草鱼呼肠孤病毒RNA聚合酶基因功能区在原核细胞中的表达

草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus)为我国分离、鉴定的第一株水生动物病毒.1983年,我国首次报道引起爆发性草鱼出血病的病原为草鱼出血病病毒[1,2],其后相继进行了系统的病毒形态学、生物学、生物化学及分子生物学特性等研究[3-8].自1979年Meyers T R等报道从水生动物中分离出第一株呼肠孤样病毒,迄今国际上已分离鉴定40余种水生呼肠孤病毒(aquareovirus).在这些分离株中,大多数毒株不能引起寄主的病理反应或仅表现出较弱的致病性.然而研究认为,GCRV为水生呼肠孤病毒中致病力最强的毒株[9].可见,以GCRV为模型,研究水生呼肠孤病毒的复制与致病机理具有一定的理论及实际意义.我们在对GCRV反应核心及体外转录研究中,已证实GCRV RNA聚合酶在病毒粒子中的存在及其位置[5];GCRV序列测定及定位结果显示,GCRV-VP2多肽为该病毒RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase RdRp)[6,7].为了探讨草鱼呼肠孤病毒的侵染与宿主的相关性及复制机制,我们首次进行了该病毒RNA聚合酶基因(GCRV-RdRp)功能区序列在原核细胞中的表达研究,并得到高效表达融合蛋白.这一结果将为该酶的活性及特性分析提供实验依据.下面报道本研究结果.     

呼肠孤病毒内源性转录的结构基础

呼肠孤病毒为自然界特有的分段dsRNA基因组,其宿主范围十分广泛,包括哺乳动物、无脊椎动物、植物、真菌与细菌.随着结构生物学与信息处理等新技术的运用与发展,近年来,在呼肠孤病毒结构研究方面已取得突破性成果.特别是运用X射线晶体衍射及低温电镜与三维重构术对呼肠孤病毒核心蛋白与完整颗粒结构高分辨率的解析,不仅揭示了呼肠孤病毒核衣壳蛋白所具有的转录酶活性,同时阐明了内源性RNA转录与调节的结构基础.     

呼肠孤病毒内源性转录的结构基础

呼肠孤病毒为自然界特有的分段dsRNA基因组,其宿主范围十分广泛,包括哺乳动物、无脊椎动物、植物、真菌与细菌。随着结构生物学与信息处理等新技术的运用与发展,近年来,在呼肠孤病毒结构研究方面已取得突破性成果。特别是运用X射线晶体衍射及低温电镜与三维重构术对呼肠孤     

反向遗传操作技术在呼肠孤病毒中的研究与应用

呼肠孤病毒科成员复杂,宿主范围广,对动物危害较大,使用经典遗传学方法解决呼肠孤病毒研究中出现的诸多科学问题受到限制,反向遗传学技术的发展和应用极大促进了呼肠孤病毒的基因组功能、蛋白质的作用、致病机制、新型疫苗开发等方面的研究。本文概述了呼肠孤病毒反向遗传操作技术的发展过程以及应用该技术取得的一些研究成果,并对该技术在呼肠孤病毒研究领域的推动作用进行了展望。     

草鱼呼肠孤病毒的三维重构与衣壳蛋白特性

草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)为呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属一新成员. 最新的基因组序列分析发现, GCRV与哺乳动物呼肠孤病毒(mammalian reovirus, MRV)具有高度的同源性. 为了解GCRV致病机理, 进行了分辨率达到17 Å的三维重构与衣壳蛋白特性研究. 结果表明: GCRV颗粒呈多层排列, 包括RNA核心与内壳层、中间层及外壳层. 由200个按T = 13对称排列的三聚体组成外衣壳, 其典型特征是在5次轴上出现三聚体缺失凹陷区, 暴露出中间层三聚体亚单位. 内壳层由120个单体组成, 按T = 1排列, 结构特点与呼肠孤病毒科成员内衣壳特征相一致. 衣壳蛋白电泳显示, GCRV颗粒含有7种蛋白(VP1-VP7)组分, 与MRV衣壳蛋白特性相近, 两者在衣壳结构组成上的相似性与基因组序列的高度同源性相吻合. 此结果对进一步研究GCRV与宿主细胞相互作用机理具有指导意义.     

