A33启动子结肠癌特异性探究及SV40增强子对其转录活性影响

为了探究A33核心启动子结肠癌特异性及SV40增强子对其转录水平的影响,该研究通过构建A33核心启动子和带SV40增强子的A33核心启动子(eA33)的荧光素酶报告基因载体pGL3-A33和pGL3-eA33,与内参照pRL-SV40质粒共转染至不同的细胞系中,利用双荧光素酶检测系统检测分析了A33和eA33启动子在不同细胞系中的转录活性。结果显示,A33核心启动子在结肠癌细胞系中具有转录活性低,但结肠癌特异性好的特点,而在其他类型癌细胞中基本没有活性。同时发现,eA33在各类癌细胞中的转录水平与A33相比,均呈大幅度提高,有显著性差异(P<0.01),但SV40增强子能显著增强A33启动子转录活性的同时减低了其结肠癌特异性。这为靶向癌症基因—病毒治疗策略在结肠癌的生物治疗应用中寻找结肠癌特异性的启动子奠定了研究基础。     

癌胚抗原(CEA)启动子在肿瘤细胞中的特异表达及介异bak基因诱发凋亡

构建由癌胚抗原 (CEA)启动子控制报道基因增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)表达的重组表达质粒pCEA EGFP .用转染细胞后检测荧光的方法对CEA阳性细胞进行简便、直观的检测 ,并结合流式细胞计数对CEA启动子在人结直肠腺癌细胞LS 1 74T、结肠癌细胞SW 4 80、肺腺癌细胞A5 49、人宫颈癌细胞HeLa和人喉癌细胞HEp 2中的活性进行了分析 ,发现其在SW4 80、LS 1 74T、A5 49中活性较强 ,而在HeLa和HEp 2中无活性 .构建由CEA启动子控制凋亡基因bak表达的重组表达质粒pCEA bak ,转染HeLa及SW 4 80细胞 ,用Hoechst332 5 8染色及PI染色 流式细胞计数分析的方法证明 ,pCEA bak转染能够特异性引起SW 4 80细胞的凋亡 .结果表明 ,CEA启动子具有很好的特异性 ,CEA介导bak基因的方法可望用于CEA阳性癌细胞的靶向性基因治疗 .     

磷酸钙纳米介导自杀基因载体的构建及其应用研究

构建由CEA启动子、CMV增强子驱动的融合自杀基因PCDNA3.1(-)CVyCDglyTK表达载体和分别由CEA启动子和巨细胞病毒(CMV)增强子驱动的融合自杀基因PCDNA3.1(-)CEAyCDglyTK、PCDNA3.1(-)CMVyCDglyTK表达栽体.以磷酸钙纳米为载体分别转染CEA阳性的人结肠癌细胞株LOVO细胞和CEA阴性的HeLa细胞,Lovo细胞在感染以上3种质粒表达栽体后均有yCDglyTK mRNA表达,且对5-FC的敏感性明显增强:HeLa细胞在纳米PCDNA3.1(-)CMVyCDglyTK复合物感染后有yCDglyTK mRNA表达,对5-FC的敏感性增强,而在另外两种复合物感染后则没有yCDglyTK mRNA表达,5-Fc对其亦无杀伤作用,结果表明靶向性基因治疗栽体能使融合自杀基因在CEA阳性细胞中专一性表达,达到靶向治疗肿瘤的目的.     

E-box元件修饰端粒酶核心启动子序列及体外转录活性分析

人类端粒酶启动子(hTERT启动子)在肿瘤基因治疗中的有效性已经得到了证实. 然而,hTERT启动子有限的肿瘤靶向转录活性困扰着它的临床应用.早期研究已经揭示,核心hTERT启动子上的-34位E-box元件与该启动子的肿瘤靶向转录活性有关.为进一步探索核心hTERT启动子序列3′端富余E-box元件是否能提高启动子的肿瘤靶向转录能力,用化学合成方法在野生型hTERT(WT-hTERT)核心启动子片段(编码蛋白起始子ATG上游-268 bp～-10 bp)的3′端接入3个E-box序列, 构建成修饰型hTERT(Mod-hTERT)启动子. 然后,分别用WT-hTERT和Mod-hTERT启动子去调控增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及荧光素酶报告基因在293FT、HepGⅡ、SGC7901、U2OS、以及原代培养人成纤维细胞(PHF)中表达. 结果表明, 在Mod-hTERT启动子的各实验组细胞中,能够在端粒酶阳性的293FT、HepGⅡ及 SGC7901细胞组中观测到EGFP的表达,而在端粒酶阴性的U2OS及PHF细胞组中没有观测到EGFP的表达;在端粒酶阳性的293FT、HepGⅡ和SGC7901细胞株中,Mod-hTERT启动子调控下的荧光素酶活性要高于WT-hTERT启动子组（P＜0.01）; 而在端粒酶阴性的U2OS细胞组中,Mod-hTERT启动子调控下的荧光素酶活性则低于WT-hTERT启动子组（P＜0.01); 在PHF细胞组中,Mod-hTERT启动子组与WT-hTERT启动子组的荧光素酶活性差异不显著(P＞0.05).研究提示,在3′端增加E-box元件可以提高核心hTERT启动子序列的肿瘤靶向转录活性.     

