应用酵母双杂交系统筛选AMPK相互作用蛋白

一磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)是调节体内代谢平衡的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。应用酵母双杂交系统,以AMPKβ1亚基作为"诱饵"蛋白,筛选均一化的人源cDNA文库,寻找与AMPK相互作用的蛋白。通过对150个阳性克隆进行验证,最终得到了63个与AMPKβ1亚基相互作用的蛋白。其中,包括代谢酶、转录因子或转录相关蛋白、蛋白转运相关蛋白、GTP结合蛋白、支架蛋白、细胞周期调节蛋白、RNA结合蛋白等以及一些未知功能的蛋白。从酵母双杂交的结果来看,AMPK不仅在代谢领域,而且在许多非代谢领域,如核受体及其它转录因子的调节、信号转导、DNA修复及细胞周期调节等,可能都起到非常重要的作用。     

.用酵母双杂交系统筛选CENP-E相互作用蛋白

纺锤体检验点(spindle checkpoint)是一个重要的细胞分裂生化调节通路, 可监督染色体正确分离和传代．着丝粒相关蛋白E (centromere-associated protein E, CENP-E)是一个分子量为312 kD的微管马达驱动蛋白,可以衔接纺锤体微管与动点并参与纺锤体检验点调控．为研究CENP-E的作用机理,以其动点结合区域为诱饵蛋白,用酵母双杂交技术从人HeLa细胞 cDNA 文库中筛选出了Nuf2蛋白．体外的pull-down实验和体内的免疫共沉淀实验表明, Nuf2蛋白通过其卷曲螺旋(coiled-coil) 功能域特异结合CENP-E的 C 末端区域,间接免疫荧光显示Nuf2与CENP-E共定位于细胞有丝分裂期染色体的动点．由此推论, CENP-E 通过Nuf2的直接作用参与构筑动点-微管界面,进而参与细胞有丝分裂纺锤体检验点信号转导通路,为染色体正确分离发挥调控作用．     

酵母双杂交筛选锥虫早老素蛋白相互作用蛋白

目的筛选寻找锥虫早老素蛋白相互作用蛋白,以了解锥虫早老素蛋白功能。方法体外表达锥虫早老素蛋白片段,装入pGBKT7诱饵质粒,与随机肽库系统共转化酵母,筛选阳性克隆并测序,通过与基因库锥虫功能序列比较,推导可能的相互作用蛋白。结果获得108个阳性克隆,对其中50个进行了序列测定和比较,获得最有可能的4个候选基因,分别为：丝/苏氨酸性磷酸酶2b催化亚基A2;钙激活蛋白,含锚蛋白重复序列蛋白以及一个具有与APP跨膜区结合位点特征序列的功能未知蛋白。结论成功利用随机肽库酵母双杂交系统筛选锥虫早老素蛋白相互作用基因,其相互作用仍有待进一步确认。     

酵母双杂交技术筛选hCLP46的相互作用蛋白

目的:利用酵母双杂交技术,筛选人白细胞cDNA文库中能与人类CD34 干/祖细胞异常表达蛋白hCLP46(human CAP10-like protein46)相互作用的未知蛋白.通过对其相互作用蛋白的筛选和研究,研究hCLP46基因在骨髓增生异常综合症MDS-AML的作用机制.为MDS-AML的临床治疗和诊断提供理论基础.方法:以pGBKT7-hCLP46为诱饵质粒筛选人白细胞cDNA文库,得到阳性克隆,并对验证后的阳性克隆的外源性片段进行测序及同源性分析.结果:经过两次筛选、验证,从人白细胞cDNA文库中得到5个阳性克隆,对验证后的阳性克隆的外源片段进行测序及同源性分析,最终得到4个不同的候选基因序列.结论:应用酵母双杂交系统,共筛选得到4个不同的基因,其编码蛋白与hCLP46有相互作用,可能与MDS-AML发病机制相关.     

酵母双杂交技术筛选与hCLP46蛋白相互作用的蛋白

目的：利用酵母双杂交技术,筛选人类白细胞cDNA文库中能与人类CD34＋干/祖细胞异常表达蛋白hCLP46（Human CAP10-Like Protein46）相互作用的未知蛋白。通过对其相互作用蛋白的筛选和研究,深入探讨hCLP46的功能,为骨髓增生异常综合症MDS-AML的病理提供线索。方法：以pGBKT7-hCLP46为诱饵质粒筛选人类白细胞cDNA 文库,得到阳性克隆,并对验证后的阳性克隆的外源性片段进行测序及同源性分析。结果：从人类白细胞cDNA文库中得到86个阳性克隆,经过验证,最终得到5个阳性克隆。对验证后的阳性克隆的外源片断进行测序及同源性分析,最终得到4个不同的候选基因序列。结论：应用酵母双杂交系统,共筛选得到4个不同的基因,其编码蛋白与hCLP46 有相互作用,可能与MDS-AML发病机制相关。     

