ATP6蛋白影响异沙叶蝉对小麦蓝矮植 原体的传播效率

【目的】探索异沙叶蝉Psammotettix alienus ATP6蛋白对小麦蓝矮植原体(wheat blue dwarf phytoplasma, WBDp)传播效率的影响。【方法】将异沙叶蝉mRNA反转录合成cDNA,构建分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库;用WBDp的虫传相关蛋白P2-4为诱饵,从异沙叶蝉cDNA文库杂交筛选互作蛋白;通过RNAi沉默ATP6基因,验证ATP6蛋白对异沙叶蝉3龄若虫传播WBDp的影响。【结果】构建了异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库,用P2-4从cDNA文库中杂交筛选获得了ATP6等多种互作蛋白。RNAi结果发现沉默ATP6基因后异沙叶蝉3龄若虫的WBDp传播率比对照组显著下降了23.33%±3.33%,表明ATP6是异沙叶蝉参与WBDp传播的关键蛋白。【结论】明确了异沙叶蝉ATP6是参与WBDp传播的一个关键蛋白。为进一步探明异沙叶蝉传播WBDp的分子机制和植原体病害的田间防治提供了理论基础。     

小麦蓝矮病植原体胸苷酸激酶基因(tmk)的分离、原核表达及酶活性分析

[目的]克隆、表达小麦蓝矮病(WBD)植原体胸苷酸激酶基因(tmk),并分析酶活性,进一步研究胸苷酸激酶在植原体感染宿主及繁殖过程中的功能和作用机理,更好地防治植原体病害.[方法]PCR方法扩增tmk基因并进行序列分析,连接pET30a( )表达载体后原核表达,经Ni-NTA柱层析纯化后进行酶催化活性分析.[结果]首次从小麦蓝矮病(WBD)植原体基因组中分离出胸苷酸激酶基因(tmk),该基因包含tmk-1和tmk-2两种,大小分别为630 bp和624 bp,其编码的氨基酸序列均包含3个与结合NTP/NMP相关的保守功能区.表达的融合蛋白TMK-1活性极低,酶活仅16.4 U/mg,而 TMK-2酶活高达112.41 U/mg,且其最适催化条件为32℃、pH 7.3、1.5 mmol/L Mg2 和 1 mmol/L ATP.[结论]分析了胸苷酸激酶活性中心的一级结构序列及其催化活性随条件变化而改变的性质,为深入研究小麦蓝矮病植原体胸苷酸激酶在侵染寄主及其在宿主体内增殖的转录性质奠定基础.     

类菌原体引起的小麦蓝矮病

据对介体条沙叶蝉进行接种传毒试验发病的小麦病株和传毒的条沙叶蝉进行超薄切片电镜观察,在病株韧皮部筛管细胞和介体唾液腺中均可见类菌原体病原物(MLO),其直径为60- 700nm,单位膜厚度为8-10nm,形态多样．主要为球形、椭圆形、哑铃形等。四环素对麦苗接种发病具有明显的抑制作用．说明小麦蓝矮病是由介体条沙叶蝉传播的类菌原体病原物引起的。这是对小麦类菌原体蓝矮病首次进行的较系统的研究。     

植原体DNA提取方法的改良

在总结多种植原体DNA提取方法的基础上 ,发展了一种提取植原体DNA新方法。用此方法提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测到大于 15kb的DNA主带 ,基本无DNA碎带 ,不用RNase处理 ,也无RNA干扰 ,OD2 60 / 2 80 值显示产物纯度较高 ,无需任何处理 ,即可以作为模板扩增     

水稻染色体DNA的交变脉冲电泳分析

从水稻完整的细胞核中释放出来的染色体DNA在交变脉冲电泳申表现为一种“240kb单位”的形式。这种单位,经限制性内切酶消化,可产生连续分布的大至1500kb的染色体DNA片段。文章讨论了“240kb单位”作为水稻染色体DNA基本结构单位的可能性。     

