小鼠胎肝和骨髓造血基质细胞贴壁层对红系祖细胞生长的影响

本实验以Dexter培养体系作小鼠胎肝和骨髓造血基质细胞贴壁培养。在所获的基质细胞贴壁层上作红系造血祖细胞集落培养,观察两种来源造血基质细胞对红系集落生长的影响。实验结果表明,胎肝造血基质细胞贴壁层能明显促进早期红系造血祖细胞(BFU-E)形成集落,却不明显影响晚期红系造血祖细胞(CFU-E)的生长。成年小鼠骨髓造血基质细胞贴壁层对BFU-E和CFU-E均有刺激生长的作用;但对前者生长的刺激性影响较胎肝造血基质细胞贴壁层为弱。造血基质细胞贴壁层对红系集落生长的促进作用主要是通过体液因子实现的,细胞间短距离调节的影响亦不能除外。     

红景天苷对骨髓抑制贫血小鼠造血祖细胞增殖的影响

采用造血祖细胞培养技术,观察红景灭苷体内给药和细胞培养直接用药对骨髓抑制贫血小鼠造血祖细胞增殖和骨髓有核细胞数目的影响.结果显示,体内用药能显著增加BMC数目,促进BFU-E、CFU-E、CFU-GM和CFU-Meg集落形成(P<0.05);在一定浓度下,体外用药也能显著促进BFU-E、CFU-E、CFU-GM和CFU-Meg集落形成(P<0.05).结果提示,红景天苷可能通过间接或直接作用刺激骨髓抑制贫血小鼠造血祖细胞的增殖来促进造血功能的恢复.     

BCL-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸对原代急性白血病细胞选择性抑制作用

为探讨BCL-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(AS-PS-ODN,ASPO)对急性原代白血病细胞和正常或良性血液病骨髓细胞的作用是否存在差别。应用台盼蓝拒染试验测定细胞存活力;用造血祖细胞集落培养:粒—单系祖细胞集落(CFU-GM),多向祖细胞集落(CFU-Mix),后红系祖细胞集落(CFU-E)、前红系祖细胞集落(BFU-E)和白血病祖细胞集落(CFU-AML,CFU-ALL)培养检测细胞增殖能力;免疫细胞化学染色检测细胞BCL-2蛋白表达变化。结果发现(1)正常或良性血液病骨髓细胞经10μmol/L ASPO处理一周,同对照组比较:细胞生长数、CFU-GM、CFU-Mix、CFU-E、BFU-E及BCL-2蛋白表达均无显著差别(P<0.05)。(2)急性原代白血病细胞经5μmol/L ASPO处理一周,同对照组比较:细胞生长数显著减低;CFU-AML或CFU-ALL显著降低(P < 0.05),而CFU-GM明显增高(P< 0.05);对照组BCL-2蛋白表达率为77.92％±22.50％,ASPO组于培养的第3天为54.05％±20.20％(P<0.01)和第6天为55.35％±22.74％(P<0.05)均显著低于对照组。因此认为BCL-2ASPO具有选择性地抑制白血病细胞的增殖和BCL-2蛋白的表达的作用。     

检测重组细胞因子生物活性的细胞培养方法的探讨

目前有关造血的基因重组的细胞因子不断出现,如EPO、TPO、G-CSF、SCF及多种白介素等等。如何评价这些细胞因子的生物活性,已成为重要研究课题,基中对造血祖细胞的增殖分化的影响是一个重要的技术途径。本文就常用的几种体外培养体系及方法作一探讨,以提供检测基因重组细胞因子活性的有效方法。 ①培养体系的选择,大致分为二大类:琼脂培养法主要用于粒-巨噬系祖细胞CFU-GM;培养甲基纤维素法,用于CFU-E、BFU-E、     