人端粒酶催化亚单位启动子调控自杀基因HSV-TK肿瘤细胞特异性表达载体的构建

将自杀基因形插入质粒pGL3-hTp和pGL3-Control中,取代其上的荧光素酶基因,分别构建hTERT启动子和SV40启动子调控的TK基因表达质粒pGL3-hWp-TK和pGL3-SV40-TK,酶切和PCR鉴定结果显示重组质粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK构建成功;用脂质体法将pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK瞬时转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞株A549及端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株MRC-5,RT-PCR显示转染pGL3-SV40-TK的细胞A549和MRC-5均有TK mRNA表达,转染pGL3-hTp-TK的A549细胞中也有形mRNA表达,但转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞无TK mRNA表达,提示hTERT启动子可以调控自杀基因HSV-TK在肺癌细胞中靶向表达,可能是肿瘤靶向性基因治疗中比较理想的转录调控元件．     

肝特异性表达HCV5＇NCR调控荧光素酶质粒的构建及表达

小鼠白蛋白是肝组织特异性表达的蛋白,这种特异性是由白蛋白启动子所介导的.以2235A-1质粒为模板,通过PCR扩增获得小鼠白蛋白启动子/增强子基因片段,用小鼠白蛋白启动子/增强子基因片段取代pHCV-neo4质粒(含HCV5＇NCR调控荧光素酶基因)的CMV启动子,构建了一种白蛋白启动子启动转录的HCV5＇NCR调控荧光素酶表达质粒(pA1b-HCV).该质粒能在小鼠肝癌细胞中表达且较小鼠其它癌细胞中表达水平明显增高,表明成功地构建了肝特异性表达的HCv5＇NCR调控荧光素酶表达质粒.该研究为建立肝特异性表达的HCV5＇NCR转基因小鼠模型奠定了基础,对评价HCV特异性反义药物及肝靶向性运载系统的作用具有重要的实际意义.     

肝特异性表达HCV5′NCR调控荧光素酶质粒的构建及表达

小鼠白蛋白是肝组织特异性表达的蛋白 ,这种特异性是由白蛋白启动子所介导的 .以2 2 35A- 1质粒为模板 ,通过 PCR扩增获得小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段 ,用小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段取代 p HCV- neo4质粒 (含 HCV5′NCR调控荧光素酶基因 )的 CMV启动子 ,构建了一种白蛋白启动子启动转录的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 (p A1 b- HCV) .该质粒能在小鼠肝癌细胞中表达且较小鼠其它癌细胞中表达水平明显增高 ,表明成功地构建了肝特异性表达的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 .该研究为建立肝特异性表达的 HCV5′NCR转基因小鼠模型奠定了基础 ,对评价 HCV特异性反义药物及肝靶向性运载系统的作用具有重要的实际意义     

肝特异性表达HCV5′NCR调控荧光素酶质粒的构建及表达

小鼠白蛋白是肝组织特异性表达的蛋白 ,这种特异性是由白蛋白启动子所介导的 .以2 2 35A- 1质粒为模板 ,通过 PCR扩增获得小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段 ,用小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段取代 p HCV- neo4质粒 (含 HCV5′NCR调控荧光素酶基因 )的 CMV启动子 ,构建了一种白蛋白启动子启动转录的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 (p A1 b- HCV) .该质粒能在小鼠肝癌细胞中表达且较小鼠其它癌细胞中表达水平明显增高 ,表明成功地构建了肝特异性表达的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 .该研究为建立肝特异性表达的 HCV5′NCR转基因小鼠模型奠定了基础 ,对评价 HCV特异性反义药物及肝靶向性运载系统的作用具有重要的实际意义     

