耐热DNA聚合酶基因双元载体的初步构建

Taq DNA聚合酶是PCR反应中的重要试剂,它具有结构性稳定和耐高温的特性,有能在90℃以上合成DNA的能力,因此被广泛使用于DNA扩增技术当中,但是国内尚未报道有关Taq DNA聚合酶基因用于转基因的研究.若将此耐热基因转入某些经济作物中培育耐热新品种,将会有很好的前景和实用价值.本试验将初步构建Taq DNA聚合酶的基因表达双元载体.通过引物设计,用PCR法从含有Thermus aquaticus DNA polymerase克隆基因的散装Taq DNA 聚合酶中扩增耐热DNA 聚合酶基因,得到约2.5 kb的DNA片段.扩增片段连接到质粒pUC19中测序证实是Taq DNA聚合酶基因,再将该片段重组到双元载体pBin19中,通过蓝白筛选选择重组子,构建耐热DNA聚合酶的基因双元载体pBin19-Taq.对其作进一步的加工,即插入植物启动子和增强子等后,可通过土壤农癌杆菌的介导作用,用作植物转基因之用.     

单分子PCR技术及其应用

常规PCR技术大都以大量DNA分子(一般为105个以上)为模板进行DNA扩增。新近发展起来的单分子PCR技术是一种以极少量DNA分子(1、5或10个分子)为模板进行扩增的技术。在高保真度DNA聚合酶作用下,单分子PCR技术能扩增出高度一致的DNA;在低保真度DNA聚合酶作用下,单分子PCR技术又能构建出含有大量突变基因的DNA库。该将介绍单分子PCR的基本原理、实验步骤、特点及其应用。     

分子生物学技术讲座(六)──聚合酶链式反应(PCR)技术

聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction）技术,简称PCR技术,是近年发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的分子生物学技术。此方法操作简便快速,并且非常有效,可在很短的时间内得到数百万个特异DNA序列的拷贝。目前,此技术已在分子克隆、医学诊断、法医学和考古学等各个领域中得到广泛应用。1基本原理聚合酶链式反应用于扩增位于两个已知序列片段之间的DNA区段。其基本原理是利用TaqDNA聚合酶的聚合活性以及热稳定性,通过3个不同温度的重复循环,即首先双链DNA在含有两种过量引物和4种dNTPS的反应液中高温变性,然后在适当…     

环介导等温扩增技术的研究进展

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新式核酸扩增技术,它依靠一种具有链置换活性的DNA聚合酶和2对特殊设计的引物,不需要反复的温度循环和昂贵的仪器设备,在等温条件下即可高效快速地完成扩增反应,目前已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等病原体的检测,及动物胚胎性别的鉴定。该文总结了LAMP技术的基本原理、相对于传统核酸检测技术的优点、产物的检测方法及其临床应用,最后指出LAMP目前存在的不足以及采取的相应措施,并对其发展前景进行了展望。     

体外核酸快速扩增技术的发展和不断创新

利用聚合酶链式反应(PCR)进行的核酸体外扩增是1983年开始发展起来的一项革命性技术,目前已被广泛运用于现代化的农业和医学以及食品工业等领域,特别是在人类认知基因和基因组的过程中,体外核酸扩增技术做出了卓越的贡献。最初,体外核酸扩增技术主要是利用耐高温的DNA聚合酶(Taq酶),这样就使核酸的体外扩增反应可以在热循环中进行。但因需要使用昂贵的设备和消耗大量的电力,其成本和应用范围都受到一定的限制。之后,恒温体外核酸扩增悄然兴起,这改变了传统扩增技术的局限性,使核酸的体外扩增更加简单和方便。重组酶介导扩增(RAA)法是一种最新型的恒温体外核酸扩增技术,该系统的显著优点在于它在常温下就能实现DNA解链并快速扩增(15~30min完成),反应快速、专一性好、灵敏度高,还可用于定时定量的结果分析。     

几种耐热DNA聚合酶的比较

耐热DNA聚合酶广泛应用在PCR技术。本文将常用的几种耐热DNA聚合酶分为三大类,对它们的性质、差异、用途做一个简单的介绍。     

主编导读

热稳定性高、耐盐性能好、扩增速率高、保真度高的DNA聚合酶在PCR反应中具有广泛的用途.翁妍等[1]从超嗜热古菌(Thermococcus eurythermalis)中克隆了一个B家族DNA聚合酶,命名为Teu-PolB DNA聚合酶.该DNA聚合酶的扩增速率和保真度优于Taq和Pfu DNA聚合酶.扩增产量略高于P...     

