利用DNA免疫技术制备SAX蛋白多克隆抗体

骨形态发生蛋白(BMP)属于细胞因子和转化生长因子β(TGF-β)超家族,在胚胎形态发生和器官形成中起重要作用,但目前缺乏BMP信号通路I型受体SAX的各类抗体。本文利用果蝇胚胎提取出总RNA,反转录得到cDNA,将其作为模板通过PCR得到sax基因片段,将片段连接到pCAGGS-P7上,构建成重组质粒pCAGGS-P7-sax。采用质粒DNA免疫技术,免疫了BALB/C小鼠,制备了果蝇SAX蛋白多克隆抗体。进一步分析表明,构建的真核表达重组质粒pCAGGS-P7-saxDNA具有良好的免疫原性,在免疫小鼠后所获得的抗血清抗体效价达1∶100。Western blot和果蝇胚胎免疫荧光检测表明,抗血清能特异型地识别SAX蛋白。果蝇SAX抗体的成功制备为进一步研究sax基因及BMP信号在果蝇心脏发育中的作用奠定了基础。     

P-body及其与mRNA的转录后调节之间的关系

mRNA在真核生物基因表达的转录后调控中发挥着重要作用.然而最新研究发现,一种被命名为P-body胞浆复合体是mRNA转录后调控过程中的一个重要场所,在基因表达过程中起到了至关重要的调控作用.该复合体富含多种功能的蛋白,同时还有细胞因子与RNA等成分组成,其功能特征为参与mRNA降解、翻译抑制、mRNA监视以及RNA介导基因沉默等重要生命活动过程.研究发现,P-body是特化的细胞成分.本文详细阐述P-body的发现、结构特征以及与mRNA转录后调控的关系,使人们对P-body的生物学功能有更深入地了解和认识,另一方面将有助于更进一步深入探讨基因的表达调节机制..     

中介因子复合体在基因转录调控中的作用

近二十年来,人类在不断探索基因转录调控的机制方面取得了长足的进步,其中包括对中介因子复合体(mediator complex)的克隆、鉴定及作用机制的研究。中介因子是由20多种不同蛋白亚基组成的复合体,广泛存在于各种真核生物的细胞中,并且与RNA聚合酶一起构成RNA聚合酶Ⅱ全酶。中介因子复合体可与转录因子和RNA聚合酶Ⅱ相互作用,因而在基因转录过程中发挥着桥梁的作用。中介因子复合体不但能够促进基因转录的激活,有时也能抑制基因转录。本文总结了中介因子复合体的组成、结构及功能方面的研究进展。     

健忘的果蝇

研究人员已经认识到在神经细胞之间的连接处有一分子通道,如突触,控制着长期记忆力的形成。在曼彻斯特剑桥哈佛大学的SamKunes和他的同事研究了叫做RISC的蛋白复合体,这一复合体能够形成部分的RNA干扰机制来帮助小的RNA诸如MicroRNAs来关闭基因。在研究果蝇的过程中,他们显示是合成RISC蛋白复合体中一种支持记忆产生的蛋白质Annitage的特定突触遭到了破坏。而Armitage发生变化的果蝇就会失去长期记忆的能力。在哺乳动物中也已发现了RISC通道,相同的机制在人类中也可能存在。Celt24：191—205（2006）     

PIWI/piRNA与小鼠精子发生

PIWI蛋白特异性地在动物生殖系细胞中表达,对于动物生殖细胞发育分化至关重要。PIWI蛋白可以特异性地与一类被称为PIWI相互作用RNA的小分子非编码RNA结合。它们组装成功能性的复合体从而在转录水平或者转录后水平抑制转座元件的活性来维持基因组的稳定性。本研究系统总结了关于PIWI蛋白功能,piRNA的产生机制及功能,以及PIWI/piRNA复合体及其他蛋白因子在小鼠精子发生过程中发挥功能的分子机制等方面的相关研究进展,这些发现有助于我们更好地了解PIWI/piRNA在精子发生中的功能机制,并为相关男性不育症的诊治提供了理论依据和方法技术。     

RNA干扰技术在果蝇中的应用

RNA干扰是双链RNA特异诱导的转录后期基因沉默.该技术随着不断完善而越来越被广泛地运用于果蝇的功能基因组研究上,双链RNA已经成为果蝇中功能基因的一个十分有效的抑制子,势必使RNA干扰技术成为研究果蝇体内基因功能的强有力的反向遗传学研究技术.     

