山梨醇脱氢酶的克隆、表达及活性检测

目的:从氧化葡糖杆菌H24中克隆山梨醇脱氢酶基因进行表达并检测其活性。方法:以氧化葡糖杆菌H24基因组DNA为模板,PCR扩增包括启动子、结构基因及其后的终止序列在内的山梨醇脱氢酶基因;将PCR产物插入pMD18T载体,转化大肠杆菌DH5α;通过活性电泳检测山梨醇脱氢酶在大肠杆菌中的表达及活性。结果:从氧化葡糖杆菌H24中扩增得到山梨醇脱氢酶基因并在大肠杆菌中实现表达,重组菌株经活性电泳检测具有醇糖转化活性。结论:原核表达的山梨醇脱氢酶具有很强的醇糖转化活性。     

麦红吸浆虫幼虫不同滞育时期体内山梨醇含量及山梨醇脱氢酶基因表达水平变化

【目的】本研究旨在明确麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana(Géhin)滞育进程中山梨醇含量及山梨醇脱氢酶基因(SmSDH)mRNA表达水平的变化规律,探讨麦红吸浆虫滞育与山梨醇含量及SmSDH表达水平的关系。【方法】分别采用比色法和实时荧光定量PCR方法,对2013年5月-2014年3月不同时间陕西杨凌养虫圃内麦红吸浆虫滞育前后及滞育期幼虫体内山梨醇含量及SmSDH2a和SmSDH2b mRNA表达水平进行分析。【结果】麦红吸浆虫幼虫滞育前山梨醇含量最高(为9.41μg/mg);滞育期间,12月份含量最高(为8.50μg/mg);滞育解除后山梨醇含量为3.25~3.49μg/mg,显著低于滞育前和整个滞育期(P0.05)。山梨醇脱氢酶基因SmSDH2a及SmSDH2b在滞育进程中mRNA表达水平变化趋势相同,且与滞育强度递减趋势一致,即进入滞育后表达水平显著降低(P0.05)并一直稳定在较低水平,滞育解除后逐渐升高并达到最高。滞育期间,同期不同滞育状态幼虫之间山梨醇含量和SmSDH2a表达水平差异不明显,但裸露幼虫SmSDH2b表达水平始终高于结茧幼虫。【结论】山梨醇和SmSDH参与麦红吸浆虫滞育调控,与滞育维持和解除密切相关。     

家蚕滞育关联山梨醇脱氢酶基因的启动子活性分析

【目的】明确家蚕Bombyx mori滞育关联基因山梨醇脱氢酶基因BmSDH(BmSDH-1,BmSDH-2a和BmSDH-2b)的转录特性。【方法】用5'RACE技术确定家蚕3个BmSDH基因的转录起始位点。利用PCR技术克隆3个BmSDH基因约1 kb及BmSDH-2a不同长度的启动子区序列,分别构建带有萤火虫荧光素酶报告基因的载体pGL3-BmSDH-P-luc,并与pRL-CMV报告质粒(含海肾荧光素酶报告基因)共转染家蚕BmN细胞,通过双荧光素酶检测系统检测BmSDH基因启动子活性;分别在BmN细胞培养基中添加昆虫保幼激素、蜕皮激素和滞育激素,通过双荧光素酶检测系统检测不同浓度激素处理对BmSDH-2a基因启动子活性的影响。【结果】BmSDH-1的转录起始位点为A(-41),BmSDH-2a的转录起始位点为C(-41),BmSDH-2b的转录起始位点为A(-40)(翻译起始位点为+1)。双荧光素酶检测结果表明,BmSDH-2a启动子活性极显著高于BmSDH-1和BmSDH-2b启动子,BmSDH-2a 355 bp长度片段的启动子活性极显著高于674 bp和1 117 bp长度片段。用不同浓度滞育激素处理BmN细胞后,BmSDH-2a的1 117 bp启动子活性随着滞育激素浓度的升高有上升的趋势,当浓度高于100 ng/mL时启动子活性有所降低但仍保持在较高水平;用保幼激素进行处理后,随着激素浓度的升高启动子活性逐渐降低;蜕皮激素处理后,0.1 ng/mL激素显著增强启动子活性,当激素浓度继续升高启动子活性逐渐降低。【结论】确定了BmSDH基因的转录起始位点。BmSDH-2a启动子活性显著高于BmSDH-1和BmSDH-2b启动子,一定浓度的蜕皮激素能显著提高BmSDH-2a启动子活性。研究结果有助于阐明BmSDH基因在家蚕滞育中的功能。     

