锦鲤鳍条组织细胞系的建立及其生物学特性

采用组织块移植培养技术,对来源于锦鲤（Cryprinus carpiod）鳍条组织的细胞进行原代培养,建立了锦鲤鳍条组织细胞系,已稳定传代60多次,命名为Koi-Fin。锦鲤鳍条组织细胞为成纤维样细胞,最佳培养基为MEME,最适血清体积分数为10%,最适培养温度为25 oC,群体倍增时间为43.5 h。该细胞经液氮冷冻保藏12个月后采用台盼蓝染色,约（80.21±5.84）%的细胞具有细胞活性,复苏细胞生长旺盛。细胞染色体分析显示,第16代锦鲤鳍条组织细胞的染色体数目为正常二倍体2n=100,第40代细胞的染色体众数为52。病毒敏感性试验结果表明,Koi-Fin细胞系对锦鲤疱疹病毒（Koi Herpesvirus,KHV）敏感,可产生典型细胞病变效应,病毒滴度为107.86±0.51TCID50/mL。针对锦鲤疱疹病毒胸苷激酶（thymidine kinase,TK）基因设计特异性引物进行PCR检测,可扩增出病毒靶基因片段。     

流行性出血热病毒在长爪沙鼠肺肾原代细胞中增殖

将来源于黑线姬鼠肺,褐家鼠肺和流行性出血热(EHF)病人血液的三株 EHF 病毒,在长爪沙鼠肺、肾细胞中传代培养。接种后第一代就能很好增殖,滴度可达10~(6·0-6·5)TCID50/ml。随着传代次数的增加,病毒增殖速度加快,第三代在接种后2天即可检出感染细胞,4—8天有50%左右的细胞感染。经传九代未见明显的细胞病变。病毒增殖的高峰在接种后9天左右。维持液中有牛血清,冻融和超声波处理能提高病毒滴度。不同温度(33℃和37℃)和 pH(含5%和3%CO_2)培养对病毒增殖无明显影响。经传代的感染细胞仍能与 EHFV 单克隆抗体起反应,并排除ⅠⅡⅢ面型呼肠孤病毒的感染。     

施氏鲟不同组织来源细胞离体培养的初步研究

采用组织块移植培养技术,对来源于施氏鲟(Amursturgeon,Acipenser schrencki Brandt)肝脏、脾脏、肾脏、鳍条和心脏组织的细胞进行了原代培养,2～3天左右可见组织块周围有成纤维样细胞迁出,10天左右组织块周围形成单层细胞。对原代培养的单层细胞用胰蛋白酶-EDTA消化后传代培养,建立了可连续传代的施氏鲟肝脏、脾脏、肾脏、心脏组织细胞系。初步确立施氏鲟细胞培养的条件,培养基为MEME,培养温度为25℃,血清浓度为20%。对传代培养细胞以二甲基亚砜为保护剂在液氮冷冻保存,细胞复苏后可连续传代培养。施氏鲟细胞离体培养为开展鲟鱼病毒病和遗传资源保存研究提供了重要试验材料。     

鸡胚细胞的传代培养和麻疹病毒的增殖

为了建立原代鸡胚细胞的传代培养工艺,探究传代鸡胚细胞对麻疹病毒的敏感性和适应性,本研究将原代鸡胚细胞进行传代培养,分别采用原代鸡胚细胞和传代鸡胚细胞培养麻疹病毒沪-191(Shanghai-191,S-191)株毒种,并对病毒收获液进行滴度检测和基因序列测定。结果显示,原代鸡胚细胞可稳定传代培养至第10代,各代次细胞生长趋势相似;第5代鸡胚细胞染色体检查为正常染色体核型;第8代鸡胚细胞成瘤性检查未见成瘤;采用第3、5代鸡胚细胞制备的麻疹病毒滴度水平高于原代鸡胚细胞,但无显著性差异(n=3,P>0.05),编码病毒核蛋白(nucleoprotein,N)和血凝素蛋白(hemagglutinin,H)的基因序列与S-191株完全一致,未发生变异。本研究证实,原代鸡胚细胞可进行传代培养,各代次鸡胚细胞对麻疹病毒的敏感性不变,产毒水平无显著差异,可用于培养麻疹病毒。     

