野生型和突变型荞麦蛋白酶抑制剂的活性比较及抗肿瘤功能分析

运用定点突变技术研究重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)的作用位点,先后构建了R45A-aBTI 和R45F-fBTI 两个突变体．抑制活性测定显示,aBTI 和fBTI 均丧失了胰蛋白酶抑制活性,却分别增加了对弹性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制活性,确定Arg⁴⁵为野生型rBTI 的作用位点．稳定性分析表明,rBTI、aBTI 和fBTI 均具有很高的热稳定性及酸碱稳定性．采用MTT 比色法分别检测野生型和突变型抑制剂对肿瘤细胞生长的抑制作用．结果表明,突变前后的3种抑制剂对HL-60 和EC9706 细胞的生长均显示出很强的抑制作用,并且具有明显的浓度依赖性和时间依赖性．通过研究不仅确定了rBTI 的作用位点,而且获得了两种新型蛋白酶抑制剂,且作用位点的改变并不影响其对肿瘤细胞的生长抑制作用．为进一步研究胰蛋白酶抑制剂的结构与功能的关系以及抗肿瘤药物的研制提供了新的思路．     

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对人肝癌细胞的凋亡及半胱氨酸天冬酶活性的影响

先前的研究表明,基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂 (rBTI) 具有诱导不同肿瘤细胞凋亡的作用.为了揭示其诱导肿瘤细胞凋亡的可能机理,从基因水平上探讨与凋亡有关的分子事件,本研究用不同浓度的 rBTI 体外作用于人肝癌细胞 HepG2 后,采用 MTT 比色法检测抑制剂对epG2 细胞的抑制率,用 DNA 凝胶电泳和细胞核的形态学观察检测 HepG2 细胞的凋亡.结果表明,rBTI 在体外能够明显抑制 HepG2 细胞的增长,并诱导细胞凋亡.另外,细胞凋亡与Bcl-2/Bax mRNA 水平有关.通过 RT-PCR 检测发现,细胞经过rBTI处理后,抗凋亡基因Bcl-2 mRNA 水平下调,促凋亡基因 Bax mRNA 有所上调,而对照 GAPDH 无变化.对 HepG2细胞中 Fas/Fas 配体及半胱氨酸天冬酶（caspase）的研究证明,细胞经过 rBTI 处理后,对死亡受体 Fas mRNA没有影响; rBTI 可明显激活caspase-3 和 caspase-9 酶活性, 对caspase-8 活性几乎无影响.上述结果表明,rBTI 对HepG2 细胞具有明显的诱导凋亡作用,其诱导细胞凋亡的机制与 caspase-3 依赖性凋亡调节信号通路有关,未涉及 Fas/Fas 配体途径.     

Potato I型蛋白酶抑制剂 rBTI及其突变体的表达、纯化和活性研究

荞麦胰蛋白酶抑制剂(BTI)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂Potato I家族,典型构象中有1段暴露在分子外侧的结合区,该区内P1′、P2、P6′与P8′位的氨基酸残基具有高度保守性.本文依据近期解析的rBTI晶体结构以及rBTI与胰蛋白酶复合物晶体结构信息,对rBTI 中的P2和P8′位氨基酸进行突变,构建了pExSecI- Bti-P44T 和 pExSecI-Bti-W53R 重组质粒,转入大肠杆菌 BL21（DE3）中进行表达,通过Resource Q阴离子交换层析和Superdex G 75 HR 10/300凝胶柱进行分离纯化后,测定了rBTI及其突变体对胰蛋白酶的抑制常数,以及它们对HepG2 细胞内的蛋白酶体和细胞增殖的抑制作用. 实验结果显示,rBTI 的44和53位分别突变为 Thr和Arg后,Ki 分别为2.91×10-9mol/L和2.97 ×10-7mol /L,前者较rBTI（Ki = 3.56×10-8 mol/L）降低1个数量级,而后者较rBTI升高1个数量 级.功能分析显示,rBTI及2种突变体对HepG2细胞内的蛋白酶体基本没有抑制作 用,但是它们都保留了对HepG2细胞增殖的抑制活性.这些结果揭示,作为一种特异的胰蛋白酶抑制剂,rBTI分子中的保守区域氨基酸残基虽然对胰蛋白酶的抑制作用有显著影响,但并不影响其抑制肿瘤细胞的增殖,仍能发挥其原有的生物学功能.     