一种新型生物反应器在造血干/祖细胞体外扩增中的应用

针对造血干/祖细胞体外扩增对培养环境的需求, 结合静/动态培养的特点, 开发了一种新型的生物反应器用于造血干/祖细胞的体外扩增.在该生物反应器内, 采用SCF TPO Flt-3细胞因子组合, 比较了静态和循环培养两种方式体外扩增脐血CD34 细胞的效果.培养7 d后, 总细胞分别扩增了(13.86 ± 4.26)和(7.23 ± 2.67)倍, 显示静态培养有利于总细胞的扩增; CD34 细胞扩增倍数、培养物中CD34 细胞含量均相近, 无显著性差异; 而CD34 CD38-细胞扩增倍数以及培养物中CD34 CD38-细胞的百分含量分别为(1.82 ± 0.58)和(3.90 ± 0.85)倍以及(9.45 ± 4.85)和(37.47 ± 14.06)%, 循环培养明显高于静态培养.可见, 在该生物反应器内, 采用静态和循环两种培养方式, 均能实现造血干/祖细胞的体外扩增, 但静态培养促使造血干细胞向定向祖细胞分化, 而循环培养则更有利于早期造血干细胞的扩增.     

造血细胞活力冷冻损伤的可恢复性

人骨髓冻存后其造血祖细胞活力有一定程度下降,本研究对这种下降的可逆性作了初步观察。结果发现,用双层法和单层法作CFU-GM培养时,未冻存骨髓集落产率相近,冻存骨髓双层法的CFU-GM产率高于单层法。骨髓细胞用20％FM-CM、PHA-LYCM、PHA-PMCM预孵育2h后,分别测定其CFU-GM、BFU-E与CFU-Mix,发现这种孵育过程对未冻存骨髓的集落产率无明显影响,而冻存骨髓的集落产率在孵育后可升高(GEMmeg除外)。说明骨髓造血祖细胞对冻存的损伤反应不均一,部分受损细胞在一定条件下可以恢复其增殖活力。这对于用冻存骨髓作骨髓移植可能有一定意义。     

一种新型生物反应器在造血干/祖细胞体外扩增中的应用

针对造血干/祖细胞体外扩增对培养环境的需求, 结合静/动态培养的特点, 开发了一种新型的生物反应器用于造血干/祖细胞的体外扩增。在该生物反应器内, 采用SCF+TPO+Flt-3细胞因子组合, 比较了静态和循环培养两种方式体外扩增脐血CD34+细胞的效果。培养7 d后, 总细胞分别扩增了(13.86 ± 4.26)和(7.23 ± 2.67)倍, 显示静态培养有利于总细胞的扩增; CD34+细胞扩增倍数、培养物中CD34+细胞含量均相近, 无显著性差异; 而CD34+CD38-细胞扩增倍数以及培养物中CD34+CD38?细胞的百分含量分别为(1.82 ± 0.58)和(3.90 ± 0.85)倍以及(9.45 ± 4.85)和(37.47 ± 14.06)%, 循环培养明显高于静态培养。可见, 在该生物反应器内, 采用静态和循环两种培养方式, 均能实现造血干/祖细胞的体外扩增, 但静态培养促使造血干细胞向定向祖细胞分化, 而循环培养则更有利于早期造血干细胞的扩增。     

Wnt3a 转基因基质细胞的建立及其对脐血CD34+ 造血干/祖细胞扩增作用的研究

Wnt 信号通路在造血干/祖细胞自我更新的过程中发挥至关重要的作用 . 纯化的 Wnt3a 蛋白可以实现造血干/祖细胞的扩增 . 通过病毒转染原代小鼠骨髓基质细胞,建立转基因滋养层细胞 . 通过共培养对转基因滋养层细胞扩增 CD34+ 造血干/祖细胞的作用进行了研究 . 实验结果显示 , 与普通滋养层加细胞因子组相比,经转基因滋养层加细胞因子组培养的 CD34+造血干/祖细胞集落形成能力 (CFC) 是其 (1.55±0.06) 倍;混合集落形成能力是其 (1.95±0.26) 倍;高增殖潜能集落形成能力 (HPP-CFC) 是其 (1.45±0.40) 倍; LTC-IC 活性是其 (3.83±0.86) 倍 . 结果表明,转基因滋养层细胞通过分泌具有天然活性的 Wnt3a 蛋白能在体外有效地扩增造血干/祖细胞的数量 .     

