全反式维甲酸体外诱导P19细胞向心肌方向分化

目的探讨不同浓度全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,atRA)诱导P19细胞向心肌分化的效力。方法细胞分成P19细胞组,2nm/L atRA诱导组,5nm/L atRA诱导组,8nm/L atRA诱导组。各组细胞经过诱导、聚集培养、聚集体贴壁培养10天后,RT-PCR检测GATA-4,α-肌球蛋白重链(α-myosin heavychain,α-MHC)的mRNA表达,免疫荧光双标检测α-sarcomeric actin和cTnT蛋白共表达,Western blot检测cTnT的蛋白表达。结果 atRA可诱导聚集P19细胞表达GA-TA-4、a-MHC mRNA;α-sarcomeric actin和cTnT的表达和共表达增加;5nm/L atRA组,8nm/L atRA组GATA-4、a-MHCmRNA的表达量显著高于P19细胞组;5nm/L atRA组,8nm/L atRA组两种蛋白的表达和共表达量显著高于P19细胞组,以5nm/L atRA组最高,显著高于其它组。结论 atRA可诱导聚集P19细胞向心肌分化,其中5nm/L atRA组效果最好。     

二甲基亚砜对P19细胞体外分化为心肌细胞的影响

体外应用不同浓度二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)诱导P19细胞向心肌细胞分化,通过免疫细胞化学、流式细胞、RT-PCR方法检测α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin,α-SA)、心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)及GATA-4、α-肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain,α-MHC)mRNA表达。结果显示,DMSO处理结合悬浮培养可诱导部分P19细胞分化为节律跳动的心肌细胞,分化的细胞α-SA、cTnT表达阳性,同时表达心肌特异GATA-4、α-MHCmRNA。1.0%DMSO组α-SA、cTnT阳性细胞免疫荧光强度及GATA-4、α-MHCmRNA表达水平明显高于0.5%及0.8%DMSO组。表明DMSO的诱导作用与其浓度有关。     

碱性成纤维细胞生长因子体外诱导P19细胞分化为心肌样细胞

应用碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2）体外诱导P19细胞向心肌细胞分化,摸索适宜P19细胞向心肌细胞分化条件。将P19细胞接种于铺有0．5％软琼脂的培养皿中,用含FGF-2的分化培养基培养P19细胞,24h后即可见多个悬浮的细胞团形成,大部分形状较规则,直径随时间延长不断增大,至第4天形成细胞聚集体／EBs,形状规则、体积较大,少量EB呈囊性,隐约可见内细胞团样结构。     

过量表达Wnt-1基因诱导P19细胞的神经分化

Ｗｎｔ－１基因在小鼠神经发育过程中起着重要的作用。该基因在胚胎性癌细胞Ｐ１９细胞经分化过程中存在瞬时性表达。利用克隆到的Ｗｎｔ－１基因转染Ｐ１９细胞,可使细胞不经视黄酸诱导,自发向神经细胞方向分化。     

Nulp1基因抑制P19CL6细胞向心肌细胞分化

Nulp1基因是已克隆的一个新的bHLH转录因子亚家族成员.前期的研究表明：Nulp1蛋白作为一个转录抑制子对SRF信号途径有极强的抑制作用.为了进一步研究Nulp1基因在心肌分化中的作用,在能够高效分化为心肌细胞的P19CL6细胞系中过表达Nulp1基因,发现心肌分化标志基因的表达被抑制;用RNA干扰技术,使Nulp1基因在P19CL6细胞系中的内源表达降低,发现心肌分化标志基因的表达提高,说明Nulp1基因能够抑制P19CL6细胞系向心肌细胞的分化.     