rBTI联合紫杉醇通过激活NFκB/p65促进MCF-7细胞凋亡

rBTI、紫杉醇均有抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡等作用,但两者联合用药对肿瘤细胞的影响尚不明确.本文通过MTT比色法检测rBTI与紫杉醇联合作用对MCF-7细胞增殖的影响;采用流式细胞术分析,对MCF-7细胞凋亡以及ROS水平进行检测;利用qRT-PCR和Western印迹方法,检测rBTI与紫杉醇联合作用后凋亡因子表达情况.结果表明,rBTI(2.5μmol/L)与紫杉醇(0.05~0.5μmol/L)联合作用于MCF-7细胞后,能显著抑制其增殖.将rBTI与紫杉醇进行联合协同用药,诱导了MCF-7细胞凋亡及ROS的产生;同时与rBTI单独作用时相比,联合作用明显上调了p53、Bax的表达,促进了IκBα蛋白的磷酸化以及NFκB/p65的核转位;与rBTI组和紫杉醇单独作用组相比,两者联合用药明显下调了Bcl-2和CyclinD1的表达.本研究证实,rBTI联合紫杉醇通过诱导ROS的产生,激活NFκB/p65信号转导途径,协同促进MCF-7细胞的凋亡.     

荞麦rBTI-2的表达及其对肿瘤细胞的生长抑制作用

设计一种适合基因工程开发的无标签重组荞麦胰蛋白酶抑制剂rBTI-2,并研究其对肿瘤细胞的生长抑制作用。构建原核表达载体pExSecI-BTI-2,诱导表达获得可溶性目的蛋白,经Resource~(TM) Q纯化后作用于HL-7702、HepG2、EC9706和QBC-939细胞,MTT检测rBTI-2对其生长的影响,并与前期获得的几种融合蛋白酶抑制剂进行功能比对。结果表明:质粒pEXSecI-BTI-2构建成功,SDS-PAGE分析表明分子量约为7.8 kDa。MTT检测表明rBTI-2对几种肿瘤细胞的生长有明显的抑制作用,而对正常细胞HL-7702作用很小。几种蛋白酶抑制剂对肿瘤细胞的生长均有不同程度的影响,其中rBTI-2对肿瘤细胞的生长抑制作用要大于融合蛋白酶抑制剂rBTI,这为深入研究BTI诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制及其应用开发提供了重要基础和研究依据。     

rBTI及其突变体对C. elegans寿命的影响

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂（recombinant buckwheat trypsin inhibitor,rBTI）是一种来源于荞麦Potato Ⅰ抑制剂家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂,具有很好的生物活性及功能。先前的研究表明,rBTI在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中具有很好的延长寿命的性质,但其具体的作用机制还不太清楚。本文的研究证明,rBTI能够调节转录因子DAF-16的转录活性,进而影响线虫的寿命,且该性质与其胰蛋白酶抑制活性密切相关。通过定点突变技术,分别对rBTI的45位、53位和44位氨基酸活性位点进行突变,获得了4种不同胰蛋白酶抑制活性的rBTI突变体,分别命名为rBTI-R45A,rBTI-R45F,rBTI-W53R和rBTI-P44T。经典模式生物秀丽隐杆线虫寿命检测实验显示,野生型rBTI可以明显延长C.elegans的寿命,且在0～10 μmol/L 范围内具有浓度依赖性。和未处理对照组相比,10 μmol/L 野生型rBTI延长寿命幅度可达到14.5%,但是突变体rBTI-R45A,rBTI-R45F和rBTI W53R均不同程度失去了延长寿命的功能。利用荧光显微观察及qRT-PCR等方法进一步研究发现,野生型rBTI 可增强寿命调控转录因子DAF-16的转录活性。与寿命检测实验结果一致,4种 rBTI突变体均不能使DAF-16转录活性增强。上述结果表明,在C.elegans中,rBTI可增强长寿因子DAF 16的转录活性,进而延长虫体寿命,且该功能的发挥依赖于其适当的胰蛋白酶抑制活性。本文的结果为进一步研究开发rBTI的功能提供了实验支持和理论基础。     