可用于研究RNA干扰的试剂盒简介

RNA干扰 (RNAi)指双链RNA (dsRNA)通过刺激目标RNA降解而特异性抑制目标蛋白质合成的现象 ,这些目标RNA具有与双链RNA相同的序列。人们假设RNA干扰的机理为两步反应 :起始阶段和效应器阶段。在起始阶段 ,被导入非哺乳动物细胞系统 ,例如果蝇的长双链RNA(2 0 0～ 10 0 0bp) ,被RNaseⅢ家族的一个成员 (例如果蝇中的Dicer酶 )处理成 2 1～ 2 3nt的双链RNA (短干扰RNA ,siRNA)。再进一步切割生成 3′端有两个核苷酸突出的许多双链RNA。在效应器阶段 ,双链siRNA诱发RNA诱导的沉默复合体 (RISC)的形成 ,这是一个由若干蛋白…     

核不均一性核糖核蛋白在RNA加工过程中的作用

在真核细胞中,初始转录产物（前体mRNA）经过一系列复杂的转录后加工过程形成成熟的mRNA.在这一过程中,大量蛋白质和加工因子有序汇集在核糖核蛋白复合体中并参与对前体RNA的加工过程. 该复合体中的蛋白质部分主要由一类约20种称为核不均一性核糖核蛋白的多肽分子构成.除了早期了解的一些结构性功能外,近来已有许多证据显示这些蛋白质在细胞中RNA的代谢及其他活动方面具有更加广泛和积极的作用.     

可用于研究RNA干扰的试剂盒简介

RNA干扰 (RNAi)指双链RNA (dsRNA)通过刺激目标RNA降解而特异性抑制目标蛋白质合成的现象 ,这些目标RNA具有与双链RNA相同的序列 .人们假设RNA干扰的机理为两步反应 :起始阶段和效应器阶段 .在起始阶段 ,被导入非哺乳动物细胞系统 ,例如果蝇的长双链RNA(2 0 0～ 10 0 0bp)被RNaseⅢ家族的一个成员 (例如果蝇中的Dicer酶 )处理成 2 1～ 2 3nt的双链RNA(短干扰RNA ,siRNA) .再经进一步切割生成 3′端有两个核苷酸突出的许多双链RNA .在效应器阶段 ,双链siRNA诱发RNA诱导的沉默复合体 (RISC)的形成 ,这是一个由若干蛋白质…     

昆虫RNA沉默抗病毒机制研究进展

RNA沉默是昆虫用来抵御病毒入侵的一种普遍而又进化保守的防御机制, 而昆虫病毒也会相应地编码沉默抑制子来破坏宿主的防御功能。本文主要结合果蝇的相关研究成果对昆虫RNA沉默抗病毒机制、 RNA沉默抑制子的作用特征及宿主与病毒的共进化关系做一综述。研究表明, 由小干扰RNA (small interfering RNAs, siRNA)介导的RNA干扰在果蝇抗病毒防御机制中发挥重要作用。果蝇中Dicer-2（Dcr-2）, argonaute-2（AGO2）和双链RNA结合蛋白R2D2是siRNA干扰途径中的3个关键组分, 这3个基因的缺失或突变会显著提高果蝇对RNA病毒的感受性。此外, 果蝇中还鉴定了其他与RNA干扰密切相关的基因, 如vasa intronic gene, aubergine, armitage, rm62 和piwi, 它们在抗病毒感染中同样发挥重要作用。果蝇病毒中已鉴定出3种RNA沉默病毒抑制子（viral suppressors of RNAi, VSRs）, 分别为果蝇FHV病毒沉默抑制子FHV-B2、 果蝇C病毒沉默抑制子DCV-1A及果蝇CrPV病毒沉默抑制子CrPV-1A。FHV-B2和DCV-1A通过与dsRNA或siRNA结合抑制RNA沉默, 而CrPV-1A通过与AGO2结合阻止RISC的形成抑制RNA沉默。在漫长的进化过程中, 病毒和宿主相互博弈, 协同进化。昆虫抗病毒沉默途径中的关键组分通过保持持续和快速进化来对抗高度变异的VSRs。     

A Complex Containing RNA Polymerase II, Paf1p, Cdc73p, Hpr1p, and Ccr4p Plays a Role in Protein Kinase C Signaling