酮古龙酸菌山梨醇脱氢酶的原核表达及活性检测

目的：克隆酮古龙酸菌Y25的山梨醇脱氢酶基因sldh,在大肠杆菌中进行表达并检测表达产物的活性。方法：以酮古龙酸菌Y25基因组DNA为模板,PCR扩增sldh基因,连接到表达载体pTIG,转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达;取表达菌体、菌体裂解上清和沉淀进行SDS-PAGE分析;以山梨醇为底物,通过活性电泳、体外转化及休止细胞转化进行sldh基因表达产物的活性检测。结果：扩增得到1740 bp的山梨醇脱氢酶基因,构建了表达质粒pTIG-sldh并在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE结果显示表达产物为可溶性形式,相对分子质量约58×10^3;活性电泳结果说明表达产物在以山梨醇为底物时表现出脱氢酶活性,而经体外转化和休止细胞转化后薄层层析检测出转化产物山梨糖的存在。结论：在大肠杆菌中实现了酮古龙酸菌山梨醇脱氢酶的可溶性表达,且表达的重组脱氢酶能将山梨醇脱氢生成山梨糖。     

苹果6-磷酸山梨醇脱氢酶基因启动子逆境诱导表达特性研究

为研究6-磷酸山梨醇脱氢酶(sorbitol-6-phosphate dehydrogenase,S6PDH)基因启动子(S6PDHp)的逆境诱导表达特性,利用Gateway技术构建了S6PDH基因启动子区5'端系列缺失体与GUS基因的融合表达载体,并通过农杆菌介导法转化拟南芥。对转基因拟南芥进行低温和外源ABA处理,通过GUS蛋白活性变化分析S6PDHp的逆境诱导表达特性。研究结果发现,通过Gateway技术构建了4个S6PDHp 5'端系列缺失体与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的融合表达载体(pGWB433-S6PDHp1、pGWB433-S6PDHp2、pGWB433-S6PDHp3和p GWB433-S6PDHp4)并获得了相应的转基因拟南芥。对转基因植株进行低温处理后发现,p GWB433-S6PDHp3转基因植株中的GUS活性增幅最大,达到显著水平,而其他转基因植株中的GUS活性基本保持不变。外源ABA处理后发现,除p GWB433-S6PDHp4外,其余启动子缺失体转基因拟南芥中GUS活性显著升高。以上结果表明,低温和外源ABA能够诱导S6PDHp的表达,但不同的缺失体响应程度不同,意味着在S6PDHp序列(-2 396bp至-236bp)中可能存在着响应逆境胁迫的正负调控顺式作用元件。     

小白鼠心、肝、骨骼肌组织中琥珀酸脱氢酶活性的研究

通过对小白鼠采取断头、脱颈椎、打扑不同的处死方法,研究心、肝、骨骼肌不同组织中琥珀酸脱氢酶(SDH)活性的大小.结果发现,3种不同的处死方法中,心、肝、骨骼肌SDH的活性大小依次为心＞肝＞肌;在三者的混合组织中SDH的活性大小依次为打扑＞断头＞脱颈椎处死法.因而得出结论,不同的处死方法对心、肝、骨骼肌组织中SDH的活性大小没有明显影响;在混合组织中以打扑处死法SDH的活性最强.     