聚合酶链反应及其在病毒学工作中的应用

聚合酶链反应(Polymerase Chain reaction,PCR)又称体外基因放大技术,是一种在体外将特异性DNA序列进行高效扩增的方法。DNA或RNA均可作为模板(template),进行扩增。由于逆转录酶的作用,将mRNA转化为cDNA。模板DNA热变性解链,两个寡核苷酸引物(oligonucleotide primers)分别连结在待扩增的DNA片段两侧。在DNA     

一种DNA扩增的新技术： 利用热稳定的Bst DNA聚合酶驱动跨越式滚环等温扩增反应

Bst DNA聚合酶具有热稳定性、链置换活性及聚合酶活性,在体外DNA等温扩增反应中起重要作用. 本文利用Bst DNA聚合酶的5′→3′聚合酶、核苷酸（末端）转移酶及链置换酶活性发展了一种新的体外环式DNA扩增技术跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification,SRCA)．在SRCA反应中,Bst DNA聚合酶以上游引物P1为模板合成其互补链RcP1,并和P1形成双链DNA|之后,Bst DNA聚合酶用其核苷酸转移酶活性在其P1的3′末端沿5′→3′方向随机掺入脱氧核糖核苷酸聚合形成寡聚核苷酸（dNMP)m序列,即DNA的合成反应跨越了RcP1 与下游引物P2之间的缺口|然后,以下游引物P2为模板形成互补序列（RcP2）;接着,Bst DNA聚合酶继续将脱氧核糖核苷酸随机添加到RcP2的3′末端,形成（dNMP)n序列．继而,Bst DNA聚合酶以RcP1为模板,继续催化聚合反应合成互补新链,并通过其链置换酶活性替换P1|如此往复,形成［P1-(dNMP)m-RcP2-(dNMP)n …］序列．本文通过电泳、酶切、测序等方法对扩增产物进行分析,演绎出上述扩增过程,并就工作原理进行了讨论．该反应可能对开发等温扩增技术检测微生物有一定助益,也为解释环介导等温扩增技术中假阳性反应和滚环等温扩增反应中的背景信号提供了线索．     

Bst DNA聚合酶大片段在全基因组扩增中的应用

Bst DNA聚合酶大片段作为一种常用的DNA聚合酶,因其独特的特点:能引发链置换反应、高保真、耐高温等,而成为一种重要的DNA多重置换扩增酶。目的:为减少成本,设计一种高产,方便且扩增活性高的Bst DNA聚合酶大片段表达体系;探究该酶应用于胃癌石蜡包埋组织基因组DNA的扩增条件。方法:采用p TWIN1质粒作为载体克隆表达Bst DNA聚合酶大片段,应用几丁质亲和层析柱纯化该酶,使用该酶对人类基因组DNA进行不同温度下扩增,探究其最适反应温度,并据此对胃癌石蜡包埋组织基因组DNA进行扩增。结果:由此得到的Bst DNA聚合酶大片段能运用于胃癌石蜡包埋组织基因组DNA的扩增,扩增效率可达200倍,并能应用于a CGH芯片。结论:扩增得到保真性高,覆盖基因组范围大的DNA扩增产物。该应用与a CGH结合,使得对少量的癌症石蜡包埋组织DNA样本进行全基因组扩增,并进行其基因拷贝数变异研究成为可能。     

基因标记、转化、表达与检测

再于72℃下放置2.5分钟;用2种BLB引物对共扩增时,94℃1分钟(第一次循环3.5粉爹钟),在65922074利用pCR检测牛淋巴瘤中的牛白血病病那〔英〕/Rasmussen,H.B.…了Bioteeh。ForumEur一2991,s(9)一527~519〔译自DBA,1901,10(23),91一13308〕 利用聚合酶链反应(PCR)从含30只雌牛淋巴瘤样品的材料中将由牛白血病病毒(BLV)引起的肿瘤与其它病因的肿瘤区分开。设计了两种扩增DNA BLV一专性片段的引物对,还设计了第三种识别牛K一酪蛋白基因启动子区的引物对,以控制模板的质量。利用Taq DNA一聚合酶扩增DNA(0 .25件g),条件如下:用1种BLV…     

聚合酶链反应（PCR）对未知序列DNA的扩增技术

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是由引物介导,在体外将特异性DNA序列利用酶促作用进行扩增的方法。双链DNA热变性,然后在低温下与引物退火,再在中等温度下进行延伸,三步为一循环。一般经30～35次循环,很容易将目的基因或DNA片段特异地扩增至少10~6～10~7倍。它已是分子生物学研究中常用的、不可缺少的一项基本技术。但常规PCR需在待扩增的已知序列两端分别设计两个寡核苷酸引物,也就     

快速PCR方法在法医DNA检验中的研究进展

目前法医DNA检验应用的短串联重复序列(short tandem repeat,STR)复合扩增系统均依赖于荧光标记的多重PCR方法。常规DNA检验流程包括提取、定量、扩增、分离和检测,而多重PCR扩增常常是整个过程中的限速步骤,完成28~30个循环大约需要3 h。以往常利用商业化的热循环仪和热稳定DNA聚合酶,但需要很长的PCR循环时间才能够确保100~400 bp的目标片段得到有效且均衡的复合扩增。随着各种缩短扩增时间方法的出现,STR复合扩增不再需要3 h,而是可以减少到几十分钟甚至十几分钟。现主要总结了快速PCR、直接PCR、芯片PCR以及其他快速扩增等方法的研究现状与进展,尤其是在法医DNA检验领域,同时对比了几种常见快速PCR扩增方法,可见缩短扩增时间对DNA检验的意义重大。未来,以芯片为主导、快速检验为目的的全自动、便携式、集成化的DNA分析系统,将使得法医DNA检验从实验室走进案件现场,甚至日常生活,实现真正的快速即时检验。     