炎症与肿瘤发生对造血祖细胞发育失衡的影响

主要研究炎症和肿瘤对小鼠造血免疫系统中造血祖细胞(Hematopoietic progenitor cells,HPCs)影响,探索炎症和肿瘤状态下造血-免疫系统间的相关性。利用偶氮甲烷(Azoxymethane,AOM)和右旋糖酐硫酸钠(Dextran sulfate sodium salt,DSS)共同诱导构建小鼠炎症性结肠癌模型,并采用流式细胞术分析正常、炎症和肿瘤小鼠造血祖细胞丰度以及细胞周期。炎症和肿瘤进程中,小鼠骨髓中较上游的多能祖细胞(Multi-potent progenitors,MPPs)占骨髓细胞的百分比显著升高,共髓系同祖细胞(Common myeloid progenitors,CMPs)、巨核细胞/红系祖细胞(Megakaryocyte/erythrocyte progenitors,MEPs)和粒细胞/巨噬细胞祖细胞(Granulocyte/macrophage progenitors,GMPs)也有类似变化,相反共同淋巴祖细胞(Common lymphoid progenitors,CLPs)则显著下降;并且,炎症和肿瘤状态下,髓系祖细胞分裂能力显著强于正常生理状态;肿瘤状态下,小鼠外周血CD4+/CD8+T细胞比值显著下降。炎症和肿瘤进程中,HSPCs偏向髓系分化;肿瘤状态下小鼠细胞免疫功能失衡且长期的炎症损害可能会引起免疫系统的失衡并最终导致肿瘤的形成。     

应用转铁蛋白-Sepharose 4 B亲和层析分离浓集小鼠胎肝CFU-E

本文以人血清转铁蛋白与Sepharose 4B交联制成转铁蛋白-Sepharose 4 B亲和层析凝胶,应用转铁蛋白-Sepharose 4 B亲和柱层析分离浓集小鼠胎肝红系造血祖细胞CFU-E。绝大部分CFU-S和CFU-GM均被转铁蛋白-Seph-arose 4 B亲和柱层析洗脱,且转铁蛋白-Seph-arose 4 B柱层析对CFU-S、CFU-GM无明显浓集作用。大部分BFU-E和几乎所有CFU-E均被吸附在亲和层析柱上;经解离吸附洗脱后,BFU-E和CFU-E浓集倍数分别为6.3倍和9.2倍,由此证明了CFU-E细胞膜表面转铁蛋白受体的高度密集性,为今后以转铁蛋白为分子探针,识别和研究CFU-E提供了实验依据。     

人卵黄囊造血的探讨

采用卵黄囊组织切片、涂片的形态学、细胞化学染色、造血干/祖细胞体外培养及CD_(34)单克隆抗体免疫荧光检测等方法研究表明:人卵黄囊中存在造血岛,造血岛内由于造血微环境的特点致使此期造血主要向红系分化。血岛中检测出CD_(34)~ 细胞,比例高于胎肝及成人骨髓,干/祖细胞于体外培养形成红系集落。结论:人胚胎期造血源于卵黄囊。     

扩散盒血浆凝块培养中E-CFu-D性质的分析

实验研究表明,小鼠骨髓细胞在体内扩散盒血浆凝块中培养2天后所生成的红系细胞团(E-CFU-D),既不是直接起源于BFU-E或ERC,也不是由骨髓幼稚细胞(原红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞)增殖的结果,它是一类在细胞分化中介于ERC和原红细胞之间的造血祖细胞。体内E_p浓度降低时,ERC的分化受阻,但是,E_p对E-CFU-D分化的影响却介于ERC与原红细胞之间。从体内、外的培养结果可见,当E_p浓度增高时,可以增强CFU-E或E-CFU-D的增殖和分化。     