基于CRISPR/Cas9技术的高通量筛选平台:发掘病毒复制相关宿主分子的新途径

病毒作为严格的细胞内寄生生物,需要多种宿主蛋白辅助其完成生命周期。寻找与病毒复制相关的宿主因子并揭示其作用机制,将有助于阐明病毒的感染机制,为疫病的防治提供新靶标。与RNA干扰技术相比,近年来兴起的CRISPR/Cas9技术能更特异、高效、准确地实现基因组编辑,因而在功能基因研究中得到更广泛应用。而基于CRISPR/Cas9系统的宿主全基因组sgRNA文库高通量筛选技术平台,可快速发现参与病毒侵入、复制等生物学过程的关键宿主因子,通过明确病毒-宿主分子相互作用进而揭示病毒的生命周期,为分子病毒学和免疫学提供了强大的研究工具。本文主要总结了基于CRISPR/Cas9技术的高通量筛选平台的具体筛选流程,归纳和讨论了该平台在筛选调控病毒复制相关宿主因子中的应用现状和发展前景。     

昆虫质型多角体病毒的研究进展

质型多角体病毒(Cytoplasmic polyhedrosis virus,CPV)隶属呼肠孤病毒科Reoviridae质型多角体病毒属Cypovirus,通常基因组由10个节段双链RNA构成。RNA分子量为3～27u。根据病毒基因组dsRNA片段在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶中电泳图谱的差异,目前CPV已被分为19个电泳型。不同于呼肠孤病毒科其它成员,CPV为单层衣壳,而不是常见的双层衣壳结构,衣壳蛋白主要由衣壳蛋白、大突起蛋白及塔式突起蛋白组成。大部分质型多角体病毒引起昆虫慢性疾病,造成寄主死亡或适应性降低。随着RNA病毒基因序列测定技术的成熟,质型多角体病毒的序列测定方面取得较大进展,目前GenBank核苷酸序列数据库中已经公布了家蚕Bombyx mori CPV电泳型1两个株系(H株和I株)、舞毒蛾Lymantria dispar CPV电泳型1、舞毒蛾CPV电泳型14及粉纹夜蛾Trichoplusia ni CPV电泳型全基因组序列,为该病毒的进化与起源的研究提供更多的遗传信息。本文从结构功能、侵染特点、基因组特点及应用前景等方面综述了昆虫质型多角体病毒的研究进展。     

棉铃虫5型质型多角体病毒RNA聚合酶的确定与功能机制研究

棉铃虫5型质型多角体病毒属于呼肠孤病毒科质型多角体病毒属,以重要农业害虫棉铃虫为其天然宿主,对棉铃虫的生物控制具有重要意义.本文对棉铃虫5型质型多角体病毒第3片段编码的蛋白的功能进行了初步研究.首先通过同源性对比,推测其所编码的蛋白可能行使RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)的功能.通过体外活性研究确定了该蛋白的RdRP活性,并确定了其保守活性位点GDD.随后以病毒基因组RNA和3′-OH封闭的病毒基因组RNA为模板,利用Northern blot方法研究该蛋白起始病毒基因组RNA合成的分子机制.结果表明,该病毒的RdRP主要通过引物非依赖的方式起始病毒基因组RNA的合成,并且该RdRP蛋白并不具有末端转移酶活性.最后,对RdRP行使功能的生化条件进行探索,发现RdRP功能的发挥需要二价金属离子Mg2+的存在.     

中华绒螯蟹二株呼肠孤病毒的初步研究

在研究中华绒螯蟹病害的过程中,分离到两株呼肠孤病毒(分别命名为EsRV816和Es RV905).EsRV816从江苏某养殖场分离,EsRV905从武汉某养殖场分离.EsR V816和EsRV905 的病毒粒子为球状对称结构,大小分别为65nm和55nm.病毒粒子基因组分别为10和12个 节段的双链RNA.根据它们的宿主范围、基因组节段数及电泳型,这两种病毒很可能属于呼肠孤病毒科的两个新属.     

microRNA与病毒感染

microRNA是一类新近发现的由20-23个核苷酸构成的非编码RNA分子,它在生命进程中起着重要作用.病毒的复制和繁殖依赖于宿主细胞,而且对细胞环境的变化敏感.研究表明宿主和病毒都可以编码microRNA,病毒可通过小RNA介导的干扰作用影响宿主细胞,也能利用自身的"独特战略"改变宿主细胞从而满足自己生存的需求,所以,宿主与病毒间存在microRNA-mRNA相互作用的机制.尽管时microRNA与病毒感染的关系研究时间不长,但目前的研究结果为我们理解病毒和宿主之间的相互作用提供了一条途径,并为寻找病毒感染的生物标志物和治疗方法提供了新的思路.