FLT-1启动子在血管内皮细胞中特异生物活性的检测及其意义

目的:构建带有组织特异性 FLT-1 启动子的真核表达栽体,检测其在转染的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中对荧光素酶报告基因表达的驱动能力.方法:采用PCR扩增FLT-1启动子,插入到pGL3-Basic-luc载体中,构建携带FLT-1启动子的真核表达载体pGL3-FLT-Basic-luc,经脂质体法转染HUVEC、HepG2、NIH3T3和HEK293 细胞,于转染48h后采用双荧光报告系统检测荧光素酶表达活性.结果:酶切及测序证实构建的pGL3-FLT-Basic-luc栽体中含有序列正确的FLT-1基因启动子,双荧光报告系统检测显示,转染的HUVEC细胞其荧光素酶活性明显高于HEK293细胞(P<0.01),而转染的HepG2和NIH3T3细胞中未检测出荧光素酶表达.结论:克隆的FLT-1启动子具有较高的血管内皮特异性转录活性,可作为血管疾病靶向基因治疗的启动子来源.     

FLT-1启动子在血管内皮细胞中特异生物活性的检测及其意义

目的:构建带有组织特异性FLT-1启动子的真核表达载体,检测其在转染的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中对荧光素酶报告基因表达的驱动能力。方法：采用PCR扩增FLT-1启动子,插入到pGL3-Basic-luc载体中,构建携带FLT-1启动子的真核表达载体pGL3-FLT-Basic-luc,经脂质体法转染HUVEC、HepG2、NIH3T3和HEK293细胞,于转染48h后采用双荧光报告系统检测荧光素酶表达活性。 结果:酶切及测序证实构建的pGL3-FLT-Basic-luc载体中含有序列正确的FLT-1基因启动子,双荧光报告系统检测显示,转染的HUVEC细胞其荧光素酶活性明显高于HEK293细胞（P<0.01）,而转染的HepG2和NIH3T3细胞中未检测出荧光素酶表达。结论:克隆的FLT-1启动子具有较高的血管内皮特异性转录活性,可作为血管疾病靶向基因治疗的启动子来源。图     

小鼠白蛋白启动子的组织特异性功能研究

以绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因,通过对比小鼠白蛋白启动子在不同来源细胞系中启动HGFP基因的转录活性,对小鼠白蛋白启动子的组织特异性进行了研究。结果发现,小鼠白蛋白启动子在小鼠肝癌细胞系Hepa 1—6和人肝癌细胞系：HepG2均有很强的转录起始功能,荧光显微镜下可以观察到IGFP表达。Hepa 1—6细胞在转染早期的48h内,CMV的启动子和增强子序列是小鼠白蛋白启动子转录活性的4倍。G418加压筛选2周后,CMV的启动子的转录活性下降到只有小鼠白蛋白启动子活性的1／2。转染人肝癌细胞系HepG2 2周后,荧光显微镜下可以观察到GFP表达。其他的细胞如中华仓鼠卵巢细胞系CHO和人肺癌细胞系PLA 801中转染的小鼠白蛋白启动子不能启动GFP的表达,而对照CMV启动子控制下的GFP基因可在CHO和PLA 801中表达。以上结果说明,小鼠白蛋白启动子仅在肝脏来源的细胞中可以起始下游基因的转录,在其他组织来源的细胞中不能起始转录,这表明小鼠白蛋白启动子具有肝脏组织特异的转录活性,但没有种属特异性。     

人β1整合素启动子核心启动序列初步分析

目的:分析人β1整合素在HaCat细胞中核心启动片段.方法:以本室构建的含整合素β1全长启动子1745 bp基因序列(-1745bp～+11 bp)的重组栽体pGL3-1756为模板,用含有酶切位点的特异性引物扩增出整合素β1启动子-845 bp～304bp间基因序列,克隆至荧光素酶表达载体pGL3 basic,构建含正确目的基因重组载体pGL3-542.用pGL3-1756、和pGL3-542质粒转染人表皮细胞株HaCat进行活性分析.结果:酶切及序列测定表明,克隆后插入pGL3 basic中的启动子片段与GenBank DNA序列数据库对比分析序列一致,且插入方向正确.在人永生化表皮细胞株(HaCat细胞)中构建的pGL3-542载体具有很强的启动活性.结论:成功构建了整合素Bl远端启动子542 bp片段载体,在HaCat细胞中具有非常强的启动活性.人整合素β1整合素启动子核心启动序列可能位于-845 bp～-304 bp.     

