来源于Escherichia coli的高比活植酸酶基因的高效表达

高效表达高比活植酸酶是进一步提高植酸酶发酵效价、降低植酸酶生产成本的一个有效途径。对源于Escherichia coli的高比活植酸酶基因appA,按照毕赤酵母（Pichia pastoris）密码子的偏爱进行了密码子优化改造。该改造后的基因appA-m按正确的阅读框架融合到毕赤酵母表达载体pPIC9上的α-因子信号肽编码序列3′端,通过电击转化得到重组转化子。对重组毕赤酵母的Southern blotting分析证实植酸酶基因已整合到酵母基因组中,并确定了整合基因的拷贝数。Northern blotting分析证实植酸酶基因得到了正常转录。SDS-PAGE分析和表达产物的研究表明,植酸酶得到了高效分泌表达,在5L发酵罐中植酸酶蛋白表达量达到2.5mg/mL发酵液, 酶活性(发酵效价)达到7.5×10⁶IU/mL发酵液以上, 大大高于目前报道的各种植酸酶基因工程菌株的发酵效价。     

来源于Escherichia coli的高比活植酸酶基因的高效表达

高效表达高比活植酸酶是进一步提高植酸酶发酵效价、降低植酸酶生产成本的一个有效途径。对源于Escherichiacoli的高比活植酸酶基因appA ,按照毕赤酵母 (Pichiapastoris)密码子的偏爱进行了密码子优化改造。该改造后的基因appA m按正确的阅读框架融合到毕赤酵母表达载体pPIC9上的α 因子信号肽编码序列 3′端 ,通过电击转化得到重组转化子。对重组毕赤酵母的Southernblotting分析证实植酸酶基因已整合到酵母基因组中 ,并确定了整合基因的拷贝数。Northernblotting分析证实植酸酶基因得到了正常转录。SDS PAGE分析和表达产物的研究表明 ,植酸酶得到了高效分泌表达 ,在 5L发酵罐中植酸酶蛋白表达量达到 2 5mg mL发酵液 ,酶活性 (发酵效价 )达到 7 5× 10 6 IU mL发酵液以上 ,大大高于目前报道的各种植酸酶基因工程菌株的发酵效价。     

植酸酶基因的多点突变及在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母基因的密码子选择偏爱性,不改变其编码氨基酸序列,对来源于黑曲霉N25植酸酶phyA基因,进行了突变,构建了含有正确突变的酵母表达载体pPIC9k-phyAm-4,电击转化毕赤酵母,获得优化了密码子的重组酵母转化子。经PCR鉴定表明,植酸酶基因已整合到酵母基因组中; 表达产物的SDS-PAGE分析表明,酶蛋白分子大小为70.15KD。Southern blotting结果表明,phyA基因整合到酵母染色体DNA中;转化子酶活测定结果表明,经密码子优化的重组酵母PP-NPm-4-2酶活可达136900U/ml,比Arg没有优化的PP-NPm-8 (47600 Uoml-1)酶活高约2.8倍。     

黑曲霉N25植酸酶phyA基因在巴斯德毕赤酵母中高效表达的研究

从黑曲霉N25(A.niger China strain)中提取出染色体DNA,根据已经测定出的植酸酶phyA基因全序列设计了一对引物,采用高保真度的聚合酶Advangage-HF扩增到了去除信号肽和内含子后约1.4kb片段,对该片段进行了克隆及序列测定。将该序列与植酸酶phyA基因全序列进行了比较。以此片段构建成功了pPIC9K-phyA载体(命名为pPNP-1),并转化毕赤巴斯德酵母。经G418抗性筛选、酶活性测定、Southern印迹和Western印迹,获得了高效表达的转化子PP-NP-1(23869.4u/ml)、PP-NP-2(20533.0u/ml)、PP-NP-3(35646.7u/ml),其酶活性分别是出发菌株的酶活(513.4u/ml)的46.46倍、39.99倍和69.46倍,且转化子具有很好的遗传稳定性。     