hhlim对心肌肥大的影响及其作用机制探讨

hhlim是从胎儿心脏中新近分离和克隆得到的与心脏发生相关的基因,其表达产物作为转录因子参与多种基因的转录调控和细胞的发育与分化过程.用细胞转染方法将外源性hhlim基因导入原代心肌细胞,发现该基因强制性表达可使心肌细胞体积明显增大.RT-PCR和蛋白质印迹结果表明,hhlim促心肌细胞肥大与诱导α-肌动蛋白(α-actin)过表达及重新启动胚胎期表达基因脑钠肽（BNP）表达有关.用可表达hhlim反义RNA的真核表达载体转染心肌细胞后,致心肌细胞肥大因子ET-1对BNP和α-actin表达的诱导受到显著抑制.这些结果表明,ET-1促进BNP和α-actin表达及引发心肌肥大的效应可能由hhlim所介导,提示hhlim表达与心肌细胞肥大的启动有关.单独或共转染转录因子hhlim、Nkx2.5、GATA-4表达质粒和BNP转录调控区指导的报告基因结果显示,hhlim强制性表达不仅能直接激活BNP基因表达,而且与NKx2.5具有协同作用.结果表明,hhlim可以通过直接或与Nkx2.5协同作用激活BNP基因的表达.     

抑制NHE1活性对干细胞向心肌分化的影响

Na /H 交换蛋白1(NHE1)在心肌细胞发育过程中发挥重要的调节功能.为深入探索NHEl活性对干细胞向心肌分化过程中产生的影响,采用二甲基亚砜(DMSO)诱导P19干细胞向心肌细胞分化,同时在培养液中添加NHE1抑制荆EMD87580,对诱导后形成的类胚体进行检测.通过细胞形态观察、免疫组织化学染色及检测心肌特异表达基因等方法证明,经诱导形成的类胚体贴壁生长后,会向心肌细胞分化并出现跳动细胞团.而经过抑制剂处理的P19干细胞尽管能够形成类胚体且贴壁培养后细胞仍具有增殖活力,细胞团周边也较整齐,但未出现向心肌细胞分化的现象.这一结果表明,抑制NHE1的活性,能够影响P19干细胞向心肌细胞的分化作用.     

hhlim基因表达产物的亚细胞定位及其在细胞肥大中的意义

hhlim是从胎儿心脏中新近分离和克隆得到的与心脏发生相关的基因,其表达产物作为转录因子参与多种基因的转录调控和细胞的发育与分化过程.用细胞转染方法将外源性hhlim基因导入处于分化过程中的小鼠成肌细胞C2C12,发现该基因强制性表达可使C2C12细胞体积明显增大.RT-PCR和蛋白质印迹结果表明,hhlim促细胞肥大与诱导α-肌动蛋白(α-actin)过表达及重新启动胚胎基因BNP表达有关.用绿色荧光蛋白-hhlim融合蛋白表达载体转染处于分化过程的C2C12细胞,发现转染不同时间,表达产物的亚细胞定位发生动态变化,表现为先在胞核和胞质中均有分布,而后定位于胞质的变化规律.应用免疫共沉淀证实,hhlim在胞质中以与α-actin 相互缔合的方式存在.     

神经钙粘着蛋白在P19神经元分化中的作用

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术,我们检测Ｐ１９细胞体外神经元分化过程中神经钙粘着蛋白（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）的表达模式。结果显示,该基因在上述过程中存在上调和下调过程,与体内中枢神经系统发育过程的表达模式十分相近。在此基础上,我们将神经钙粘着蛋白基因ｃＤＮＡ全长转入Ｐ１９细胞,通过药物筛选,得到稳定表达钙粘着蛋白的细胞株。     

稳定转染MiR-499对P19CL6细胞向心肌细胞分化的影响

小鼠miR-499基因包含在心肌重链肌球蛋白Myh7b基因的第19内含子中,并且在心肌细胞中特异表达,然而其在心肌细胞中表达的生物学功能和意义尚不清楚.利用可体外分化为心肌细胞的P19CL6细胞建立稳定表达miR-499的细胞株对研究miR-499的生物学功能具有重要意义.根据小鼠miR-499基因序列,设计PCR引物...     

