用半合成方法证明B_(22)-精氨酸不是胰岛素表现活性所必需的

胰岛素六甲酯经胰蛋白酶和羧肽酶B水解,得去B链羧端九肽(B_(22-30))胰岛素五甲酯的两个α-氨基用叔丁氧羰酰(BOC)保护后与X-D—Ala—PheOMe(X=Arg,D-Arg,Gly,Lys或Asp)缩合,去除所有的保护基后得B_(22)改变的去B链羧端六肽胰岛素(D-Ala~B_(22)-DHI)。这些类似物的生物活性表明:Arg~B_(22)能为Lys或Asp代替,这结果说明Arg~B_(22)不是胰岛素活力所必需。但Arg~B_(22)若为D-Arg或Gly代替,活力很低。     

胰岛素结构与功能关系的研究——Ⅳ.B_(22)-精氨酸的改变对胰岛素生物活性的影响

本文叙述了一系列B_(22)-精氨酸改变的B_(23)-D-Ala去B链羧端六肽胰岛素类似物的半合成。半合成途径是胰岛素六甲酯(INS-OMe)经胰蛋白酶和羧肽酶B作用得到去B链羧端九肽胰岛素五甲酯OMe-(DNIOH),A_1和B_1的α-氨基用Boc-基保护后与X-D-Ala·PheOMe(X=Gly,D-Arg,Val,Arg,Boc-Lys和OTB-Asp)缩合,三氟乙酸和皂化去除所有的保护基。这些类似物的生物活力表明;B_(22)-Arg并非不能改变,它用Lys甚至Asp代替后,不影响活力,活力水平约为天然胰岛素的20%。当B_(22)-Arg用Val代替后活力降低一半,而用Gly或D-Arg代替后,活力很低。文中对B_(22)-Arg在维持胰岛素构象和对胰岛素生物活力的影响以及豚鼠胰岛素活力低的原因等问题进行了讨论。     

胰岛素作用原理的研究——Ⅰ.胰岛素及其类似物与其受体的相互作用

研究了一些胰岛素B链羧端肽段改变了的类似物与肝细胞及脂肪细胞的受体蛋白结合性质。这些结果说明,去B链羧端五肽胰岛素与胰岛素有相同的结合能力;去B链羧端六肽胰岛素及B_(23)被D-丙氨酸取代的去B链羧端六肽胰岛素有明显的结合;去B链羧端八肽胰岛素具极微的结合能力;胰岛素A链、促肾上腺皮质素、增血糖素不与胰岛素受体蛋白结合。在此基础上还讨论了B_(24)芳香环参与胰岛素结合部位的可能性,并假设B_(12),B_(16),B_(24),B_(25)疏水平面可能是结合部位的重要内容。而B_(20)～B_(23)U形转折及A_(21)…B_(22)盐键的作用是稳定疏水平面结构。胰岛素与受体的结合类似于胰岛素二体中两个单体的结合。     

胰岛素片段与胰岛素抗体的相互作用

本文研究了若干胰岛素片段及去B链C端八肽胰岛素(DOI)、A链、B链与胰岛素抗体的结合能力。结果表明N 端区域片段保留部分胰岛素的免疫活力,而C 端片段除“工”字肽的免疫活力比A 链略高外,其他片段(B_(26～30),B_(22～26))均和A 链类似,没有胰岛素的免疫活力。以上结果进一步说明在免疫活力方面,胰岛素分子的N 端区域比C 端重要。同样,B 链可能比A 链重要。     

胰岛素片段与胰岛素抗体的相互作用

本文研究了若干胰岛素片段及去B链C端八肽胰岛素(DOI)、A链、B链与胰岛素抗体的结合能力。结果表明N端区域片段保留部分胰岛素的免疫活力,而C端片段除“工”字肽的免疫活力比A链略高外,其他片段(B_(26～30),B_(22～26))均和A链类似,没有胰岛素的免疫活力。以上结果进一步说明在免疫活力方面,胰岛素分子的N端区域比C端重要。同样,B链可能比A链重要。     

胰岛素类似物的内源萤光光谱

为了进一步了解胰岛素构象与功能的关系,测定了不同条件下胰岛素和它的类似物的内源萤光光谱,胰岛素类似物包括去B链羧端五肽胰岛素,去B链羧端七肽胰岛素和去B链羧端八肽胰岛素。它们的发射光谱的峰在306nm,激发光谱峰在277nm。不同pH值,不同浓度的十二烷基硫酸钠和温度变化对胰岛素的荧光光谱的影响和对类似物的影响非常相似。说明这些类似物的环境酪氨酸残基的微环境是相似的。由于去五肽胰岛素有接近于天然胰岛素的生物活力,去七肽胰岛素没有生物活力,因此说明,胰岛素分子的受体结合部位中,B_(24～25)两个苯丙氨酸侧链本身具有重要的地位。并不是因为失去它们后引起胰岛素构象变化而失活的。     

