A组轮状病毒NSP1基因克隆表达及免疫学性质研究

轮状病毒（rotavirus, RV）非结构蛋白1（non structural protein 1, NSP1）在病毒与宿主的相互作用中发挥着重要的功能。运用基因克隆和表达技术在大肠杆菌中表达了TB-Chen株RV NSP1蛋白,进行了NSP1的免疫学性质和RV感染细胞中NSP1蛋白的合成与分布以及NSP1的系统进化和基因分型研究。结果表明,大肠杆菌BL21(DE3)能高效表达重组NSP1蛋白（rNSP1）,rNSP1表达量约占菌体总蛋白的34.4%。rNSP1能诱导免疫豚鼠产生特异性血清抗体。Western blot及免疫荧光检测结果表明,抗rNSP1血清抗体能特异性识别自身蛋白,对SA11、Wa株的NSP1蛋白有交叉反应性;免疫荧光结果还表明,SA11感染的MA104细胞中合成的NSP1蛋白在细胞质中区域化聚集形成辐射状排列的颗粒状结构,而Wa株的NSP1不能形成此样结构。至今发现的A组RV至少可以分为16个不同的NSP1基因型,TB-Chen株NSP1为A2型。不同基因型有独特的敏感宿主范围,同一基因型可能感染不同种动物,同一种动物也可能感染不同基因型。基因型A4型和A16型仅在鸟类病毒株中出现;而且鸟类中只有A4型和A16型。研究结果为进一步研究NSP1蛋白质的结构功能及其应用开发奠定了很好的基础。     

A组人轮状病毒NSP2基因的克隆、表达及免疫学性质研究

轮状病毒非结构蛋白NSP2在病毒基因组复制过程中起重要作用。在原核系统中重组表达了来自中国的第一株全基因组被克隆和研究了的轮状病毒NSP2,并进一步对其免疫学性质进行了研究。结果显示,在大肠杆菌中能够高效表达重组NSP2蛋白,而且该蛋白能够诱发豚鼠产生特异性抗体。Western blot和免疫荧光检测表明所得抗体不仅能与该重组NSP2蛋白发生特异性反应,而且可以与轮状病毒SA11株或Wa株感染的MA104细胞中表达的NSP2发生反应。以上这些结果为进一步研究该重组NSP2蛋白的结构、功能及免疫学性质奠定了基础.     

人轮状病毒NSP4蛋白的表达及其致小鼠腹泻作用的初步研究

研究人轮状病毒非结构蛋白NSP4在轮状病毒致病性中的作用。分离得到我国人轮状病毒97SZ8株,以谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白的形式在大肠杆菌BL-21中表达NSN蛋白C端86-175氨基酸并用G1utathione SepharoseTM 4B亲和纯化。将纯化蛋白分别以0．4nmol和1．5nmol的剂量腹腔注射新生Balb／C乳鼠,记录腹泻发生和体重变化情况。当注射0．4nmol GST-NSP4重组蛋白时,有1只小鼠发生-过性腹泻(1／6),给予1．5nmol重组蛋白时,实验组所有乳鼠都先后出现了腹泻,存在一定的剂量依赖性。本研究初步在新生小鼠建立了一种人轮状病毒腹泻动物模型,该模型有望在人轮状病毒的致腹泻机理、治疗和预防研究中发挥重要作用。     

人轮状病毒NSP4蛋白的表达及其致小鼠腹泻作用的初步研究

研究人轮状病毒非结构蛋白NSP4在轮状病毒致病性中的作用.分离得到我国人轮状病毒97SZ8株,以谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白的形式在大肠杆菌BL-21中表达NSP4蛋白C端86-175氨基酸并用GlutathioneSepharoseTM 4B亲和纯化.将纯化蛋白分别以0.4nmol和1.5nmol的剂量腹腔注射新生Balb/C乳鼠,记录腹泻发生和体重变化情况.当注射0.4nmol GST-NSP4T重组蛋白时,有1只小鼠发生一过性腹泻(1/6),给予1.5nmol重组蛋白时,实验组所有乳鼠都先后出现了腹泻,存在一定的剂量依赖性.本研究初步在新生小鼠建立了一种人轮状病毒腹泻动物模型,该模型有望在人轮状病毒的致腹泻机理、治疗和预防研究中发挥重要作用.     