脐血造血细胞的体外扩增：1.生长规律的研究

考察了在添加细胞因子和未添加细胞因子培养条件下的造血细胞群体的生长和代谢,研究了长期培养条件下造血祖细胞生长规律。在静态培养条件下,脐血造血细胞群体的比生长速率为0.34d^-1,倍增时间为2d。培养后期,造血细胞消耗了大部分葡萄糖,乳酸浓度可达40 mmol/L。在造血细胞长期培养条件下,CFU-GM产出最高峰在培养第2周与第3周之间。BFU-E产出最高峰在培养第1周。每天换50%培养液,造血细胞总数扩增了14倍,CFU-GM扩增了13倍,BFU-E扩增了5倍。     

影响hTERT表达水平的主要因子

脐血中存在干 /祖细胞并具有移植造血功能 ,它对临床有重要作用。造血干 /祖细胞中有端粒酶活性 ,此活性与其端粒长短密切相关。端粒酶不仅对人造血过程起重要作用 ,而且对干 /祖细胞移植后的机能恢复也起着键性的作用。人类端粒酶逆转录酶 (ｈＴＥＲＴ)是端粒酶的催化亚单位 ,它与端粒酶的活性高低有直接关系。为探讨ｈＴＥＲＴ基因在人脐血干 /祖细胞中的表达 ,华中科技大学同济医学院马艳萍和邹萍二医师作了分子生物学技术核酸原位杂交研究 ,其结果证实了造血干 /祖细胞成功的移植不仅取决于输入干 /祖细胞的数量 ,而且与其端粒长度密切…     

干/祖细胞、造血干/祖细胞及造血干/祖细胞移植

干／祖细胞的研究是当前的热门课题,造血干／祖细胞移植已应用于临床。主要介绍干／祖细胞,造血干／祖细胞的基本概念和造血干／祖细胞移植的大致状况。     

巨细胞病毒感染对多向造血祖细胞体外增殖的影响

探讨人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)对脐血多向造血祖细胞(CFU-Mix)体外增殖的抑制作用,采用造血祖细胞体外半固体培养技术,培养、观察、计数HCMV-AD_(169)株对脐血CFU-Mix集落产率、抑制率、集落峰值时间和集落维持时间;用聚合酶链反应(PCR)技术检测集落细胞内HCMV-DNA。结果发现HCMV-AD_(169)株感染的CFU-Mix集落产率较对照组明显减少(P<0.01),集落产率随病毒感染滴度的增高而减少,抑制率随病毒滴度的增高而逐渐增加:各组CFU-Mix集落峰值时间为10～12d(P>0.05),不同滴度病毒感染组集落维持时间(15～18d)较对照组(22～24d)明显宿短(P<0.01);经PCR检测病毒感染组,发现CFU-Mix集落细胞内有HCMV-AD_(169) DNA存在。因此认为多向造血祖细胞是HCMV的宿主细胞之一,HCMV-AD_(169)能直接感染多向造血祖细胞,抑制多向造血祖细胞的增殖和分化,此可能是临床HCMV感染患儿出现粒细胞减少、血小板减少和贫血的主要原因。     

远红外线对造血干/祖细胞生物学特性的影响

目的:了解远红外线对造血细胞增殖和定向分化的影响.方法:应用体外小鼠骨髓细胞培养技术,观察远红外线对拉-单祖细胞(CFU-GM),红系祖细胞(CFU-E)和成纤维细胞(CFU-F)增殖和分化的影响,并且利用免疫荧光纳米粒子(1FNB)检测靶细胞表面分化抗原(CD),进一步评佑远红外线对造血干/祖细胞的影响.结果:远红外线在37℃条件下照射时CFU-E、CFU-F和CFU-GM生成有促进作用,小鼠骨髓细胞表面标记有变化,靶细胞经2min照射后,增殖最旺盛.2min组与其它实验组(1min,5min,10min)数据经统计学处理,具有差异性(P均<0.05).结论:远红外线时小鼠骨髓造血干/祖细胞的增殖具有正调节作用并可诱导细胞表面标志改变.     