二株不同基因型树鼩呼肠孤病毒的分离和鉴定

目的从腹泻树鼩的粪便样本中分离和鉴定病毒。方法树鼩腹泻粪便样本分别接种Vero、LLCMK2和KMB17细胞,经连续传代,观察记录细胞病变,并对培养上清进行透射电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析、轮状病毒鉴别筛查、S1全长基因片段扩增和生物信息学分析。结果树鼩腹泻粪便样品在KMB17、Vero和LLC-MK2细胞上经连续3代次传代后,均能产生细胞病变。经电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析和轮状病毒鉴别筛查,推测其为呼肠孤病毒。病毒基因组全长S1基因扩增、序列测定和分析结果表明,KMB17培养上清中获得的病毒与I型原型株T1L同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和90%,因此该病毒定义为呼肠孤病毒I型。而LLC-MK2和Vero细胞上清中的病毒S1基因与III型原型株T3D核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和92%,因此为呼肠孤病毒III型。结论对今后树鼩和其他宿主呼肠孤病毒的分离鉴定有一定的指导意义。     

新型鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定

本研究从临床表现为出血性坏死性肝炎的病死鸭肝脾中分离到病毒。病原特性鉴定显示,分离毒能致死番鸭胚和鸡胚;人工感染1日龄雏番鸭、雏半番鸭均能复制出与临床自然发病鸭相同的临床症状和病理变化,并能回收到病毒。分离毒能在MDEF等多种细胞中增殖并产生细胞病变。电镜下病毒在细胞浆中呈大量散在、成堆和晶格状排列,病毒粒子呈球形、无囊膜、双层衣壳、直径70nm左右。在SDS-PAGE中具有禽呼肠孤病毒10个RNA片段的特征,但M1-3和S1-4片段的迁移率明显不同于番鸭呼肠孤病毒(MDRV)。分离毒S3基因全序列与禽呼肠孤病毒(ARV)、火鸡呼肠孤病毒(TRV)和MDRV的核苷酸同源性分别为60%～60.2%,61.9%,62.3%～62.7%,氨基酸同源性分别为68.2%～69%,68.2%,69.3%～70.1%;S3基因编码的σB蛋白属于单独的进化分支,提示分离毒S3基因具有不同于ARV和MDRV的特征。结果表明鸭出血性坏死性肝炎的病原是一种属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属新型鸭呼肠孤病毒。     

应用不同代次兔肾细胞培养风疹病毒松叶株的研究

目的为提高兔肾细胞产量用于增加风疹病毒生产。方法 SPF级家兔肾细胞经传代培养10代,对不同代次兔肾细胞进行遗传稳定性、外源因子及兔脑原虫检测后接种风疹病毒松叶株(Matsuba strain)的试验。结果兔肾细胞产量得到提高,由1对兔肾平均生产1瓶细胞增加为8瓶,细胞核型检查传至第10代的细胞染色体数目与初代细胞一致,细胞培养物均一性提高。第0～第3代细胞病毒培养物滴度间无显著性差异,χ2检验返回相关性的P值均大于0.95。结论第1～第3代细胞培养风疹病毒与第0代相比,可获得相同滴度的病毒培养物,p3代兔肾细胞应用于疫苗生产可显著提高细胞及病毒产量。     

应用细胞工厂传代原代地鼠肾细胞培养狂犬病病毒

目的应用细胞工厂建立原代地鼠肾(primary hamster kidney, PHK)细胞传代培养工艺,培养狂犬病病毒,为PHK细胞和人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)的规模化放大奠定基础。方法选用SPF级地鼠,无菌取肾,经消化分散接种到细胞工厂中,在37℃下培养筛选出PHK细胞静置培养的最适细胞接种密度;在最适细胞接种密度下,从0.20%水解乳蛋白MEM培养基和改良的DMEM/F12培养基中筛选出更适宜地鼠肾细胞静置培养的培养基;同时对消化液A(含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液)和消化液B(含0.30%柠檬酸钠的0.25%胰蛋白酶溶液)的消化效果进行比对,选择适宜的消化液;最后,使用最佳培养基和消化液对PHK细胞进行传代,观察细胞生长情况并分析代谢水平;对同一细胞批不同代次的单层细胞(P0代、P1代和P2代)接种狂犬病病毒aG株,进行多次收获,检测单次病毒收获液病毒滴度。结果 PHK细胞(P0代)在细胞工厂中适宜的接种密度为0.30×10~6～0.50×10~(6 )cells/cm~2;改良的DMEM/F12培养基和消化液B更适用于PHK细胞的培养和消化传代;在40层细胞工厂(CF40)中使用最佳培养基和消化液传代地鼠肾细胞至第4代(P4代),随着代次的增加,收获的细胞密度降低、葡萄糖消耗减少和乳酸生成下降;P0代、P1代和P2代细胞均有较佳的细胞状态和增殖能力;用P0代、P1代和P2代细胞培养狂犬病病毒,能有效收获4次,且单次病毒收获液病毒滴度结果符合要求,差异无统计学意义(P0.05)。结论成功建立了PHK细胞传代培养工艺,为PHK细胞的规模化放大,冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)生产工艺的改进、变更以及产能的扩大提供了参考。     