hhlim基因转录调控区域鉴定及表达调控的初步研究

为了研究hhlim基因表达调控机制,对该基因5′上游－2 537 bp序列从5′端依次进行缺失后,利用荧光素酶报告基因检测各种不同长度片段在C2C12细胞中驱动荧光素酶表达的活性.结果表明,在hhlim基因5′上游－2 537～－1 537 bp之间存在负调控元件,在－253～－157 bp之间含有增强子样序列.用含有增强子样序列的DNA片段做探针,对未分化型和分化型C2C12细胞的核蛋白进行电泳迁移率改变分析(electrophoretic mopility shift assay, EMSA).分析的结果显示,两种表型细胞中的核蛋白与探针结合所形成滞后带的谱型明显不同.结果还发现内皮素-1(ET-1)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)既能显著诱导C2C12细胞对hhlim的表达,也能刺激含增强子样序列的调控区域所驱动的报告基因表达.提示hhlim基因转录起始点至－2 537 bp的区域内含有负调控元件及增强子样序列,该基因的表达受ET-1和bFGF的调节.     

细胞肥大过程中hhLIM的亚细胞定位变化及其对细胞骨架的影响

hhlim (humanheartlim)是从人胎心cDNA文库中筛选克隆的一个新基因 ,作为LIM家族的新成员参与心肌肥大的发生发展过程 .为了进一步研究hhLIM在心肌肥大发生过程中的作用 ,以C2C12细胞为研究对象 ,以心肌肥大强效刺激因子内皮素 1(ET 1)为诱导因素 ,探讨hhLIM与肌动蛋白的相互作用及其影响细胞骨架的分子机制 .RT PCR、Western印迹和细胞免疫荧光分析结果表明 ,心肌肥大刺激因子ET 1在诱导心肌肥大标志基因BNP和肌动蛋白表达的同时 ,使hhLIM蛋白在C2C12细胞胞核与胞质之间进行重新定位 .激光共聚焦显微镜观察结果显示 ,hhLIM与肌动蛋白在胞质中共定位 .蛋白分步提取、鉴定及hhLIM与F肌动蛋白结合与沉降实验证明 ,hhLIM多存在于细胞骨架及其相关蛋白部分 ,在体外可与F肌动蛋白共结合 .这些结果表明 ,胞质中的hhLIM作为细胞骨架相关蛋白与肌动蛋白相互作用 .进一步研究hhLIM与细胞骨架的关系时发现 ,hhLIM过表达可使C2C12细胞的骨架变成致密网状纤维并使其对细胞松弛素导致的细胞骨架解聚产生一定的抵抗作用 ,抑制hhLIM表达则使细胞骨架稀疏 ,结构模糊 .提示hhLIM参与细胞骨架组织及重构的机制与其结合并稳定F肌动蛋白有关 .     

胚胎干细胞分化为血管内皮细胞的分子调控机制

胚胎干细胞在不同的诱导条件下具有多向分化的潜能,多种胞内外信号途径参与其分化过程的调控。现就胚胎干细胞向血管内皮细胞分化的诱导条件及分子机制做一综述,并阐明不同阶段的内皮前体细胞所表达的不同分子标志,同时提出胚胎干细胞在再生医学中的应用前景。     

对小鼠ES细胞进行特异性的标记

虽然ES细胞技术的应用十分广泛,对ES细胞多能性本质的研究还不是很深入,体外培养的ES细胞群体的不均一性加大了这方面研究的难度,报道了对ES细胞中特异表达的基因,将报告基因βgeo插入oct-基因转录元件中构建了标记载体pG18NG,转染ES细胞MESPU22和MESPU13后获得了稳定整合的细胞克隆,经体外培养、诱导分化、嵌入体制作等实验,证明利用该载体对ES细胞中的未分化细胞成功进行了标记,该标记在体内、体外都是有效的。     