干扰素γ增强GH3细胞中人生长激素基因表达机制

为了研究干扰素γ(IFN γ)对大鼠垂体GH3细胞中人生长激素 (hGH)基因启动子活性的影响及其可能的作用机制 ,采用荧光素酶报告基因方法 ,将含hGH基因启动子 (- 4 84～ 2bp)和荧光素酶报告基因的表达质粒pGL3 4 84 Luc单独转染或与垂体特异性核转录因子Pit 1蛋白表达质粒 (pcDNA Pit 1 cDNA)或Pit 1反义寡核苷酸 (Pit 1OND)共转染于大鼠垂体GH3细胞中 ,观察加入IFN γ及细胞内信号转导途径的抑制剂后GH3细胞中荧光素酶表达的变化 ,反映其对hGH启动子活性的影响 ;将含不同长度hGH基因启动子序列的荧光素酶表达质粒pGL3 3 80 Luc(- 3 80～ 2bp)、pGL3 2 5 0 Luc(- 2 5 0～ 2bp)、pGL3 1 3 2 Luc(- 1 3 2～ 2bp)和 pGL3 6 6 Luc(- 6 6～2bp)分别转染GH3细胞 ,观察它们对IFN γ的反应 ,以寻找IFN γ影响hGH基因启动子活性的关键序列。结果表明 ,IFN γ (1 0 5u/L ,1 0 6u/L)均能促进大鼠垂体GH3细胞中荧光素酶的表达 ,最高达对照组的 1 3 1 % (P <0 .0 0 1 ) ;在胞内信号转导抑制剂中 ,只有丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)信号转导途径抑制剂PD980 5 9(4 0 μmol/L) ,能完全阻断IFN γ的促进作用 ;Pit 1蛋白过表达和表达被抑制对IFN γ的促进作用没有影响 ;含不同长度hGH基因启动子序列质粒中 ,只有 pGL3 3 8     

人PRL-3基因启动子的克隆及转录因子Snail结合位点的初步鉴定

促肝细胞再生磷酸酶-3(PRL-3)是重要的肿瘤转移相关基因,其转录调控机制一直未被阐明.应用TRED在线分析系统共获得3种可能的人PRL-3基因启动子区域.通过与人基因组序列进行比对,发现其中3号启动子序列距离人PRL-3基因距离最近,位于该基因上游约1 kb的DNA区域,与5′端非翻译区域邻接.在线Consite分析系统发现,-500 bp至-451bp之间存在Snail结合的核心寡核苷酸序列CACCTG.运用分子克隆的方法获得PRL-3基因启动子2段区域-699 bp至299bp及-642 bp至-383 bp区域,后者具有Snail结合位点核心寡核苷酸序列CACCTG.构建具有荧光素酶报告基因的pGL3载体并检测其启动子活性.-699～299 bp区域与-642～-383 bp区域的DNA片段在SW480、SW620、CNE2、293A细胞中均具有启动子活性,其中含有Snail结合位点核心寡核苷酸序列CACCTG的短片段活性强于较完整的序列.染色质免疫沉淀结合PCR扩增技术及凝胶迁移阻滞实验确定PRL-3基因启动子区域具有Snail结合位点.研究确定,PRL-3基因的启动子位于转录起始位点上游700 bp与下游300 bp的DNA区域,PRL-3基因启动子存在转录因子Snail结合元件.     

小鼠Lrp5基因启动子的克隆及功能分析

为分析小鼠LDL受体相关蛋白 5 (Lrp5 )基因启动子的结构与功能 ,采用DNA重组技术 ,构建了 7种含小鼠Lrp5基因启动子荧光素酶报告基因表达体系 ,分别为 :pGL3 10 3(- 10 3bp～ + 132bp) ,pGL3 30 3(- 30 3bp～ + 132bp) ,pGL3 4 99(- 499bp～ + 132bp) ,pGL3 70 8(- 70 8bp～ + 132bp) ,pGL3 90 9(- 90 9bp～ + 132bp) ,pGL3 10 34(- 10 34bp～ + 132bp ) ,pGL3 12 2 9(- 12 2 9bp～ + 132bp) .以pRL TK为内参照质粒 ,瞬时转染成骨细胞株 (U2OS )及非成骨细胞株 (COS 7) ,收集细胞测定荧光素酶相对表达活性 .7种荧光素酶表达质粒在 2种细胞中表达无显著差异 ,即在所分析的小鼠Lrp5基因的 136 1bp(- 12 2 9bp～ + 132bp)范围内 ,不存在成骨细胞特异的表达元件 ;而且 7种表达质粒在 2种细胞中呈现相似的变化趋势 ,pGL3 10 3表达活性最高 ,pGL3 12 2 9表达活性显著降低 .表明小鼠Lrp5基因转录所必需的基本启动子序列在 - 10 3bp～ + 1bp范围内 ,- 10 34bp～ - 12 2 9bp之间的 195bp片段内可能含有负调控元件 .     