轮状病毒非结构蛋白NSP1与宿主的相互作用

轮状病毒（rotavirus,RV）非结构蛋白1（nonstructural protein 1,NSP1）是轮状病毒逃避宿主天然免疫应答的关键蛋白质。它可以与干扰素调控因子家族（interferon regulatoryfactor family,IRFF）的共同区域结合,阻断干扰素表达的信号通路,降低宿主细胞I型干扰素（type I interferon,IFN-I）的表达,从而抑制宿主天然抗病毒免疫机制的建立。因此,NSP1被认为是轮状病毒的一种重要毒力因子。本文综述了近年来轮状病毒NSP1与宿主相互作用的研究进展。     

G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6和NSP4编码基因的分子特征

最近在亚洲首次发现并报道了感染人的G5型人A组轮状病毒LL36755株,为进一步探讨其进化来源,克隆了G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6、NSP4编码基因,并分析其基因序列的分子特征。结果发现卢龙株LL36755为罕见的G5P[6]型,其VP6的亚群为SGⅡ型,NSP4的基因型为B型。系统进化树分析表明,卢龙株LL36755的VP7、VP4编码基因与猪来源的毒株关系密切,而VP6、NSP4编码基因与人来源的毒株紧密相联系。可以推断新的人腹泻A组轮状病毒LL36755株是猪的VP7,VP4编码基因与人的VP6,NSP4编码基因的自然重组;而且该毒株不是G5的原型,很可能是人类轮状病毒与猪轮状病毒毒株的自然重组后逐步进化而来。     

A组人轮状病毒VP6基因克隆及在大肠杆菌中的高效表达

轮状病毒(rotavirus RV) 结构蛋白VP6位于病毒三层衣壳结构的中间层,在病毒粒子的形成过程中起重要的作用。从临床样品中分离的人轮状病毒TB-Chen株VP6基因通过RT-PCR得到扩增产物。以pET作为表达载体,将VP6蛋白编码基因序列插入到质粒pET中成功构建原核表达质粒pET-VP6。实验表明,带有pET-VP6质粒的大肠杆菌BL21(DE3)可以高效表达目的蛋白VP6,重组表达产物VP6占菌体总蛋白的27.4%, 其分子量约为45 kDa,并且能被豚鼠抗SA11血清抗体识别（Western blot）。这一结果为进一步研究VP6的结构和功能奠定了重要的物质基础。     

轮状病毒不同基因型NSP4的免疫原性研究

NSP4作为轮状病毒的致泻相关蛋白,其在疫苗研究中的作用近年来深受瞩目。为比较不同基因型非结构蛋白NSP4的免疫原性,我们构建了四种基因型的重组表达质粒pCI-97B6、pCI-97S36、pCI-97S34和pCI-97SZ8,在细胞水平进行瞬时表达检测后,进一步免疫小鼠,检测血清IgG抗体滴度和亚型。结果表明利用真核表达质粒表达的NSP4蛋白既可以诱导体液免疫反应,又可以诱导细胞免疫反应,但以体液免疫为主,不同基因型NSP4可具有不同的免疫原性。     

A组轮状病毒我国地方株VP6基因的序列测定及其在杆状病毒系统中的表达

通过反转录－ 聚合酶链反应（ Ｒ Ｔ－ Ｐ Ｃ Ｒ） 获得了轮状病毒地方株 Ｔ１１４ Ｖ Ｐ６ 全基因的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段,将其克隆入转移载体质粒ｐ Ｖ Ｌ１３９３ 中,构建成重组质粒ｐ Ｖ Ｌ１３９３ － Ｖ Ｐ６ 。对克隆的 Ｖ Ｐ６ 基因进行序列测定,并用它和杆状病毒（ Ａｃ Ｍ Ｎ Ｐ Ｖ） 野毒株 Ｄ Ｎ Ａ 共转染 Ｓｆ９ 细胞,筛选纯化得到含 Ｖ Ｐ６ 基因插入片段的重组杆状病毒,并进行了表达重组蛋白 Ｖ Ｐ６ 的检测。测序结果显示 Ｖ Ｐ６ 基因全长１ ３５６ｂｐ ,序列分析显示与 Ｗａ 株非常接近,提示 Ｔ１１４ 为亚组Ⅱ病毒株。用高价免疫血清经 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测表达产物,结果显示,重组病毒感染细胞裂解液样品中可见大小约４５ｋ Ｄ 的特异条带;亚组Ⅱ特异性单抗检测到大小约１２０ｋ Ｄ 的条带,提示重组蛋白 Ｖ Ｐ６ 获得了表达,具有正常的抗原反应性和天然 Ｖ Ｐ６ 的三体结构。     

表达轮状病毒nsp4基因重组腺病毒的构建与免疫评价

目的:应用非复制腺病毒表达系统构建表达人轮状病毒非结构蛋白4(NSP4)的重组腺病毒,初步评价其免疫保护效果。方法:构建含野生轮状病毒NSP4基因的穿梭质粒pshuttle-NSP4,与腺病毒骨架质粒pAdeasy经同源重组后在Ad-293细胞中包装获得pAd-NSP4重组腺病毒颗粒。电镜、RT-PCR、免疫荧光等方法鉴定病毒特征及在体外细胞中的表达。肌肉注射及滴鼻方式免疫小鼠,检测小鼠血清抗体效价及其中和保护效果。结果:获得了滴度为108.25CCID50/ml的重组腺病毒pAd-NSP4,免疫荧光检测到特异性目的蛋白的表达。二次免疫后肌肉注射和滴鼻小鼠的ELISA血清平均效价分别为1∶320和1∶1436.8;中和抗体效价1∶45.3和1∶71.8。结论:表达轮状病毒NSP4蛋白的非复制型重组腺病毒颗粒具有良好的免疫原性。滴鼻途径比肌肉注射可更加有效地诱导小鼠的免疫应答。     