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂通过下调己糖激酶Ⅱ抑制HepG2细胞生长

糖酵解过度活跃是肿瘤细胞能量代谢的显著特征。抑制过度糖酵解已经成为一种新的癌症疗法。重组荞麦胰蛋白酶抑制剂 (recombinant buckwheat trypsin inhibitor, rBTI)可以通过上调磷酸酶及张力蛋白同源基因 (PTEN) 进而抑制HepG2细胞增殖。有关rBTI对肿瘤细胞能量代谢的影响仍未见报道。本研究中的MTT和ATP检测分析表明,rBTI以剂量依赖性方式抑制细胞活力及胞内ATP含量。qRT-PCR和Western印迹分析表明,rBTI处理HepG2细胞后,己糖激酶Ⅱ转录显著下调,但是糖酵解过程中的其他酶及葡萄糖转运蛋白基因在转录水平未发生显著变化,同时己糖激酶Ⅱ蛋白水平的表达也显著下调。酶活性分析也表明,rBTI能显著降低己糖激酶的活性。进一步分析表明, rBTI使细胞内PTEN转录及表达水平明显上调,己糖激酶Ⅱ转录和p-AKT,p-mTOR、己糖激酶Ⅱ的表达下调。当PTEN抑制剂phen存在时,可阻断rBTI诱导的己糖激酶 Ⅱ表达下降,表明rBTI能通过上调PTEN进而影响己糖激酶Ⅱ的表达。免疫荧光及Western印迹分析显示,rBTI作用后减弱了己糖激酶 Ⅱ在线粒体的定位,导致己糖激酶Ⅱ与线粒体电压依赖性阴离子通道蛋白 (voltage-dependent anion channel, VDAC) 分离,促使己糖激酶Ⅱ从线粒体转位到细胞质,降低糖酵解的效率。上述结果证明,rBTI对肿瘤细胞能量代谢的调控作用主要通过抑制PI3K/AKT信号通路,下调己糖激酶Ⅱ的表达并影响空间定位,进而抑制肿瘤细胞糖酵解过程,导致癌细胞生长受到抑制。     

藤黄新酸抑制肝癌细胞生长的机制研究

在肿瘤细胞中蛋白酶体活性的抑制可以导致细胞凋亡和周期阻滞.藤黄新酸(TH2)是从中药藤黄中提取的一个新的(口山)酮类衍生物.研究结果显示,TH2可以抑制人肝癌Bel-7402细胞的增殖,诱导细胞产生凋亡,且呈浓度和时间依赖性.同时,10μmol/L的TH2与细胞作用24h后,可以导致早期凋亡标志性蛋白PARP发生裂解.在体外采用特异性荧光底物检测TH2对蛋白酶体活性的影响,发现该化合物能够抑制蛋白酶体的糜乳蛋白酶样、胰蛋白酶样活性和谷氨酰后水解活性.抑癌基因p53是细胞内的蛋白酶体降解底物,TH2可使p53蛋白的降解受到阻滞,表达增加.由此可见,TH2具有抑制人肝癌Bel-7402细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用,可能的分子机制与其抑制细胞内蛋白酶体活性、导致p53蛋白降解受阻有关.     