胰岛素类似物的内源萤光光谱

为了进一步了解胰岛素构象与功能的关系,测定了不同条件下胰岛素和它的类似物的内源萤光光谱,胰岛素类似物包括去B链羧端五肽胰岛素,去B链羧端七肽胰岛素和去B链羧端八肽胰岛素。它们的发射光谱的峰在306nm,激发光谱峰在277nm。不同pH值,不同浓度的十二烷基硫酸钠和温度变化对胰岛素的荧光光谱的影响和对类似物的影响非常相似。说明这些类似物的环境酪氨酸残基的微环境是相似的。由于去五肽胰岛素有接近于天然胰岛素的生物活力,去七肽胰岛素没有生物活力,因此说明,胰岛素分子的受体结合部位中,B_(24～25)两个苯丙氨酸侧链本身具有重要的地位。并不是因为失去它们后引起胰岛素构象变化而失活的。     

胰岛素B链N端和C端缩短对其与胰岛素抗体结合力的影响

本文研究了B链N端和C端缩短的若干胰岛素类似物与胰岛素抗体的结合能力。结果表明:去B链C端五肽胰岛素(DPI)分子中B_1-Phe去除后其与胰岛素抗体结合力明显下降,这与去B_1-Phe胰岛素与胰岛素抗体结合力下降的趋势相似;去B链C端六肽胰岛素(DHI)与胰岛素抗体结合力与DPI非常接近,都为胰岛素的70%左右。而去B链C端七肽胰岛素(DHPI)与胰岛素抗体结合力与去B链C端六肽胰岛素(DHI)相比,其结合力下降了一个数量级。说明胰岛素B_1-和B_(24)-Phe残基对组成和维持胰岛素分子的抗原决定簇起着重要作用。去B链九肽胰岛素(DNI)与胰岛素抗体的结合力与去B链C端八肽胰岛索(DOI)及DHPI相似。本文对上述结果进行了讨论。     

去B链羧端七肽(B24～30)胰岛素的制备——羧肽酶-A限制性水解去五肽胰岛素

用羧肽酶-A对去B链羧端五肽胰岛素进行限制性酶解,得到去B链羧端七肽胰岛素,反应条件是pH7.4,0℃,10小时。水解产物经Sephadex G-50柱分离,并经羧端顺序与氨基酸组成分析鉴定。用小白鼠惊厥法测定,这一去七肽胰岛素制剂有4.7%的胰岛素活力。     

反相高效液相层析在胰岛素结构与功能研究中的应用

采用一种简单的“甲醇-水-0.1％三氟醋酸”作为洗脱体系的反相高效液相层析对研究胰岛素结构与功能关系,以及A链和B链相互作用时所用的一些胰岛素衍生物进行了快速、灵敏、准确的分析和鉴定。 胰岛素的S-磺酸型A链和B链只经一次离子交换层析纯化,经鉴定结果表明是均一的。S-硫甲基型A链和B链基本上也是均一的。通过对胰岛素还原产物的分析确定了能保证胰岛素折分完全并对其重组较为有利的还原条件。去B链羧端五肽(B26—30)胰岛素,以及去B链羧端八肽(B23—30)胰岛素能同时与天然胰岛素清楚地分离。一级结构差别极小的猪胰岛素和牛胰岛素也可得到分辨。胰岛素的羧端缩短的B链和A链重组的定量分析表明B链羧端肽段不但对胰岛素分子的生物活力的体现,而且在A链和B链的正确重组中都起着重要的作用。     

去B链羧端九肽胰岛素的制备和性质

去B链C端八肽胰岛素(DOI)经羧肽酶B作用除去B_(22)-精氨酸,产物经SP-SephadexC25分离以后得到电泳均一的去B链C端九肽胰岛素(DNI)。从CD光谱可以看出,在水溶液中DNI的构象比DOI更松散。DNI与人胎盘细胞膜胰岛素受体的结合能力很低,但却比DOI高一些。     

B27K—去B链C端三肽胰岛素的制备、生物活力与自聚合性质

液相合成五肽Gly Phe Phe Tyr Lys(Boc)Obut,与B链C端去八肽胰岛素酶促缩合得到B2 7K 去B链C端三肽胰岛素(B2 7K DTrI,B2 7K destripeptideinsulin)。用小鼠惊厥法和小鼠降血糖法测得B2 7K DTrI的整体生物活力为标准胰岛素的 80 % ,B2 7K DTrI与人胎盘细胞膜胰岛素受体结合能力为标准胰岛素的 ( 12 5± 13 ) %。用凝胶过滤法证明B2 7K DTrI自聚合性质降低 ,具有与去B链C端五肽胰岛素相同的单体性质。在B2 7K DtrI结构中 ,B2 7T被K取代 ,其优点是在酵母中表达其前体后 ,可以很方便地通过胰蛋白酶水解获得     

胰岛素类似物的直线聚合

与胰岛素相似,去B链羧端五肽胰岛素(DPI)及去B链羧端八肽胰岛素(DOI)的酸性溶液于沸水浴中加热,会转变成粘度很高的溶液,该溶液具有流动双折射性质。于电子显微镜下观察,看到该两种类似物的纤维。这些纤维与胰岛素纤维相似,经常由几根微丝绞合成螺旋状。微丝的直径大约是30,与胰岛素微丝的直径相当。上述现象说明,这些类似物的直线聚合过程与胰岛素者是类同的。因此胰岛素B链羧端肽段并非胰岛素直线聚合所必须。     