一株草鱼呼肠孤病毒弱毒株的分离、鉴定及免疫原性初步分析

从江西南昌患出血病草鱼体内分离出的草鱼病毒(暂命名为JX09-01)能使草鱼肾脏细胞(CIK)、草鱼肝细胞(L8824)、草鱼吻端成纤维细胞(PSF)产生明显的细胞病变效应(CPE)。感染CIK 细胞固定后经电镜观察,发现细胞质内有大量病毒聚集, 形态和排列方式与已报道的草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)相似。针对GCRV 873 株S6 基因设计的简并引物可以从病料组织和感染细胞中扩增出目的条带, 而针对GCRVHZ08 株S6 基因设计特异性引物未能扩增出目的条带。对JX09-01 株的S6 全基因进行序列分析表明, 其核苷酸序列同GCRV 873 株和HZ08 株的同源性分别是99.3%和30.4%, 推导出的氨基酸序列同源性分别是98.6%和30%, 说明草鱼病毒JX09-01 株为草鱼呼肠孤病毒。用JX09-01 株接种当年8-10 cm左右的草鱼, 没有明显的临床症状, 不能致草鱼死亡。用传代至15 代的CIK 细胞病毒液进行免疫保护试验, 结果显示其对强毒株的免疫保护率达到86.7%。实验结果初步显示, 新分离到的JX09-01 为草鱼呼肠孤病毒弱毒株, 可作为弱毒疫苗的候选毒株。       

两株水生呼肠孤病毒部分特性的比较

水生呼肠孤病毒为感染水生动物的一类病原体,隶属于呼肠孤病毒科新建水生呼肠孤病毒属。草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)是引起中国南方淡水养殖草鱼暴发性出血病病原,鲅鱼呼肠孤病毒(Threadfin reovirus,TFV)是引起海水养殖鲅鱼病毒病病原。本研究将GCRV与新加坡TFV分离株进行了部分特性比较研究。结果表明,GCRV与TFV均能感染CIK细胞,但对其它鱼类细胞系的敏感性有所差异。此外,凝胶电泳与逆转录聚合酶链式扩增显示,GCRV与TFV核酸属不同的基因型。在多肽特性上,证实了GCRV的5条主要结构多肽具有与。FTV及水生呼肠孤病毒相似的特性。Westem blot检测显示,草鱼呼肠孤病毒与TFV结构蛋白拥有部分相同的抗原决定簇。     

两株水生呼肠孤病毒部分特性的比较

水生呼肠孤病毒为感染水生动物的一类病原体,隶属于呼肠孤病毒科新建水生呼肠孤病毒属.草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)是引起中国南方淡水养殖草鱼暴发性出血病病原,鮁鱼呼肠孤病毒(Threadfin reovirus,TFV)是引起海水养殖鮁鱼病毒病病原.本研究将GCRV与新加坡TFV分离株进行了部分特性比较研究.结果表明,GCRV与TFV均能感染CIK细胞,但对其它鱼类细胞系的敏感性有所差异.此外,凝胶电泳与逆转录聚合酶链式扩增显示,GCRV与TFV核酸属不同的基因型.在多肽特性上,证实了GCRV的5条主要结构多肽具有与FTV及水生呼肠孤病毒相似的特性.Western blot 检测显示,草鱼呼肠孤病毒与TFV结构蛋白拥有部分相同的抗原决定簇.     