绵羊ghrelin基因表达的组织分布和发育性变化

选取2、30、60、90和120日龄的雄性哈萨克羊和新疆细毛羊各6只（无120日龄的哈萨克羊）,测体重后屠宰,采下丘脑、垂体、心脏、肝脏、瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、背最长肌,用RT-PCR和荧光实时定量PCR法检测ghrelin基因表达的组织分布,及其在皱胃中的发育性变化。研究结果表明：（1）品种内各生长时期的体重差异显著（P〈0．05）。雄性哈萨克羊和新疆细毛羊的体重在2日龄时无显著差异（P〉0．05）,30～90日龄间,前者的体重极显著高于后者（P〈0．01）;（2）所检测的各组织中都有ghrelin mRNA分布,但主要在皱胃中表达,其表达量远高于其他组织（P＜0．05）;（3）两品种绵羊皱胃ghrelin基因表达的发育性变化模式基本相似,都随着日龄的增加而呈上升趋势,其中雄性哈萨克羊的表达量在2～60日龄间持续上升,60日龄后趋于水平;雄性新疆细毛羊的表达量在2～90日龄间持续上升,90日龄后趋于水平。研究还发现雄性哈萨克羊皱胃胂relin基因的表达量在2～90日龄间极显著高于新疆细毛羊（P＜0．01）。     

凋亡蛋白的基因表达、纯化和体外活性

来源于鸡贫血病毒的小分子蛋白质凋亡蛋白（apoptin）能够选择性诱导肿瘤细胞凋亡,原核表达的凋亡蛋白是否具有体内的凋亡活性,对于用无细胞体系研究凋亡蛋白诱导肿瘤细胞凋亡机制和今后更好地开发凋亡素的临床应用具有重要意义。据此,采用原核表达载体pBV220和 pPROEXHT进行了凋亡蛋白的原核表达和纯化复性研究,体外证明了凋亡蛋白的凋亡诱导活性,并揭示原核表达的凋亡蛋白即使没有细胞质的参与,仍具有诱导细胞核凋亡的活性。     

贮藏蛋白的基因表达和调控

种子贮藏蛋白质是一类多聚蛋白质,由多基因家族编码。贮藏蛋白基因内部和周围具有高度保守的调节序列。其基因表达具有组织特异性,受植物发育过程、植物激素(ABA和细胞分裂素)和营养成分的调节控制。     

种子贮藏蛋白的运输、积累和基因表达调控

种子中贮藏蛋白的运输和积累途径主要有：(1)蛋白质合成后经内膜系统转移到蛋白质贮藏液泡(PSV)中积累;(2)合成的蛋白质直接在粗糙内质网的膜囊中积累形成蛋白质体;(3)贮藏蛋白不经高尔基体的加工由粗糙内质网上合成后直接运输到PSV中积累。贮藏蛋白基因的表达受该基因的顺式作用元件和反式作用因子的共同调控,此外染色体的结构也影响贮藏蛋白基因的表达。     

Runx2参与调控Osterix 启动子活性及其基因表达

尽管Runx2和Osterix都是成骨细胞分化途径中关键的转录因子,但是Runx2是否能够调控Osterix,还不为所知.研究发现,在非成骨细胞系,无论是间充质干细胞还是已分化的细胞,以及成骨细胞系中,Runx2都能诱导Osterix的表达.同时Runx2能够上调3.2kb人的Osterix基因启动子活性.进一步实验证明,在这一段启动子中存在Runx2功能性的结合位点.因而,实验结果有力地支持了这样一个假设,即Runx2参与了Osterix基因的表达调控.瞬时转染和荧光素酶双报告分析结果显示,在非成骨细胞中,Osterix明显上调2.3kb的Ⅰ型胶原蛋白启动子活性,但Runx2却不能.这样的差别暗示,在成骨细胞分化过程中位于Runx2下游的转录因子Osterix是刺激Ⅰ型胶原蛋白基因表达所必需的.     

镧、铈对谷丙转氨酶和谷氨酸脱氢酶活性的影响

镧、铈对谷丙转氨酶和谷氨酸脱氢酶活性的影响吴兆明王全球（中国科学院植物研究所,北京１０００９３）高小霞许荣（北京大学化学系,北京１００８７１）ＥＦＦＥＣＴＯＦＬＡＮＴＨＡＮＵＭＡＮＤＣＥＲＩＵＭＯＮＴＨＥＡＣＴＩＶＩＴＹＯＦＧＬＵＴＡＭＩＣＰＹＲ...     

植物抗冻蛋白和抗寒基因表达的调控

综述了植物抗冻蛋白及抗寒基因表达调控的最新研究进展,并就此领域存在的问题作了展望.     

丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因表达载体的构建

以运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的总DNA为模板,PCR扩增运动发酵单胞菌中的丙酮酸脱羧酶( Pyruvate decarboxylase,PDC)基因和乙醇脱氢酶Ⅱ(Alcohol dehydrogenaseⅡ,ADHⅡ)基因.将丙酮酸脱羧酶基因和含核糖体结合位点(RBS)的乙醇脱氢酶基因串联起来置于T7启动子控制下,构成多顺反子表达质粒pQR-PRA.经酶切和PCR验证,表达载体构建成功.将pQR-PRA转入大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21中,转化子的定性检测表明有酶表达,并且初步测定了2种酶的表达量.     

原核基因表达的调控

大部份原核基因在其天然宿主的染色体中是单拷贝的,但这些基因的产物在细胞中的分子数可由10到10~6个不等。表1列举了一些大肠杆菌基因产物在细胞中的分子数。每个基因产物的多少是基因表达与各级产物代谢之间平衡的结果,与转录起始频率,转录后加工、mRNA代谢、翻译起始频率、肽链延伸速度、翻译后加工、蛋白质的分泌和代谢等有关。这些过程的调控在很大程度上取决于基因本身的结构。     

昆虫基因表达的调控

昆虫的基因表达过程十分复杂,受多种调控因子的调节,随着分子生物学研究新技术在昆虫学上的应用,昆虫基因表达的调控也取得了较快进展,本文以一些特征清楚的系统为例,讨论昆虫基因表达调控的研究现状,旨在为其它昆虫表达的调控研究提供借鉴。     

Rb、P53调控平滑肌细胞c-fos和c-jun基因表达

为研究外源性Rb和P53基因导入血管平滑肌细胞后对c-fos和c-jun基因表达的调控作用,将Rb基因或P53基因重组腺病毒载体转染人脐动脉血管平滑肌细胞,应用RT-PCR和免疫组化法检测c-fos、c-jun的mRNA及蛋白质表达水平,以DNA琼脂糖凝胶电泳和β-半乳糖苷酶染色分别观察细胞凋亡和细胞衰老.结果显示,野生型P53基因导入可诱导平滑肌细胞凋亡,c-fos和c-jun mRNA及蛋白质表达水平显著增高.外源性Rb基因导入能促进细胞衰老,下调c-fos基因表达,但对c-jun基因表达没有明显影响.     

菠萝叶片中有机酸含量、转氨酶和脱氢酶活性的昼夜变化

研究了菠萝叶片中苹果酸、柠檬酸、草酰乙酸、α－酮戊二酸和草酸等有机酸和转氨酶、脱氢酶活性的昼夜变化。结果表明,除了草酸外,其他４种有机酸的含量都呈白天降低晚上增高的趋势。有机酸的含量在上午９∶００时有最高值,下午１８∶００时有最低值。苹果酸、柠檬酸、草酰乙酸、α－酮戊二酸和草酸的昼夜最大差值分别为１４０、６１、３１．８、８．２和６．７ｍｍｏｌ·ｋｇ－１ＦＷ。异柠檬酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶活性的昼夜变化与有机酸的趋势一致,白天降低晚上增高。可溶性蛋白和游离氨基酸含量以及谷草转氨酸、谷丙转氨酶活性在下午１８∶００时有最高值,凝胶电泳显示菠萝叶片中有新的蛋白带出现。     

丙酮酸脱氢酶活性调控在线粒体代谢与生长平衡中的作用

丙酮酸脱氢酶多酶复合体(PDC)催化丙酮酸生成乙酰辅酶 A(acetyl-CoA)的反应是线粒体代谢与生长的调控枢纽.丙酮酸脱氢酶激酶 (PDK)/丙酮酸脱氢酶磷酸酶(PDP)对丙酮酸脱氢酶(PDH)的磷酸化 /脱磷酸化作用以及丙酮酸/乙酰辅酶A对PDH底物产物水平的调控是线粒体适应不同生理环境的代谢调节方式,而调控 PDK基因转录的上游信号恰好也是线粒体生长或生物发生的调控机制.过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPAR)/过氧化物酶体增殖物激活受体g共激活因子-1(PGC-1) 信号通路可能是线粒体代谢与生长在基因转录水平的共同调控通路.线粒体代谢与生长经共同通路调节可维持线粒体功能与结构之间的平衡.