小鼠胚胎循环血中造血祖细胞的发育特点

目的：系统地考察小鼠胚胎循环血中造血祖细胞的发育特征。方法：应用体外集落形成实验、脾结节形成实验、基质细胞OP9或OP9-DL1共培养体系,分别考察胚胎期10．5d（E10．5）和11．5d（E11．5）小鼠胚胎循环血的髓系祖细胞和淋系祖细胞潜能。结果：小鼠胚胎循环血中含有各类髓系祖细胞,E11．5的小鼠胚胎循环血的髓系祖细胞的数量显著增加;同时循环血细胞经体外诱导可产生B、T淋巴细胞。结论：小鼠E10．5-E11．5的胚胎循环血中存在丰富的具有髓系和淋系潜能的前体细胞。     

低氧环境中微囊化成骨细胞支持造血干/祖细胞扩增

在模拟骨髓造血壁龛(hematopoietic niche)的氧分压条件下,探讨微囊化成骨细胞(osteoblasts,OB)对脐血造血干/祖细胞(HSPC)体外扩增的支持和调控机理．分离培养人髂骨OB,采用聚电解质络合法将第3代的OB以密度为8×105 ml包埋在直径为0.5 mm的明胶-海藻酸钠-壳聚糖(GAC)微胶珠中．将微珠+造血干/祖细胞(A′组)、造血干/祖细胞(B′组)及微珠(C′组)置于6孔板,在5%氧分压下进行培养．同时在20%常氧条件下设置同样分组培养作为对照(A,B,C)．通过流式细胞分析和半固体细胞集落培养,观察比较各培养体系中造血干/祖细胞的扩增,并检测体系内白血病抑制因子(LIF)和白介素-6(IL-6)的含量变化以探讨作用机理．经过倒置相差显微镜观察,人成骨细胞在微珠中分散均匀,生长状态良好．微珠内部有丰富的孔道供营养物质传递,有大量造血干/祖细胞弱黏附于微珠表面．经过7天的培养,A′、B′、A、B四组造血细胞的扩增倍数分别为(49.0 ± 4.6),(3.3 ± 0.5),(17.7 ± 1.2)和(1.9 ± 0.2)．A′、B′、A 组的CD34+细胞分别扩增了(87.6 ± 8.3), (2.2 ± 0.3)和(14.9 ± 1.0)倍,B组则出现下降．A′、B′、A、B四组CFU-Cs集落扩增倍数分别为(9.8 ± 0.8),(3.5 ± 0.4), (6.9 ± 0.7)和(2.6 ± 0.2)．低氧共培养体系比常氧共培养体系和非共培养体系对造血干/祖细胞的扩增有更大的促进作用．A′、B′、C′中IL-6和LIF含量明显高于对应的A、B、C组,与扩增倍数的差异相对应．微囊化成骨细胞对造血干/祖细胞扩增有明显的促进作用,5%氧分压接近体内造血壁龛氧环境,在此环境中成骨细胞分泌细胞因子量增多并通过其对造血干/祖细胞的扩增进行调节．     

胚胎干细胞向造血干/祖细胞定向诱导分化的研究进展

胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)是指由胚胎内细胞团(inner cell mass,ICM)细胞经体外抑制培养而筛选得到的细胞,具有无限增殖潜能,在体外可以向造血细胞分化,有可能为造血干细胞移植和血细胞输注开辟新的来源．此外,ES细胞向造血干/祖细胞的定向诱导分化也为阐明哺乳动物造血发育的细胞和分子机制提供了良好的体外模型．对ES细胞向造血干/祖细胞定向分化的研究进展进行了综述．