携带黄矮病抗性基因染色体DNA文库的构建

单条染色体的分离及其ＤＮＡ片段的克隆是将细胞学与现代分子生物学相结合的一项新技术。它对染色体结构和基因进化的研究、基因组物理图谱及分子标记连锁图构建等 ,特别是增加染色体某些区域的探针密度具有重要意义。２０世纪９０年代以来 ,有关植物染色体微分离及体外扩增的报道中 ,只有少数几篇是关于单条染色体的体外扩增及其克隆 ,其采用的为微细玻璃针法。在前人工作的基础上 ,我们探索了一套操作方便、容易掌握的激光微分离、微克隆技术体系。本文以中间偃麦草二体异附加系Ｚ２与普通小麦宛７１０７杂交（Ｚ２×宛７１０７）的Ｆ１ …     

用做标记的两种酵母菌完整染色体DNA的简化制备法

已知分子量在小的染色体ＤＮＡ分子标记是脉冲电泳研究中用以估算样本染色ＤＮＡ分子大小必不可和的参照物。对用做标记的啤酒酵母和粟酒裂殖酵母完整染色体ＤＮＡ几种制备方法的比较研究以及改进研究表明,液氮冷冻研磨法,凝胶包埋法以及凝胶包埋破壁法效果均很好,都得到大量染色体ＤＮＡ,且彼此此间无明显差异。     

南方鲇肝脏线粒体DNA的简便分离纯化方法

摸索出可消除南方鲇肝脏ｍｔＤＮＡ制备中出现的白色干扰物的方法,采用该方法处理后的ｍｔＤＮＡ可用于限制性分析。     

λDNA导入引起小麦染色体变异的研究

小麦种子从萌动至２叶期,用λＤＮＡ进行浸滴处理,Ｄ１代出现花粉母细胞染色体变异的植株占观察株的７３．３％,染色体变异的细胞占观察细胞数的２８．３％。主要有染色体落后、单价体、染色体桥、多价体、染色体多极分离,染色体螺旋化不同步,异常二分体和卤分体及微核等类型,随世代增进,染色体行为趋于稳定,但不同个体间存在的较大差异。这种复杂的染色体变异可能是外源ＤＮＡ在受体整合过程中的细胞学反应。     

植原体遗传多样性研究现状与展望

植原体是引起众多植物病害的一类重要的无细胞壁的原核致病菌, 其寄主种类多、危害面积广, 对经济、环境等影响严重。大量研究表明植原体存在丰富的遗传多样性。本文就植原体遗传多样性研究现状作一概要评述, 并对植原体遗传变异的研究技术、产生机制、与致病性关系等今后可能的研究方向作一展望。对已完成的5个植原体全基因组序列分析发现, 它们在大小、结构和功能等方面皆存在显著差异, 缺少很多标准代谢所需的基因。不同植原体中质粒的数量、大小和功能等也存在一定差异。植原体含有2个核糖体RNA编码基因, 其序列在不同株系中的变异奠定了现今植原体分类鉴定的基础。对植原体蛋白编码基因如核糖体蛋白编码基因(rp)、蛋白延伸因子基因(tuf、fusA)、转运蛋白基因(secY、secA)、效应子及非编码区序列如启动子、假基因等的深入研究可进一步揭示植原体更丰富的遗传变异特征。由于植原体分离培养困难, 人们对其形态特征、生理代谢等了解甚少, 因而全基因组测序、多位点序列分析等现代分子生物学技术将会成为植原体遗传变异研究的主要手段。植原体遗传多样性研究进展有助于从分子水平上系统地阐明植原体遗传变异规律、系统进化特征及其与寄主(植物和昆虫)、生态环境间的互作和适应关系, 并产生新的认识。这对于提高植原体的分类鉴定、致病机制、流行预测及病害防治等研究水平具有重要的作用和意义。     

太湖新银鱼线粒体DNA的制备

建立了适合太湖新银鱼等小型鱼类ｍｔＤＮＡ分离纯化的有效方法。改进匀浆条件,采用ＤＮａｓｅＩ和ＲＮａｓｅ纯化方法,可用常规方法由小量太湖新银鱼中制备出ｍｔＤＮＡ。采用改进的碱裂解法,能够在２小时内由单尾太湖新银鱼中快速分离纯化出适于限制性分析用的ｍｔＤＮＡ。     

从水稻细胞核中制备分子量达到Mb级的DNA

用水稻黄化苗作实验材料,经蔗糖不连续梯度纯化细胞核、琼脂糖包埋、蛋白酶消化释放DNA,脉冲交变电泳显示所得DNA样品分子量在200kb至3Mb之间,其中大量集中在2.2Mb处.所得DNA容易被多种内切酶消化和连接,可用于构建水稻YAC文库和大尺度物理图的研究.     