不同倍性泥鳅鳍细胞系的建立及生物学特性分析简

采用组织块培养法启动二倍体、三倍体和四倍体泥鳅鳍组织细胞原代培养,采用胰蛋白酶消化法传代,目前二倍体、三倍体和四倍体细胞已经分别传至59代、68代和68代。三种细胞均为成纤维细胞样细胞。鳍组织无菌处理方法是:先用质量浓度为10%的碘伏浸泡15min;后用青霉素和链霉素的混合液(500 IU/mL青霉素,500μg/mL链霉素)浸泡30min;原代培养和早期传代培养所用的培养基为DMEM/F12,添加体积分数为20%的胎牛血清、10 ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20 ng/mLI型胰岛素样生长因子(IGF-I)以及10μg/mL硫酸软骨素。30代以后所用培养基为20%FBS-DMEM/F12。细胞培养在25℃、5%CO2培养箱中。在此条件下,二倍体、三倍体和四倍体的倍增时间分别为48.43h、36.01h和41.45h;二倍体、三倍体和四倍体的特征染色体数目分别为50条、75条和100条;测定的二倍体、三倍体和四倍体细胞及核的体积比分别为1︰1.37︰2.37和1︰1.53︰1.97;细胞经液氮冷冻保存60d后,解冻复苏后测定存活率分别为(80.88±1.38)%、(84.48±1.13)%、(81.57±1.28)%。不同倍性的泥鳅细胞系的建立丰富了鱼类细胞系的种类,为揭示多倍体鱼类生长、遗传等机制打下基础。     

青海湖裸鲤体外肝胰细胞原代与传代培养

采用组织块移植培养技术,分别用DMEM和RPM11640培养基对青海湖裸鲤肝胰组织细胞进行原代培养。培养48h组织块周围有细胞迁出,并形成生长晕。培养一周可形成单层细胞。对原代培养的单层细胞用胰蛋白酶-EDTA消化后,传代培养至第四代。确立青海湖裸鲤肝胰细胞培养条件为：培养基为DMEM,培养温度为27℃,pH值为7．0—7．5,原代培养血清浓度为20％,传代培养的血清浓度为10％,无需通入CO2和添加细胞生长因子。     

中华鲟精巢细胞系的建立和鉴定

为了开展中华鲟(Acipenser sinensis)种质资源保存及其精原干细胞体外培养的研究, 采用蛋白酶消化法, 对中华鲟精巢组织细胞进行原代培养, 建立了中华鲟精巢细胞系(Acipenser sinensis testicular cell line, AST), 经352d传代培养, 已稳定传至80代。中华鲟精巢细胞系形态主要呈类纤维状, 培养基为DMEM, 培养温度为25℃, 最适血清浓度为15%。正常传代的AST细胞冻存、复苏后, 经台盼蓝染色, 约(81.36±1.13)%的细胞具有活性, 复苏后细胞仍生长旺盛。染色体核型分析结果显示, 第30代中华鲟精巢细胞系染色体数目分布在142—310, 众数为264。通过RT-PCR检测发现, 在P0和P1细胞中, Sertoli细胞特异表达基因(amh和gsdf)、Leydig细胞特异表达基因(cyp17a1)和生殖细胞特异表达基因(dazl、dnd和vasa)都有表达, 且表达量与精巢中的相似; 在P15、P30和P60细胞中, 只有amh和vasa基因有微弱的表达, 说明细胞系传代到了后期, 只含有极少量的Sertoli细胞和生殖细胞。通过脂质体转染法将pEGFP-N3质粒转入AST细胞中, 可表达增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)。AST细胞系的建立为中华鲟种质资源的保存、精原干细胞的体外增殖与分化、基因功能等研究提供了重要的实验材料。     