黑曲霉N25植酸酶phyA基因在巴斯德毕赫酵母中高效表达的研究

从黑曲霉N25（A.niger China strain)中提取出染色体DNA,根据已经测定出的植酸酶phyA基因全序列设计了一对引物,采用高保真度的聚合酶Advangage-HF扩增到了去除信号肽和内含子后约1．4kb片段,对该片段进行了克隆及序列测定。将该序列与植酸酶phyA基因全序列进行了比较。以此片段构建成功了pPIC9K-phyA载体（命名为pPNP-1),并转化毕赤巴斯德酵母,经G418抗性筛选,酶活性测定,Southern 印迹和Western印迹,获得了高效表达的转化子PP－NP－1（23869．4u/ml),PP-NP-2(20533.0u/ml),PP-NP-3(35646.7u/ml),其酶活性分别是出发菌株的酶活（513.4u/ml)的46．46倍,39．99倍和69．46倍,且转化子具有很好的遗传稳定性。     

来源于橄榄绿链霉菌A1的高比活木聚糖酶XYNB的高效表达及性质的比较分析

高效表达高比活木聚糖酶是进一步提高木聚糖酶发酵效价、降低其生产成本的有效途径。将橄榄绿链霉菌(Streptomyces olivaceoviridis) A1的高比活木聚糖酶成熟蛋白编码基因xynB克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,转化毕赤酵母得到重组酵母,在重组酵母中木聚糖酶基因得到了高效分泌表达,且表达产物具有生物学活性。在3L发酵罐中蛋白表达量约14mg/mL, 酶活性(效价)为1200IU/mL。SDSPAGE分析表明,表达的木聚糖酶XYNBa为糖基化蛋白, 分子量为31kD, 经脱糖基化处理得到21kD 的XYNBb, 与橄榄绿链霉菌A1所产原酶XYNB大小一致。通过对XYNB、XYNBa及XYNBb酶学性质的比较发现：三者在比活性、Vmax及热稳定性方面有较大差异。该酶对不同木聚糖的酶解产物的糖份分析表明：酶解产物的主要成分为木二糖、木三糖和木四糖,占总糖含量的95%以上。     

黑曲霉N25植酸酶phyA基因在巴斯德毕赤酵母中高效表达的研究*

从黑曲霉N25(A.niger China strain)中提取出染色体DNA,根据已经测定出的植酸酶phyA基因全序列设计了一对引物,采用高保真度的聚合酶Advangage-HF扩增到了去除信号肽和内含子后约1.4kb片段,对该片段进行了克隆及序列测定。将该序列与植酸酶phyA基因全序列进行了比较。以此片段构建成功了pPIC9K-phyA载体(命名为pPNP-1),并转化毕赤巴斯德酵母。经G418抗性筛选、酶活性测定、Southern印迹和Western印迹,获得了高效表达的转化子PP-NP-1(23869.4u/ml)、PP-NP-2(20533.0u/ml)、PP-NP-3(35646.7u/ml),其酶活性分别是出发菌株的酶活(513.4u/ml)的46.46倍、39.99倍和69.46倍,且转化子具有很好的遗传稳定性。     

高效表达具有生物学活性的植酸酶的毕赤酵母

对来源于Aspergillusniger 96 3的植酸酶基因 phyA2进行了改造 ,包括去掉基因中的内含子和信号肽编码序列 ,在不改变所编码氨基酸的情况下 ,定点突变优化了对此基因在酵母中高效表达起关键作用的Arg密码子 .经改造的植酸酶基因按正确的阅读框架融合到毕赤酵母 (Pichiapastoris)高效表达载体 pPIC9上的α 因子信号肽编码序列 3′端 ,重组表达载体电击转化毕赤酵母得到重组转化子 ,经Southernblotting分析证实了植酸酶基因已整合到酵母基因组中 ,并确定了基因整合的拷贝数 .Northernblotting分析证明植酸酶基因能进行正常的转录 .SDS PAGE分析和表达产物的酶活性研究证明 ,植酸酶能有效分泌和高效表达 (Arg密码子优化后其表达量可达每毫升培养液 1 5 0 0 0U ,比Arg密码子没有优化的表达量高约 37倍 ,比原菌株A .niger 96 3的表达量高约 30 0 0倍 ) ,表达产物具有正常的生物学活性 .这是迄今为止我国饲料工业中 ,构建的第 1株具有实用价值和应用前景的生产饲料添加剂的基因工程菌株     