Expression and purification of rotavirus proteins NSP5 and NSP6 in Escherichia coli

Rotaviruses are one of the worldwide leading causes of gastroenteritis in children under 5 yr old. The rotavirus nonstructural NSP5 is a phosphoprotein implicated in viroplasms formation, whereas NSP6 could have a possible regulatory role of NSP5. It has been reported that N- and C-termini of NSP5 are important for amount of protein is required for structural analysis, efficient expression systems are required. His-tag fusion at the C-terminus and glutathione-S-transferase (GST)-fusion at the N-terminus were used as expression systems, and conditions for recombinant proteins expression were obtained. His-tag fusion was not efficient to produce NSP5 (2% of total protein), but NSP6 was expressed in higher amounts (11% of total protein). In contrast, GST-NSP5 and GST-NSP6 proteins correspond to 34 and 31% of the total proteins, respectively. GST-fusions seem to have a protective effect against nonstructural rotavirus protein toxicity in Escherichia coli; however, in both systems, NSP5 and NSP6 recombinant proteins were expressed as inclusion bodies. Conditions for solubilization and purification of recombinant proteins were achieved. This is the first report of expression and purification of NSP5 and NSP6 recombinant proteins in suitable amounts for further structural analysis.     

A组人轮状病毒NSP3基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:获得轮状病毒NSP3基因的表达产物及其抗血清。方法:将TB-Chen株轮状病毒NSP3基因插入质粒pETL,构建重组表达质粒pET-NSP3,并转化大肠杆菌BL21(DE3)表达重组蛋白NSP3;用凝胶分离回收的方法纯化该蛋白,免疫豚鼠制备该蛋白的抗血清。结果:构建了重组表达质粒pET-NSP3,并在大肠杆菌中高效表达了重组蛋白NSP3,目的蛋白表达量占菌体总蛋白量的28.6%;有效地纯化了目的蛋白并制备了该蛋白的抗血清,Western印迹表明该抗血清能与重组蛋白NSP3发生特异性免疫反应。结论:通过质粒pETL能高效表达轮状病毒NSP3蛋白,该重组蛋白具有较好的免疫反应性,为进一步研究其结构、功能及免疫学性质奠定了基础。     

轮状病毒肠毒素NSP4:一个多功能糖蛋白

轮状病毒(rotavirus,RV)是在世界范围内造成婴幼儿和幼年动物病毒性腹泻的最主要病原。A组RV的NSP4蛋白被认为是病毒的肠毒素,近年来的研究发现,这个非结构蛋白NSP4在RV致病过程中起着重要的作用。本文简要综述了多功能肠毒素NSP4的研究进展。     

表达轮状病毒nsp4基因重组腺病毒的构建与免疫评价

目的：应用非复制腺病毒表达系统构建表达人轮状病毒非结构蛋白4（NSP4）的重组腺病毒,初步评价其免疫保护效果。方法：构建含野生轮状病毒NSP4基因的穿梭质粒pshuttle-NSP4,与腺病毒骨架质粒pAdeasy经同源重组后在Ad-293细胞中包装获得pAd-NSP4重组腺病毒颗粒。电镜、RT-PCR、免疫荧光等方法鉴定病毒特征及在体外细胞中的表达。肌肉注射及滴鼻方式免疫小鼠,检测小鼠血清抗体效价及其中和保护效果。结果：获得了滴度为10^8.25CCID50/ml的重组腺病毒pAd-NSP4,免疫荧光检测到特异性目的蛋白的表达。二次免疫后肌肉注射和滴鼻小鼠的ELISA血清平均效价分别为1：320 和1：1436.8;中和抗体效价1：45.3和1：71.8。结论：表达轮状病毒NSP4蛋白的非复制型重组腺病毒颗粒具有良好的免疫原性。滴鼻途径比肌肉注射可更加有效地诱导小鼠的免疫应答。     

针对NSP4基因的shRNA抑制牛轮状病毒的体外增殖

本研究根据牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)的NSP4基因序列,设计并构建了shRNA重组慢病毒载体RNAi-H1-89,利用脂质体介导法,将RNAi-H1-89与辅助质粒共转染293细胞,包装shRNA重组慢病毒;重组慢病毒感染MA104细胞24h后继续接种BRV,以针对LacZ基因的shRNA重组慢病毒为对照,48h后与LacZshR-NA对照比较,RNAi-H1-89明显抑制MA104细胞病变;RT-PCR检测结果表明,针对NSP4基因的shRNA可特异性抑制牛轮状病毒NSP4基因表达;病毒滴度测定表明,在转染50%、75%、95%RNAi-H1-89质粒的细胞培养上清液中,病毒滴度分别是对照组的50%、20%和10%。上述实验结果表明,针对NSP4基因的shRNA能高效地沉默NSP4基因,并且能阻断牛轮状病毒增殖。