Yeast contains at least two complex forms of RNA polymerase II (Pol II), one including the Srbps and a second biochemically distinct form defined by the presence of Paf1p and Cdc73p (X. Shi et al., Mol. Cell. Biol. 17:1160–1169, 1997). In this work we demonstrate that Ccr4p and Hpr1p are components of the Paf1p-Cdc73p-Pol II complex. We have found many synthetic genetic interactions between factors within the Paf1p-Cdc73p complex, including the lethality of paf1Δ ccr4Δ, paf1Δ hpr1Δ, ccr4Δ hpr1Δ, and ccr4Δ gal11Δ double mutants. In addition, paf1Δ and ccr4Δ are lethal in combination with srb5Δ, indicating that the factors within and between the two RNA polymerase II complexes have overlapping essential functions. We have used differential display to identify several genes whose expression is affected by mutations in components of the Paf1p-Cdc73p-Pol II complex. Additionally, as previously observed for hpr1Δ, deleting PAF1 or CDC73 leads to elevated recombination between direct repeats. The paf1Δ and ccr4Δ mutations, as well as gal11Δ, demonstrate sensitivity to cell wall-damaging agents, rescue of the temperature-sensitive phenotype by sorbitol, and reduced expression of genes involved in cell wall biosynthesis. This unusual combination of effects on recombination and cell wall integrity has also been observed for mutations in genes in the Pkc1p-Mpk1p kinase cascade. Consistent with a role for this novel form of RNA polymerase II in the Pkc1p-Mpk1p signaling pathway, we find that paf1Δ mpk1Δ and paf1Δ pkc1Δ double mutants do not demonstrate an enhanced phenotype relative to the single mutants. Our observation that the Mpk1p kinase is fully active in a paf1Δ strain indicates that the Paf1p-Cdc73p complex may function downstream of the Pkc1p-Mpk1p cascade to regulate the expression of a subset of yeast genes.     

人CDC73基因编码蛋白的理化性质及功能研究

采用生物信息学方法对人CDC73 (cell division cycle 73)基因编码蛋白的理化性质、亲疏水性、跨膜区域、信号肽区域、二级结构、三级结构、蛋白质之间的相互作用、亚细胞定位进行预测分析。使用多种分析软件对人CDC73基因编码蛋白进行预测分析。研究可知,人CDC73基因属于抑癌基因,该基因编码一个由531个氨基酸组成的肿瘤抑制因子Parafibromin,其等电点为9.63,半衰期为30 h且在哺乳动物中高度保守;二级结构预测发现13个α螺旋和10个β折叠片层,三级结构预测结果的可靠性达69.01%,亚细胞定位主要分布于细胞质及细胞核。由本研究可知,人CDC73基因编码蛋白是一个存在核定位序列的不稳定亲水蛋白,在细胞内广泛分布并参与多种生命活动过程,且能够抑制肿瘤的产生。对人CDC73基因编码蛋白结构和功能的预测分析,可为其进一步的研究提供一定的理论依据,也为相关疾病的诊治提供新的思路。     

利用传递不平衡分析在多群体中鉴别猪脐疝易感基因

在本实验室前期利用白色杜洛克×二花脸F₂资源家系开展脐疝易感位点全基因组扫描定位的基础上,文章在7号染色体上的SWR1928和10号染色体上的SW830易感标记区域,结合脐疝发病机制在多群体中进行脐疝位置功能候选基因的筛选和易感位点的精细定位。在两个显著关联的微卫星位点区域搜寻到12个位置功能候选基因,采用比较测序法,选取12个候选基因内共计40个SNP位点在白色杜洛克×二花脸资源家系F₂/F₃脐疝群体中进行基因分型,利用Plink v1.07软件对基因型数据进行质量控制和传递不平衡(Transmission disequilibrium test,TDT)分析。结果表明,IL16(Interleukin 16)基因中的g.708C>T位点和CDC73(Cell division cycle 73)基因中的g.10664G>A位点与脐疝的关联性达到显著水平(P<0.05)。对这两个位点在西方商业猪种脐疝患病家系中进行基因分型和TDT验证分析,发现CDC73基因中的g.10664G>A位点仍与猪脐疝呈显著关联(P<0.05)。同时对CDC73基因中与资源家系脐疝呈弱相关的两个SNP位点g.10546A>G和g.10811A>G在西方商业猪种中进行TDT验证分析,发现这两个SNP位点与商业猪种脐疝发生的关联性达到极显著水平(P<0.01)。根据文章的分析结果,结合脐疝发生的生理机制及CDC73基因的生物学功能,推测CDC73基因可能为猪脐疝发生的易感基因。