猪骨髓间充质干细胞的分离培养及核移植后重构胚胎发育能力的研究

不同类型的细胞核移植效率不同,原因之一可能是不同类型细胞核移植后进行重编程的潜力不同.本实验对猪骨髓间充质干细胞(porcine bone marrow mesenchymal stem cells,pMSCs)体外分离培养的方法进行了优化.对猪骨髓间充质干细胞的增殖及生长特性进行了观察分析,并以其作为供体细胞进行核移植,对此类型细胞进行重编程的潜力进行了评估.结果表明用密度梯度离心法分离猪骨髓间充质干细胞优于全骨髓贴壁法:猪骨髓间充质干细胞数目在培养第6天达到峰值,传代培养10 h时,贴壁率达到78.50%;传代培养后第4天分裂指数最高,为24.00‰;以猪骨髓间充质干细胞(pMSCs)和猪胎儿成纤维细胞(PF)分别作为供核细胞构建核移植胚胎,其体外囊胚发育率分别为14.63%与15.07%(P＞0.05),孤雌对照组囊胚发育率为30.91%(P＜0.05);而三组囊胚细胞数分别为30.67±17.7、24.1±6.5和25.8±11.4(P＞0.05).实验表明,体外培养的猪骨髓间充质干细胞生长增殖旺盛,生物学性状稳定.并适合作为核移植供体细胞.     

牛肝脏细胞体外培养和传代细胞的初步鉴定

该文采用灌注胶原酶消化法分离牛肝细胞,通过DMEM培养基(含10%胎牛血清)体外连续进行原代和传代培养,观察细胞增殖变化及细胞培养过程中的形态消涨变化情况。该文还对第12代培养细胞的染色体情况及细胞生长情况进行分析,同时采用PAS染色法进行糖原含量鉴定。结果显示,分离的肝细胞群体倍增时间为62.8 h,染色体为60条, PAS染色观察发现,培养细胞质中有大量糖原颗粒。     

小鼠孤雌胚胎干细胞的建立及其向运动神经元分化的初探

文章采用小鼠的孤雌囊胚建立胚胎干细胞系,探究其向运动神经元分化的可能,为临床治疗以及研究基因组印记与神经分化的的关系提供理论基础。结果表明:卵母细胞孤雌激活率达到93.26%,成功建立了8个孤雌胚胎干细胞系,建系率达到23.53%。克隆表达多潜能标记Oct4及细胞表面标记SSEA-1,有高水平的碱性磷酸酶活性,在细胞第10代和第30代时核型分析检测显示为正常的40条染色体。体内、外均分化出三胚层来源的细胞。联合应用全反式维甲酸(RA)、音猬因子(Shh)及细胞外基质,小鼠孤雌胚胎干细胞可被诱导表达运动神经元的标志性标记HB9、Olig2。     

草鱼细胞系CIK酵母双杂交cDNA文库的构建及初步应用

旨在探索草鱼呼肠孤病毒与宿主细胞蛋白质间的相互作用,运用SMART技术构建了草鱼肾组织细胞系CIK(Ctenopharyngodon idellus kidney)的酵母双杂交cDNA文库。提取CIK细胞总RNA后,分离纯化mRNA,然后以mRNA为模板,反转录合成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR,扩增双链cDNA。利用SMART技术,通过同源重组的方法,在酵母株Y187中构建了草鱼CIK细胞全长cDNA文库。经检测,未扩增文库的转化率为1.6×105,文库容量为2.4×106,插入的双链cDNA片段的长度为250-2 000 bp,文库滴度为7×107 CFU/mL,重组率为98%,此文库具有良好的cDNA片段多态性和完整性。利用构建的CIK酵母双杂交文库,以草鱼呼肠孤病毒的VP7和VP5蛋白作为诱饵进行筛选试验,得到VP7相互作用蛋白的阳性菌落,未得到VP5相互作用蛋白的阳性菌落。草鱼CIK细胞酵母双杂交cDNA文库的构建为研究草鱼呼肠孤病毒与宿主细胞间的互作机制提供了重要研究工具。     

草鱼呼肠孤病毒在CIK细胞中复制及形态发生的研究

以草鱼呼肠孤病毒(GCRV)感染的草鱼肾细胞系(CIK)为模型,进行了草鱼呼肠孤病毒在细胞内的形态发生的研究.当病毒以感染复数为5～10PFU/CELL感染CIK细胞时,在病毒感染细胞4h以内的切片中,可观察到脱去部分外层衣壳的不完整病毒颗粒.感染细胞8h,可观察到浆胞内病毒发生基质,其内含有大量的直径约50nm的亚病毒颗粒,无外层蛋白结构.感染12～16h后,这些亚病毒颗粒装配上外层蛋白结构,形成直径为72nm左右的成熟的病毒粒子.病毒感染细胞8h后,开始出现典型的病毒包含体,16～20h小时病毒包含体裂解,继而释放出有感染性的子代病毒颗粒.该结果有助于对GCRV致病机理的了解.