胚胎干细胞定向分化为心肌细胞研究进展

胚胎干细胞在体外可分化为 3个胚层的所有组织细胞。诱导人类胚胎干细胞定向分化为心肌细胞可为心肌梗死、心肌坏死等重大心脏疾病患者实施细胞治疗 ,也可作为种子细胞 ,用于构建供器官移植用的人造心脏 ;进一步可研究心肌细胞发育分化的分子机理及更直观的用于体外筛选人类心血管药物等。对人类胚胎干细胞及其定向分化为心肌细胞分子机理的研究进展及其所面临的问题作一综述。     

脂肪间充质干细胞体外分化成心肌样细胞

探讨大鼠脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells,AMSC）体外分化成心肌样细胞的潜能,为自体干细胞移植治疗心肌梗死提供理论基础.采用消化法分离大鼠AMSC,培养于RPMI1640生长培养基中,倒置相差显微镜观察细胞形态发现,随着培养时间的延长,细胞形态趋向于心肌细胞,SQ RT-PCR检测表达心肌特异性基因：β-肌球蛋白重链（β-MHC）、α-肌球蛋白重链（α-MHC）、心房利钠肽（ANP）、心肌肌钙蛋白（cTnT）、心肌肌动蛋白、肌肉增强因子和GATA-4;免疫细胞化学和免疫荧光染色检测表达心肌细胞特异性蛋白：结蛋白、横纹肌辅肌动蛋白、心肌肌动蛋白和间隙连接蛋白45(connexin 45);Western印迹检测表达心肌特异性蛋白Nkx2.5. 实验表明,大鼠AMSC在体外培养条件下能分化成心肌样细胞,在组织工程学及干细胞移植领域有着良好的应用前景.     

A Systems-level Characterization of the Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Mesenchymal Stem Cells,

1. Download : Download high-res image (149KB)
2. Download : Download full-size image

Highlights

• •Integrative multi-omics study characterizing the differentiation from hESCs into hMSCs.
• •Set of high confidence genes important in hESC to hMSC differentiation defined.
• •Two distinct expression waves of HOX genes and a AGO2-to-AGO3 switch in gene silencing identified.
• •AHNAK hypothesized as a defining factor in MSC biology.

     

ISL1与PHF8相互作用促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞的分化

近年的研究发现,在心肌细胞分化过程中,转录因子可以与表观修饰蛋白质结合进行更为精细的转录调控.作为转录因子的胰岛素基因增强子结合蛋白1（islet1, ISL1）,在心血管发育过程中发挥至关重要的作用.然而, ISL1是否能够与表观修饰蛋白质相互作用,从而发挥更为精细的调控作用,目前尚未明确.本室研究发现,ISL1在小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中,能够与组蛋白去甲基化酶PHD指蛋白8(PHF8)相互作用从而促进分化. 实时RT-PCR和Western 印迹的方法检测显示,ES细胞向心肌细胞分化过程中ISL1和PHF8具有相似的表达谱.通过免疫共沉淀的方法检测分化过程中ISL1与PHF8的结合,通过染色质免疫沉淀的方法对二者在ISL1下游靶基因增强子区的结合水平进行检测,利用实时RT-PCR检测二者的相互结合对心肌细胞分化的影响.结果显示,ISL1能够与PHF8相互作用,共同结合在ISL1下游靶基因Mef2c和Myocd的增强子区,协同促进ES细胞向心肌细胞的分化.本研究证实,在心肌细胞分化过程中,ISL1存在与表观修饰蛋白质PHF8的相互作用,从而进一步促进心肌细胞的分化.     

动物胚胎干细胞诱导分化的研究进展

胚胎干细胞 (ES细胞 )是从动物早期胚胎的内细胞团或原始生殖细胞分离出来的具有发育全能性的一种未分化的无限增殖细胞系 ,ES细胞能体外诱导分化为神经细胞、肌肉细胞、成纤维细胞等各种细胞。综述了动物的ES细胞的分化诱导机理及目前体外诱导分化的研究现状     

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.