人工合成的黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕酵母系统中的高效表达

本文以黑曲霉（Aspergillus niger)NRRL3135菌株植酸酶基因为对象,通过基因人工合成的方法去除了该基因的内含子与信号肽编码序列,换用在毕赤酵母（Pichia pastoris）中使用频率较高的密码子以优化其表达。该人工合成植酸酶基因（PhyA-as)以N端融合的方式正确插入到毕赤酵母表达载体pPICZαA。通过电击将重组表达载体整合人酵母染色体DNA中得到重组转化子。SDS－PAGE结果与表达产物酶这性质研究表明植酸酶得到分泌表达,且与天然产物性质基本一致。筛选得若干株高产基因工程菌,其中SPAN－Ⅲ菌株达到了在摇庆培养条件下,每毫升发酵液产生165000u植酸酶的水平,基本满足工业化生产的要求。     

人工合成的黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母系统中的高效表达

本文以黑曲霉(Aspergillus niger)NRRL3135菌株植酸酶基因为对象,通过基因人工合成的方法去除了该基因的内含子与信号肽编码序列,换用在毕赤酵母(Pichia pastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。该人工合成植酸酶基因(PhyA-as)以N端融合的方式正确插入到毕赤酵母表达载体pPICZαA。通过电击将重组表达载体整合入酵母染色体DNA中得到重组转化子。SDSPAGE结果与表达产物酶学性质研究表明植酸酶得到分泌表达,且与天然产物性质基本一致。筛选得若干株高产基因工程菌,其中SPANⅢ菌株达到了在摇床培养条件下,每毫升发酵液产生165000u植酸酶的水平,基本满足工业化生产的要求。     

角毛壳菌几丁质酶基因chi58多点突变及在毕赤酵母中的高效表达

应用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,gene SOEing),简称SOE-PCR对角毛壳菌(Chaetomium cupreum)的几丁质酶基因chi58进行多点突变.依据毕赤酵母密码子偏爱性,将毕赤酵母中编码Arg使用频率几乎为0的密码子CGC突变为使用频率高的AGA,构建了含有正确突变的酵母表达载体pPIC9K-chi58A,电转化毕赤酵母GS115,获得的重组酵母株在诱导120 h酶活力最高,平均可达101.71 U/mL±3.33 U/mL;其活力比未优化重组酵母株(31.83 U/mL±4.85 U/mL)提高了约3倍,且经10代传代培养后遗传稳定性良好.表达产物的SDS-PAGE分析表明,酶蛋白分子大小为58 kD.     

热稳定高比活纤维素酶在Pichia pastoris中的表达研究

Bacillus amyoliquefaciens DL-3纤维素酶具有热稳定高比活多功能的酶学特性,本文根据该酶的氨基酸序列合成了其编码基因(cel),构建了pPIC9K-cel表达载体,并用P.pastoris进行了表达。工程菌株三角瓶发酵酶活性达0.50 U/mL,酶解滤纸的产物为低聚糖,表明人工合成的热稳定高比活纤维素酶基因在P.pastoris中可以正常表达、加工及分泌,重组酶的分子量由天然酶的53 kDa增加至68 kDa,糖基化严重。     

Recombinant Pichia pastoris overexpressing bioactive phytase

Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓｉｓａｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｅｌｅｍｅｎｔｆｏｒｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｌｌａｎｉｍａｌｓ,ｐｌａｙｉｎｇｋｅｙｒｏｌｅｓｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｉｎｖｉｔａｌｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙｓ.Ｕｐｔｏ80%ｏｆｔｈｅｔｏｔａｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓｉｎｆｅｅｄｓｔｕｆｆｓｏｆｐｌａｎｔｏｒｉｇｉｎｉｓｔｈｅｐｈｙｔａｔｅｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ.Ｉｔｉｓｐｏｏｒｌｙａｖａｉｌａｂｌｅｔｏｍｏｎｏｇａｓｔｒｉｃａｎｉｍａｌｄｕｅｔｏｔ…     