胰岛素类似物的直线聚合

与胰岛素相似,去B 链羧端五肽胰岛素(DPI)及去B 链羧端八肽胰岛素(DOI)的酸性溶液于沸水浴中加热,会转变成粘度很高的溶液,该溶液具有流动双折射性质。于电子显微镜下观察,看到该两种类似物的纤维。这些纤维与胰岛素纤维相似,经常由几根微丝绞合成螺旋状。微丝的直径大约是30(?),与胰岛素微丝的直径相当。上述现象说明,这些类似物的直线聚合过程与胰岛素者是类同的。因此胰岛素B 链羧端肽段并非胰岛素直线聚合所必须。     

[B10,22-Asp,B25-Tyr-NH2]-去β链C端五肽胰岛素的合成和性质

本文报道了[B10,22-Asp,B25-Tyr-NH2]-去B链羧端五肽胰岛素的制备及其生物活性。结果表明,这一类似物的生物活力比去五肽胰岛素(DPI)的活力高一倍,但却比Gerald所报道的[B10-Asp,B25-Tyr-NH_2]-DPI的活力低很多,说明后者的高活性可能依赖于分子中B22-Arg的存在。     

去B链C端五肽胰岛素类似物的制备和性质

A_1B_(29)-(MSC)_2胰岛素经胃蛋白酶限制性地水解得A_1-(MSC)-DPI。通过Edman降解方法,从A_1-(MSC)-DPI制备了B链N端缩短的DPI类似物,即:去B_1(Phe)-DPI,去B_(1-2)(Phe Val)-DPI和去B_(1-3)(Phe Val Asn)-DPI。本文还叙述了它们的生物活力。     

胰岛素分子中的非螺旋氢键

以差值傅里叶技术对同晶置换途径测定的胰岛素结构进行精化后,用蛋白质分子内环境分析程序考查了胰岛素分子的非螺旋氢键。结果表明,几乎所有非螺旋氢键都集中分布在B链N端(B4—B6)和C端(B20—B26)伸展肽段,A链两段螺旋间的4肽(A9—A12)和C端5肽(A17—A21),及其之间。它们包括,A链和B链自身形成的氢键3对,A链与B链之间的氢键5对,侧链与主链间的氢键5对,以及分子间的氢键4对。它们对于胰岛素分子精细构象的形成和稳定,特别对于B链C端(B20—B26)肽段的特征折迭和A—B链的正确三维相关,具有重要作用。运用非螺旋氢键分析的结果,讨论了它们在蛋白质结构中可能的一般性作用,以及胰岛素C端和N端一系列修饰物结构-功能研究的结果,提出了胰岛素分子的二聚化及胰岛素原的C肽可能对分子的特征三维折迭具有保护性作用的看法。     

胰岛素分子中的非螺旋氢键

以差值傅里叶技术对同晶置换途径测定的胰岛素结构进行精化后,用蛋白质分子内环境分析程序考查了胰岛素分子的非螺旋氢键。结果表明,几乎所有非螺旋氢键都集中分布在B链N端(B4～B6)和C端(B20—B26)伸展肽段,A链两段螺旋间的4肽(A9—A12)和C端5肽(A17—A21),及其之间。它们包括,A链和B链自身形成的氢键3对,A链与B链之间的氢键5对,侧链与主链间的氢键5对,以及分子间的氢键4对。它们对于胰岛素分子精细构象的形成和稳定,特别对于B链C端(B20—B26)肽段的特征折迭和A—B链的正确三维相关,具有重要作用。运用非螺旋氢键分析的结果,讨论了它们在蛋白质结构中可能的一般性作用,以及胰岛素C端和N端一系列修饰物结构-功能研究的结果,提出了胰岛素分子的二聚化及胰岛素原的C肽可能对分子的特征三维折迭具有保护性作用的看法。     

去B链羧端七肽人胰岛素的分离纯化及性质研究

在大肠杆菌温度诱导体系中以非融合方式进行去Ｂ链羧端七肽人胰岛素原基因的表达,获得去Ｂ链羧端七肽人胰岛素原,表达产物占细胞总蛋白量的１３％,表达产物经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０柱层析分离及胰蛋白酶和羧肽酶Ｂ的酶促转化等步骤,可得到纯度达９４％以上的去Ｂ链羧端七肽人胰岛素,其氨基酸组成与预期值相符,受体活性是标准猪胰岛素的１％．     

去B链羧端七肽胰岛素的免疫活性及受体结合能力

测定了胰岛素类似物去B 链羧端七肽胰岛素(DHPI)的免疫活性和它与受体的结合能力。DHPI 能与豚鼠抗胰岛素血清反应,生成免疫沉淀条纹。经放射免疫测定,它的免疫活力是胰岛素的1.8%。DHPI 在低剂量时不能和胰岛素受体(大白鼠脂肪细胞和豚鼠红细胞)结合,高剂量时有明显结合。DHPI 与豚鼠红细胞胰岛素受体的结合不显示负协同效应,而胰岛素与它的结合显示负协同效应。