截短型rBTI的表达、纯化及其对EC9706细胞生长的抑制作用

依据先前获得的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂（rBTI）氨基酸序列及三维分子构像,分别构建了rBTI C末端缺失VVM、TPVVM或VDTPVVM的截短型pExsecI BTI t1,pExsecI BTI t2和pExsecI BTI t3重组质粒.转入大肠杆菌BL21中进行表达,并通过Resource Q阴离子交换层析分离.实验结果显示,3个工程菌均以可溶方式表达,目的蛋白在SDS PAGE图谱中显示单一条带,其纯度达98％以上. 理化性质分析表明,截短型rBTI与野生型rBTI具有相似的胰蛋白酶抑制活性,并具有很好的热稳定性及酸碱稳定性. 将野生型和截短型rBTI分别作用于人食管癌EC9706细胞.MTT检测发现,C末端截短不同数目的氨基酸后,与野生型rBTI相比,在相同浓度下截短型rBTI仍具有一定的抑制肿瘤细胞生长作用,其抑制作用范围是截短前的50%左右. 这些结果提示, rBTI的 C末端氨基酸残基缺失未引起活性区域或功能部位的较大改变,从而保留了其对胰蛋白酶的抑制作用和部分生物学功能.     

MAPKs介导NMDA诱导的大鼠皮层神经元凋亡(英文)

NMDA诱导兴奋毒造成的神经损伤,包括细胞的凋亡和坏死。本研究旨在探讨神经元凋亡在NMDA兴奋毒所致大鼠皮层神经元死亡中的所占比例,并分析了NMDA致神经元凋亡的信号通路机制。通过使用Caspase抑制剂和测定乳酸脱氢酶活性,研究NMDA(100μmol/L,2h)兴奋毒所致的神经元凋亡;并使用MAPKs选择性抑制剂,分别采用Caspase-3活性检测,TUNEL和Annexin V染色方法,进一步观察MAPKs通路中细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun N-末端激酶(JNK)和p38 MAPK三条不同途径在NMDA所致神经元凋亡中的作用。结果显示:(1)Caspase依赖的凋亡占NMDA所致细胞死亡总数的22.49%;(2)p38 MAPK抑制剂SB203580(10μmol/L)使NMDA诱导的caspase-3活性降低30.43%(P0.05);而ERK抑制剂PD98059(20μmol/L)和JNK抑制剂SP600125(20 μmol/L)不影响caspase-3的活性;(3)SB203580(10μmol/L)使NMDA所致的TUNEL阳性细胞数减少33.10%(P0.05);而PD98059(20μmol/L)或SP600125(20μmol/L)都没有作用;(4)Annexin V染色结果显示,SB203580(10μmol/L)使NMDA所致的早期凋亡细胞减少55.56%(P0.05);SP600125(20μmol/L)使NMDA所致的晚期凋亡/死亡细胞减少67.59%(P0.05);PD98059(20μmol/L)对细胞凋亡/死亡没有明显作用。以上结果表明,NMDA介导的大鼠皮层神经元死亡除坏死外,还包含有一小部分神经元凋亡;p38 MAPK途径,而非JNK和ERK途径,介导了NMDA诱导的神经元凋亡,抑制与此相关的凋亡信号通路可发挥神经保护作用;JNK途径可能介导了NMDA所致的神经元坏死而非凋亡。     

少棘蜈蚣抗菌肽scolopin 2的克隆、表达与抗癌机制研究

旨在研究AMP-scolopin 2的抗菌活性和抗癌机理。利用SUMO融合技术对AMP-scolopin 2进行了体外表达;采用抑菌圈、MTT、流式细胞术和Western blotting等技术分析了其抗菌活性、溶血活性和对肿瘤细胞的促凋亡作用。结果表明,成功表达并纯化了AMP-scolopin 2;AMP-scolopin 2对白血病细胞(K562)和肝细胞癌(Hep G2)具有抑制增殖和促凋亡作用,但对红细胞和正常细胞HEK293的影响很小;AMP-scolopin 2(40μmol/L)可以诱导K562(21.4%)和Hep G2(18.5%)细胞凋亡;此外,AMP-scolopin 2下调了与线粒体相关的凋亡蛋白pro-caspase-3、pro-caspase-9和pro-PARP的表达,且呈浓度依赖性。AMP-scolopin2可以通过线粒体caspase依赖性途径促进肿瘤细胞凋亡。     