蜂毒素分子的改造及其基因在毕赤酵母中的表达

为获得保留有抗菌活性而降低溶血作用的蜂毒素,对蜂毒素的分子结构进行了改造。将第5位的Val变为Arg,第15位Ala变为Arg,删除了第16位的Leu。用PCR技术获得了改造后的蜂毒素基因,将其克隆入酵母表达载体pPICZa-A,获得重组表达质粒pPICZa-A-MEA。该质粒转化毕赤酵母菌GS115,甲醇诱导下表达,发酵上清液经抑菌活性、溶血活性测定及亲和层析纯化,结果表明,蜂毒素基因成功地在毕赤酵母中表达,经改造后表达的蜂毒素保留了抗菌活性且溶血活性显著降低,经纯化后用Bradford法测定表达蜂毒素的含量约为0.29mg／ml。     

扩展青霉碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

将编码扩展青霉碱性脂肪酶 (PEL)的cDNA克隆到酵母整合型质粒pPIC3.5K ,电转化His4缺陷型巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)GS115 ,通过橄榄油 MM平板及PCR方法筛选和鉴定重组子。重组子发酵液经SDS PAGE分析、橄榄油检验板鉴定 ,表明扩展青霉碱性脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中获得了高效表达。表达蛋白分泌至培养基中 ,分子量约 2 8kD ,与扩展青霉碱性脂肪酶大小一致 ,占分泌蛋白的 95 %。橄榄油检验板检验表明该表达蛋白可分解橄榄油 ,通过优化该表达菌的发酵条件 ,以橄榄油为底物进行酶活测定 ,其发酵液酶活可达 2 6 0u mL。     

High level expression of a recombinant acid phytase gene in Pichia pastoris

AIMS: To achieve high phytase yield with improved enzymatic activity in Pichia pastoris. METHODS AND RESULTS: The 1347-bp phytase gene of Aspergillus niger SK-57 was synthesized using a successive polymerase chain reaction and was altered by deleting intronic sequences, optimizing codon usage and replacing its original signal sequence with a synthetic signal peptide (designated MF4I) that is a codon-modified Saccharomyces cerevisiae mating factor alpha-prepro-leader sequence. The gene constructs containing wild type or modified phytase gene coding sequences under the control of the highly-inducible alcohol oxidase gene promoter with the MF4I- or wild type alpha-signal sequence were used to transform Pichia pastoris. The P. pastoris strain that expressed the modified phytase gene (phyA-sh) with MF4I sequence produced 6.1 g purified phytase per litre of culture fluid, with the phytase activity of 865 U ml(-1). The expressed phytase varied in size (64, 67, 87, 110 and 120 kDa), but could be deglycosylated to produce a homogeneous 64 kDa protein. The recombinant phytase had two pH optima (pH 2.5 and pH 5.5) and an optimum temperature of 60 degrees C. CONCLUSIONS: The P. pastoris strain with the genetically engineered phytase gene produced 6.1 g l(-1) of phytase or 865 U ml(-1) phytase activity, a 14.5-fold increase compared with the P. pastoris strain with the wild type phytase gene. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: The P. pastoris strain expressing the modified phytase gene with the MF4I signal peptide showed great potential as a commercial phytase production system.     

毕赤酵母中植酸酶和内切葡聚糖酶共表达菌株的构建及其高效表达(英文)

植酸酶和内切葡萄糖苷酶广泛应用于动物饲料添加剂中,能更有效地帮助饲料的利用,同时为动物的生命活动提供必需的重要物质。首先构建重组质粒pPICZα-EG,经过线性化后,电转化到含有植酸酶phyA基因的毕赤酵母感受态细胞中,构成含有植酸酶基因和内切葡萄糖苷酶基因的重组体菌株GS115-phyA-EG。经甲醇诱导后其活性分别达到出发菌株GS115-phyA和GS115-EG的39.4%和56.2%。酶学性质的分析显示,最适反应温度和最适反应的pH值分别为55℃和5.5,植酸酶和内切葡萄糖苷酶在温度为45℃~55℃,pH值为4.5~5.5时,酶活相对稳定,均能达到最高酶活的80%以上。结果表明这种在同一个系统种同时表达2种酶的方法能更好地节约时间和成本,使其在饲料工业的应用上有更广阔的前景。