Isolation of high-molecular-weight plant DNA for DNA damage quantitation: relative effects of solar 297 nm UVB and 365 nm radiation

Quantitation of UV-induced DNA damages in nanogram quantities of non-radiactive DNA from irradiated plants by gel electrophoresis requires a prompt, efficient, high-yield method of isolating DNA yielding high-molecular-weight, enzymatically digestible DNA. To meet these criteria we devised a high-yield method for isolating from plant tissue, DNA whose single-strand molecular length is greater than about 170 kb. Leaf tissue is embedded in agarose plugs, digested with Proteinase K in the presence of detergent, and treated with phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF). The agarose plugs are then soaked with buffer appropriate to the desired enzyme treatment. Evaluation of the DNA on neutral and alkaline gels indicates its high molecular length and low frequency of single-strand breaks. The DNA can be digested with damage-specific and other endonucleases. The method is especially suitable for DNA damage quantitation, as tissue processing is carried out immediately after harvesting (allowing DNA lesion measurement at precisely known times after irradiation), and many samples can be easily handled at once. It should also be useful for molecular analysis of large numbers of plant samples available only in small quantities. We here use this method to quantitate DNA damage induced by 297 and 365 nm radiation, and calculate the relative damaging effects of these wavebands in today's solar spectrum.     

Purification and cloning of DNA fragments fractionated on agarose gels

Purification of DNA fragments from acrylamide or agarose gels is a commonly used technique in the molecular biology laboratory. This article describes a rapid, efficient, and inexpensive method of purifying DNA fractions from an agarose gel. The purified DNA is suitable for use in a wide range of applications including ligation using DNA ligase. The procedure uses standard high-melting-temperature agarose and normal TBE electrophoresis buffer. In addition, the protocol does not involve the use of highly toxic organic solvents such as phenol.     

用质粒作底物测定核糖体失活蛋白酶活性的新方法

植物核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP)是一类能作用于核糖体最大RNA的独特蛋白质.它是研究蛋白质生物合成中核糖体RNA结构与功能的有力工具.利用RIP能在DNA中脱去一些腺嘌呤碱基使超螺旋DNA解旋的特点,分别以常用的质粒PUC18、PUC19和PBR322 DNA为底物,建立了测定RIP酶活性的一种新方法,其灵敏度是50ng(天花粉蛋白)和5ng(还原型的辛纳毒蛋白),酶催化反应的时间是60min.这个新方法具有方便、快捷、灵敏的特点,避免了常用方法中制备核糖体、提取RNA的仪器和技术条件的限制,检测的时间由原来的几天缩短到约120min,大大地降低了检测的费用,为广泛和深入地研究RIP提供了有利的条件.     

纳米磁性粒子在DNA分离与纯化中的应用进展

纳米磁性粒子是一种新型的亲和纯析固相载体 ,其粒径小 ,具有超顺磁性 ,表面积大 ,表面可赋予多种反应基团如链霉亲和素、抗体等 ,或DNA片段 ,在磁场作用下可分离目的DNA ,已逐步应用于分子生物学领域中 ,有着极为广泛的应用前景。     

The isolation of high molecular weight DNA from wheat,barley and rye for analysis by pulse-field gel electrophoresis

A method is presented for the preparation of large DNA molecules from protoplasts embedded in agarose blocks of three different cereals-hexaploid bread wheat (Triticum aestivum), barley (Hordeum vulgare) and rye (Secale cereale). Pulse-field gel electrophoresis (PFGE) analysis of these DNA preparations using a contour-clamped homogeneous field (CHEF) apparatus indicated that the size of the DNA molecules was greater than 6 Mb. DNA samples prepared by this method were shown to be useful for restriction analysis using both frequent and rare cutting enzymes.