荞麦胰蛋白酶抑制剂的原核表达及纯化

根据文献报道的荞麦胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列及本研究室先前已获得的部分基因序列设计引物,经过RT-PCR扩增,获得荞麦胰蛋白酶抑制剂编码区基因全序列.将该基因克隆到原核表达载体pQE-31中,并转化至大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达获得可溶性目的蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的25%.该目的蛋白经Ni2 -NTA柱亲和纯化,SDS-PAGE分析显示,在大约9kD处出现明显的目的条带,与预计蛋白分子量大小一致.Western blot鉴定证实,目的蛋白N端带有6个组氨酸标签.活性测定表明,目的蛋白具有专一性的胰蛋白酶抑制剂活性,抑制活性约为77U/mg纯化蛋白.本实验为进一步研究荞麦胰蛋白酶抑制剂结构与功能的关系奠定了基础.     

rBTI通过上调PTEN的表达抑制Hep G2细胞增殖

磷酸酶及张力蛋白的同源基因(PTEN) 是一种抑癌基因,可以调控细胞的增殖,与癌症的发生和发展息息相关。本研究采用MTT法和流式细胞术分别检测了重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)对人肝癌细胞株Hep G2细胞的增殖以及周期的影响。免疫荧光及Western印迹法检测了PTEN和p PTEN的亚细胞定位及蛋白表达的变化。采用qRT-PCR及Western印迹法检测了周期相关蛋白的表达。旨在探究PTEN和p PTEN在rBTI抑制Hep G2细胞增殖和周期阻滞中的作用。结果表明,rBTI能显著抑制Hep G2细胞增殖,将细胞周期阻滞在G0/G1期,并呈时间和剂量依赖性;rBTI作用于Hep G2后,可显著上调PTEN和p-PTEN的表达。同时发现,p-PTEN主要分布于细胞核中,能与核仁发生共定位;周期相关蛋白检测表明,细胞内p53、p21转录水平和蛋白水平均增加。综上所述,rBTI通过上调PTEN的表达,使得细胞周期阻滞于G0/G1期,进而抑制Hep G2细胞的增殖。     

Procaspase-8失调与肿瘤细胞对TRAIL的耐受

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)可激活胱天蛋白酶（caspase）家族蛋白系列级联反应,最终诱导细胞凋亡. TRAIL选择性地诱导肿瘤细胞凋亡而不损伤正常细胞,使其成为治疗癌症的潜在药物靶点. 目前已知,细胞型FADD样白介素-1-β转换酶抑制蛋白(c FLIP)和凋亡抑制蛋白(IAPs)是肿瘤细胞对TRAIL耐受的主要原因.胱天蛋白酶原-8（procaspase-8）是TRAIL凋亡信号途径中的凋亡起始蛋白. 然而近年发现,在某些肿瘤细胞中procaspase-8功能失调常会阻碍凋亡信号传导,使肿瘤细胞对TRAIL诱导的凋亡产生耐受. 本文就其机制进行概述.     