DNA指纹技术在污染土壤生态毒理诊断中的应用

生物标记物能在细咆或分子水平上指示暴露．效应关系,是进行污染土壤生态毒理诊断的主要技术手段之一。随着分子生物学技术的飞速发展,出现了一系列以聚合酶链式反应为基础的、在分子水平上检测污染物质导致的生物体DNA损伤的DNA指纹技术。DNA指纹技术的主要类型有：随机扩增多态性DNA（RAPD）、聚合酶链式反应．单链构象多态性（PCR-SSCP）、扩增片段长度多态性（AFLP）、任意引物聚合酶链式反应（AP—PCR）、差异显示反转录聚合酶链式反应（DDRT）、短DNA重复序列（SSR）及限制片段长度多态性（RFLP）等。这些技术与检测基因突变、染色体畸变和损伤为主的一系列经典研究方法如彗星分析、微核实验等相比具有简便、快速、灵敏等优点。本文着重介绍了随机扩增多态性DNA、聚合酶链式反应．单链构象多态性、扩增片段长度多态性3种重要的DNA指纹技术在污染土壤诊断中的应用。     

DNA聚合酶对PacBio SMRT测序结果影响的评价

目的评估不同DNA聚合酶是否会对以16SrRNA全长为测序靶点的肠道微生物多样性研究结果产生影响。方法用美国太平洋公司的三代测序仪(PacBio single molecule real-time sequencing technology)对3份分别采用KAPA HiFi^TM HotStart DNA聚合酶和PCRBIO HotStart DNA聚合酶扩增的军犬粪便样品进行精确至"种"水平的测序分析。结果经配对Mann-Whitney U检验显示,不同DNA聚合酶扩增的同一样品在门、属和种水平上差异无统计学意义(P>0.05),然而在某些相对含量较少的操作分类单元(OTU)上,其扩增效率存在差异。经基于非加权UniFrac距离的非加权组平均法聚类分析和基于加权UniFrac距离的非参数多元方差分析发现不同DNA聚合酶扩增的同一样品其多样性差异无统计学意义(P>0.05)。结论 KAPA HiFi^TM HotStart DNA聚合酶和PCRBIO HotStart DNA聚合酶虽对模板DNA扩增存在一定的偏好性,但该偏好性不影响PacBio SMRT测序结果。     

蛋白质起始的DNA病毒复制机制

DNA聚合酶在DNA合成过程中需要的引物包括RNA引物、DNA自我引物和蛋白质引物3种类型。新DNA链(如冈崎片段)的复制多是在DNA模板上合成一段RNA引物,细小病毒利用其基因组末端的反向末端重复序列(ITRs)自我折叠成DNA引物,而一些DNA、RNA病毒及真菌质粒起始复制反应的引物则是蛋白质。以感染原核生物的噬菌体Phi29和真核DNA病毒腺病毒为例,从复制过程所涉及的蛋白质、对复制原点的识别、复制起始反应、新链的延伸、复制终止过程等方面详细阐述DNA病毒由蛋白质引发的复制机制,并对已商品化的Phi29 DNA聚合酶产品多重置换扩增及单细胞测序等的应用以及基于噬菌体Phi29蛋白质起始的最小复制系统体外扩增异源DNA等最新的应用研究作相关总结介绍。     

聚合酶链反应实验课的教学

聚合酶链反应(PCR)是近年发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的分子生物学技术,该法操作简便快速,并且非常有效,可在很短的时间内得到数百万个特异DNA序列的拷贝.     

特异性DNA倍增技术(PCR)及其应用

特异性DNA倍增技术(PCR)是近年来发展的一种新技术,具有快速、简便、灵敏、特异性高和重复性好等优点,尤其适合于临床分子生物学检测。PCR技术包括三个循环过程:(1)模板DNA的变性,(2)模板DNA-引物的复性,(3)DNA聚合酶作用下的引物链的延伸。本文对耐高温Taq DNA聚合酶、PCR的反应体系、PCR产物特异性的影响因素和PCR技术的应用等几个方面进行了综述。     

耐热DNA聚合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR法从水生栖热菌菌株YT－1中扩增耐热DNA聚合酶基因,得到2．5kb的DNA片段t扩增片段重组到pUCl8中测序证实为Taq DNA聚合酶基因,将该片段重组到pBV221温控表达质粒中,在大肠杆菌中表达出94kDa的重组蛋白,100ml培养物的细胞产酶为1．5×10⁵u,表达的蛋白能催化PCR反应的进行。