蛋白质印迹分析hTERT基因的表达,端粒重复放大测定法检测端粒酶活性,蛋白质印迹检测p53蛋白水平.与转染对照质粒pPUR/U6的细胞相比,转染pPUR/U6/hTERT的细胞其hTERT基因表达水平显著下降,端粒酶活性降低,细胞生长速度变慢,p53蛋白表达明显升高.以上结果表明,以DNA质粒为载体产生的内源性短发夹状siRNA能高效抑制hTERT基因的表达,有望成为基因功能研究的有力工具.     

不同细胞系中RNA干扰抑制血管内皮生长因子表达

目的通过RNA干扰技术抑制血管内皮生长因子(VEGF)表达,并观察在不同细胞系中,RNA干扰作用强度的变化。方法将VEGF基因作为RNA干扰的靶区,通过E-RNAi网上提供的服务,设计两个特异的RNA干扰序列,将其装入含U6启动子的载体上,构建成抗VEGF基因的小发夹样RNA(shRNA)表达载体,再转染人胚肾细胞HEK293、结肠癌细胞HT29、宫颈癌细胞Hela和肝癌细胞HepG2,通过RT-PCR观察VEGF表达受抑的程度及在不同细胞系中RNA干扰作用强度的变化。结果成功构建了两种抗VEGF基因的shRNA表达载体,发现其在HEK293和HT29细胞系中,能明显抑制VEGF基因的表达,抑制率分别为72%和42%;但在Hela细胞中,抑制作用明显减低至28%;在HepG2细胞中抑制作用更弱,仅为13%。结论针对VEGF基因的shRNA表达载体能够明显抑制VEGF基因的表达,但在不同细胞系中的作用强度有明显差别,提示RNA干扰作用存在明显的细胞系选择性。     

在我国患急性腹泻成人中发现一种新轮状病毒

从3例急性成人腹泻患者粪便中,经电镜观察,成人腹泻轮状病毒—酶联免疫吸附试验(ADRV-ELISA)、普通轮状病毒—酶联免疫吸附试验(Rota-ELISA),猪抗C型(组)轮状病毒和鸡抗D型(组)轮状病毒血清分别与本病毒的免疫电镜试验以及RNA电泳等实验结果,发现了一种新轮状病毒,该病毒的形态结构与普通轮状病毒(Rotavirus)、成人腹泻论状病毒(Adult Diarrhoea Rotavirus,简称ADRV)极为相似,但抗原性与普通轮状病毒(A组),成人腹泻轮状病毒(B组),C型轮状病毒(C组),D型轮状病毒(D组)显然无关。基因分析表明,该病毒基因组由11个双链RNA片段组成,但其RNA电泳图型具有独自的特点,与目前公认的A组、B组、C组、D组论状病毒韵RNA电泳图型均不同,免疫电镜证实,该病毒能被人恢复期血清所凝集,表明该病毒可能是腹泻病人的病因。     

Clin Cancer Res:新生物标志物可鉴别出高转移风险的葡萄膜黑色素瘤

正在一项新的研究中,美国迈阿密大学米勒医学院西尔维斯特综合癌症中心眼癌部位小组负责人J.William Harbour博士和同事们发现一种生物标志物能够鉴定出葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma)有更高风险发生转移的病人。在归类为1级的葡萄膜黑色素瘤中,含有高水平的被称作PRAME m RNA的生物标志物的病人要比含有低水平PRAME m RNA的那些病人更可能发生     

果蝇也能产生一种系统性RNAi反应

果蝇和其他昆虫已知能够发起涉及RNA干涉（RNAi）的局部抗病毒防卫。以前人们认为,果蝇不能系统性地展开RNAi反应,依据是所表达的内生RNA发夹不会从一个细胞向另一个细胞展开。