PACE4对异丙肾上腺素诱导的心肌细胞凋亡的影响及其机制

目的:研究前体蛋白转化酶枯草溶菌素(PACE4)对异丙肾上腺素(ISO)诱导的心肌细胞凋亡的作用及其可能的作用机制。方法:构建pFLAG-PACE4重组表达载体并转染H9c2心肌细胞。将心肌细胞分为四组:正常对照组(无任何干预因素)、ISO组(10μmol/L ISO)、ISO+pFLAG组(空载质粒pFLAG转染+10μmol/LISO)、ISO+pFLAG-PACE4组(pFLAG-PACE4重组表达质粒转染+10μmol/LISO)。采用AnnexinV-FITC/PI双染法测定心肌细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法检测活性半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3、caspase-12、钙网蛋白、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、活化转录因子4(ATF4)和PERK的表达以及真核起始因子2α(eIF2α)的磷酸化水平。结果:与正常对照组相比,ISO组中PACE4表达水平明显降低,而转染pFLAG-PACE4质粒后,其表达水平显著增加。PACE4过表达可以显著抑制ISO诱导的细胞凋亡和caspase-3以及caspase-12的蛋白表达。ISO处理显著增加内质网应激分子钙网蛋白、GRP78和CHOP的表达,而PACE4过表达则可以抑制这些蛋白的表达。ISO诱导的PERK、eIF2α和ATF4的表达可以显著被PACE4过表达抑制。结论:PACE4过表达可以抑制ISO诱导的H9c2心肌细胞凋亡,其机制可能与PERK信号通路介导的内质网应激反应有关。     

选择性COX-2抑制剂celecoxib对K562细胞的增殖抑制、凋亡诱导作用和分子机制

环氧化酶(cyclooxygenase, COX)家系被显示与恶性肿瘤的增殖和凋亡耐受有关,COX-2可作为恶性肿瘤治疗和预防的重要分子靶标.应用COX-2特异抑制剂——celecoxib,观察了药物对人慢性粒细胞白血病急变细胞株——K562细胞的增殖抑制和凋亡诱导效应.结果证明,celecoxib能够有效地抑制K562细胞增殖(台盼蓝染色,MTT试验及集落形成抑制试验证实),并呈一定的剂量依赖性.Celecoxib抑制K562细胞增殖的IC₅₀为46 μmol/L.通过DNA ladder胶电泳和流式细胞仪检测,凋亡细胞的AO/EB染色等方法证明celecoxib能够诱导K562细胞凋亡,这一效应与Caspase-3蛋白表达上调和裂解激活有关,当阻断Caspase-3的活性,celecoxib诱导的K562细胞凋亡明显受抑.利用RT-PCR分析技术及蛋白质印迹,证明K562细胞存在COX-2 mRNA和COX-2蛋白表达;而且,K562细胞COX-2蛋白表达可被IL-1β诱导性刺激,从而确认K562细胞为COX-2表达阳性细胞;celecoxib在较高浓度(80～160μmol/L)既可抑制K562细胞COX-2 mRNA表达,也可下调COX-2蛋白质表达,提示celecoxib抗K562白血病细胞活性与COX-2的抑制相关,其抗白血病的分子机制部分涉及到COX-2依赖性途径.     

胞浆型磷脂酶A2介导弱氧化修饰低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡

探讨弱氧化修饰低密度脂蛋白(MM-LDL)能否诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡以及胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)在此过程中的作用.MTT法测定细胞存活率;相差显微镜、荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞凋亡;3H-花生四烯酸(3H-AA)预标法测定PLA2活性;蛋白质印迹检测cPLA2磷酸化;激光共聚焦显微镜检测单个细胞内钙离子浓度的变化.结果表明,MM-LDL(100～300 mg/L)作用后的HUVECs呈现凋亡典型的形态特征,凋亡率随MM-LDL浓度的增加而上升.MM-LDL能引起胞内钙离子浓度增加,cPLA2的活化及磷酸化.15 μmol/L AACOCF3和5 mmol/L EGTA在抑制cPLA2活性的同时,部分抑制MM-LDL诱导的HUVECs凋亡.加入外源性AA(50 μmol/L)能逆转AACOCF3引起的凋亡抑制.结果提示,cPLA2参与了MM-LDL诱导HUVECs凋亡的信号传递.     