哺乳类细胞基因表达系统

真核基因的转录和转译调控是哺乳类细胞基因表达系统建立和发展的基础,外源基因的表达水平不仅决定于启动子/增强子的强弱,还与剪接信号、终止信号和poly(A)信号以及质粒的拷贝数等因素有关。另外,在基因治疗的研究中,也已寻找到多种具有组织或肿瘤特异性的启动子,来达到特异性肿瘤基因治疗的目的。     

人类RELM-beta基因启动子的结构与功能分析

为克隆人类抵抗素样分子β（resistin-like molecule beta, RELMβ）基因的上游启动子序列,并观察其不同截短片段的启动子活性,以人类基因组DNA为模板,通过PCR扩增方法获得-871～+50 bp、-729～+50 bp、-471～+50 bp、-438～+50 bp、-371～+50 bp大小的RELMβ启动子片段,将其定向克隆入pGL3-Basic载体,构建荧光素酶报告基因载体,并制备转录因子CDX-2结合位点的突变或缺失体.在阳离子脂质体的介导下,报告基因载体分别瞬时转染人胚肾293细胞、结肠癌HCT116和SW480细胞、宫颈癌HeLa细胞.结果发现,各RELMβ启动子片段在293、HCT116、SW480细胞中均有活性,但在HeLa细胞中活性缺失;-471～-438 bp区存在RELMβ启动子的核心调控元件.针对该区域CDX-2转录因子结合位点进行突变,能导致RELMβ启动子活性显著降低;凝胶电泳迁移率实验表明,该区段能结合CDX-2.结果提示,成功克隆了具有活性的RELMβ启动子序列,CDX-2为其重要的转录因子,为研究RELMβ基因的转录调控机制奠定了实验基础.     

关岭牛MyoD玉基因启动子报告质粒的构建及活性验证

为了克隆关岭牛MyoD玉基因启动子并验证其启动活性,根据GenBank中牛的MyoD玉基因序列设计PCR引物,用PCR技术扩增牛MyoD玉基因的启动子,构建重组克隆载体pUCmT-MyoD玉;并通过PCR扩增、限制性酶切、测序及生物信息学分析对阳性克隆进行鉴定;构建报告质粒pGL3-MyoD玉,并将其转染小鼠C2C12、3T3-L1细胞系,检测其24 h后的双荧光素酶活性。实验结果获得了关岭牛MyoD玉基因启动子,其序列长度为993 bp,并成功构建了MyoD玉启动子报告质粒;双荧光素酶活性检测表明pGL3-MyoD玉在小鼠C2C12细胞中的表达是pGL3空载体40.65倍,在小鼠3T3-L1细胞中的表达是空载体的1.13倍,MyoD玉启动子在小鼠C2C12细胞中的表达高于3T3-L1细胞(**p<0.01)。结果表明关岭牛MyoD玉基因启动子具有启动活性,在小鼠骨骼肌细胞中特异性表达。     

大鼠SCN5A基因内含子1＋204bp～＋757bp转录调控功能分析

目的 克隆大鼠心肌SCN5A基因5’端调控区,检测目的片段在HEK293细胞中的转录活性。方法 扩增大鼠心肌SCN5A基因＋204bp-＋757bp、＋204bp-＋385bp和＋204bp-＋329bp片段,构建含目的片段的荧光素酶报告基因——pGL3-P0、pGL3-P1和pGL3-P2,比较HEK293细胞中荧光素酶活性,评价不同长度DNA片段的转录调控活性。结果 成功构建大鼠心肌SCN5A基因5’端3个片断的荧光素酶报告基因,HEK293细胞中pGL3-P1相对荧光素酶活性分别为pGL3-PO、pGL3-P2的4．3倍和2．8倍。结论SCN5A基因内含子1目的片段在HEK293细胞中具有较强的转录调控活性;SCN5A基因＋329bp～＋385bp为正调控区,软件分析MZF1、USF、C-ETs-1等因子能与这些正调控区域结合并可能参与SCN5A基因的表达调控。