乙醛脱氢酶2可减少氧化损伤诱导的心肌细胞凋亡

乙醛脱氢酶2 (aldehyde dehydrogenase 2, ALDH2)是线粒体特异性酶,已被证明参与氧化应激诱导的细胞凋亡,而在心肌细胞中的作用知之甚少。本研究旨在通过用特异性ALDH2抑制剂大豆苷抑制ALDH2活性来研究ALDH2在抗霉素A诱导的心肌细胞凋亡中的作用。应用抗霉素A和大豆苷诱导小鼠心肌细胞,然后测定ALDH2酶活性、细胞内活性氧(reactive oxy gen species, ROS)含量和细胞凋亡,应用RT-PCR和蛋白质印迹法(Western blotting)检测ALDH2 m RNA和蛋白表达。结果表明,抗霉素A (40μg/mL)可诱导新生心肌细胞凋亡,而大豆苷(50μmol/L)能有效地抑制ALDH2活性而对细胞凋亡没有影响,并且可显著增强抗霉素A诱导的心肌细胞凋亡(53.72%～71.33%, p<0.05)。与单独用抗霉素A处理的细胞相比,抗霉素A和大豆苷共处理的心肌细胞中活化的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号传导途径(p38-MAPK)的磷酸化也显著增加。本研究初步表明,改变线粒体ALDH2活性可能是减少氧化损伤诱导的心肌细胞凋亡的潜在选择。     

抑制JNK通路对胃癌细胞SGC7901增殖、凋亡、迁移和周期的影响

探讨JNK通路抑制剂SP600125对胃癌细胞SGC7901增殖、凋亡、迁移和周期的影响及其机制。以胃癌细胞SGC7901为研究对象,实验分为空白对照组及药物处理组,采用CCK-8法检测不同浓度及不同作用时间SP600125对SGC7901增殖活性的影响,筛选出最佳作用时间与浓度用于后续实验。通过流式细胞术检测SP600125对SGC7901凋亡和周期的影响。Transwell迁移实验检测其对SGC7901迁移能力的影响。Western blotting检测SP600125作用后各组细胞GM130、JNK、p-JNK、c-jun、cleaved caspase-3、bcl-2、MMP-7蛋白水平的变化。研究表明,与空白对照组相比,10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L浓度均能使SGC7901增殖活性降低,且在40μmol/L水平作用24 h其增殖抑制率最高(p0.05)。在此水平可使细胞凋亡率明显增加(p0.001)。与空白对照组相比,药物处理组细胞处于G2/M期的比例显著增加(p0.01),处于G0/G1期比例减少(p0.01),S期无明显变化,细胞迁移能力也明显下降(p0.01)。Western blotting显示药物处理组与空白对照组相比,蛋白GM130(p0.01)、JNK(p0.01)、P-JNK(p0.01)、c-jun(p0.01)、BCL-2(p0.01)、MMP-7(p0.05)的表达明显下降,cleaved caspase-3表达升高(p0.01)。以上研究表明JNK通路抑制剂SP600125可抑制胃癌细胞SGC7901增殖活性,促进其凋亡,使其周期阻滞于G2/M期,抑制胃癌细胞迁移能力,这可能与其抑制GM130、c-jun、MMP-7等蛋白的表达有关。     

盐酸异丙嗪对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究盐酸异丙嗪对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响。方法:采用不同浓度(15、23和31μmol/L)的盐酸异丙嗪处理HepG2细胞48 h,应用噻唑蓝(MTT)法测定细胞的增殖活性,检测乳酸脱氢酶(LDH)活性,Hoechst33258染色法检测细胞的凋亡情况。结果:盐酸异丙嗪能以浓度依赖的方式抑制HepG2细胞的增殖,23μmol/L盐酸异丙嗪处理48 h能够显著诱导HepG2细胞凋亡;对照组与处理组之间的LDH活性无显著性差异(P0.05)。结论:盐酸异丙嗪可显著抑制肝癌HepG2细胞增殖,这与其诱导细胞凋亡途径有关。