酵母双杂交系统筛选与RapGAP相互作用的蛋白质

目的筛选与Rap GAP相互作用的蛋白质,为进一步研究人源Rap1GAP介导的信号转导通路、揭示其与肿瘤的关系提供实验依据。方法选用与Rap1GAP同源的来自美丽线虫的Rap GAP作为饵蛋白,以来源于美丽线虫的c DNA文库作为靶蛋白,应用p PC97、p PC86组成的酵母双杂交系统筛选c DNA文库中与Rap GAP相互作用的蛋白质。结果通过营养缺陷平板(-LTH)筛选出63个拟似阳性菌落。经过Lac Z鉴定,19个菌落为阳性,其中7个为强阳性。提取来自19个酵母菌落中的重组DNA,经PCR扩增,12个菌落出现阳性结果。将该19个重组DNA分别电转化入DH5α细菌,涂板培养后,每板挑取4~10个克隆,通过Sal I和Not I双酶切鉴定进行阳性克隆筛选。将阳性克隆的重组DNA进行序列测定。测序结果与Gen Bank比较,其中4个克隆的DNA片段为Y39b6a基因片段、2个为Rap GAP、1个为苯丙氨酸-4-羟化酶、1个为细胞色素C氧化酶,还有1个DNA片段编码美丽线虫特有的小分子蛋白的基因片段,其余11个DNA片段不编码已知蛋白质。结论初步筛选出与Rap GAP相互作用的蛋白质,特别是其中有2个克隆为Rap GAP,提示Rap GAP可能以二聚体的方式存在。     

应用酵母双杂交系统筛选新基因Collectrin相关蛋白

Collectrin是在小鼠 5 6肾切除后 ,在肾小球的高滤过、高增生期分离克隆的一个新基因 .通过酵母双杂交系统从人肾脏cDNA文库中筛选与collectrin相互作用的蛋白 ,可以为该基因的功能研究提供线索 .构建collectrin的真核表达载体collectrin pGBKT7 c myc ,转化酵母菌AH10 9.Western印迹证实 ,collectrin蛋白能够在酵母中正常表达 ,对酵母细胞无毒性 ,不存在自激活现象 .将AH10 9 collectrin pGBKT7 c myc与转化了成人肾脏cDNA文库的酵母菌Y187接合 ,共筛选到 5个与细胞代谢有关的蛋白 ,包括鞘磷脂激活蛋白、精氨琥珀酸合成酶、氨基酸转运蛋白XAT2、NADH脱氢酶 1和金属硫蛋白 2A .由此推论 ,collectrin可能通过与细胞内某些酶类相互作用而影响细胞代谢 ,为新基因collectrin的功能研究提供了重要线索 .     

用酵母双杂交系统筛选与痢疾杆菌侵袭素IPaC相互作用的蛋白

利用酵母双杂交技术筛选与IpaC相互作用的真核细胞蛋白。首先将IpaC全长基因克隆到诱饵蛋白载体pGBKT7中 ,以构建的pGBKT IpaC为靶蛋白质粒 ,筛选人HeLa细胞cDNA文库。在 2× 10 6个克隆中得到 2 2个阳性克隆。其中 2个阳性克隆编码人胶原酶蛋白片段。并且进一步证明与胶原酶片段相互作用的IpaC结构域在 6 2aa～ 170aa之间。提示IpaC可能在胶原酶参与的生物学过程中发挥作用。     

利用酵母双杂交技术筛选人PROKR2蛋白C端相互作用蛋白

目的:利用酵母双杂交技术从人c DNA文库中筛选人前动力蛋白受体2(hPROKR2)C端相互作用蛋白。方法:复苏酵母菌Y2HGold-hPROKR2-C,与人c DNA文库杂交,计算杂交效率;筛选相互作用克隆并测序,寻找hPROKR2蛋白C端相互作用蛋白;通过在DDO/X、QDO/A/X平皿上划线,对筛选到的人c DNA文库质粒的自活性进行验证;采用GST pull down进一步验证两者之间的相互作用。结果:酵母双杂交实验的杂交融合效率为1.375×10~8;在人cDNA文库中筛选出hPROKR2蛋白C端相互作用蛋白SNAPIN,GST pull down实验证实两者之间存在相互作用。结论:SNAPIN可与hPROKR2蛋白C端结合。     

酵母双杂交筛选与GsCBRLK相互作用的蛋白质

GsCBRLK(calcium/calmodulin-binding receptor-like kinase from Glycine soja)在ABA及盐胁迫诱导的钙离子信号通路中起到关键的调节作用。为深入研究GsCBRLK蛋白的作用机制, 文章采用膜酵母双杂交系统, 以GsCBRLK为诱饵蛋白, 筛选与其相互作用的蛋白质。通过构建野生大豆盐胁迫条件下的cDNA文库、膜酵母双杂交系统筛选、复筛、回转验证、生物信息学分析以及酵母体内互作验证等手段, 最终获得2个(SNARE 和 14-3-3 蛋白)与GsCBRLK诱饵蛋白相互作用的蛋白质。     

酵母双杂交筛选类固醇激素合成急性调节蛋白的相互作用蛋白质

目的:利用酵母双杂交技术筛选人肝cDNA文库中与类固醇激素合成急性调节蛋白(STAR)相互作用的蛋白质。方法:将全长STAR基因克隆到酵母表达载体pDBLeu中,形成诱饵;将构建好的诱饵质粒转化至AH109酵母感受态中,利用酵母双杂交技术筛选人肝cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,并进行相互作用的回转验证。结果:构建了酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-STAR,并筛选到6个猎物,其中有5对相互作用回转验证阳性。结论:为进一步研究STAR的功能和作用机制提供了新的线索。     

酵母双杂交筛选与甲状旁腺素1型受体相互作用的蛋白

目的:采用Clontech公司第3套酵母双杂交系统,筛选与甲状旁腺素1型受体(PTH1R)相互作用的蛋白。方法:将全长PTH1R基因克隆到载体pGBKT7作为诱饵,用LiAc介导将诱饵蛋白质粒pGBKT7-PTH1R和人肾cDNA文库质粒转化到酵母菌AH109中,检测Mel1报告基因的表达,并进行相互作用的验证。结果:测序和相互作用验证结果表明SNAPIN在酵母系统中能特异地与PTH1R相互作用;根据对SNAPIN基因的功能分析,其可能与细胞内钙稳态的调控有关。结论:为进一步研究PTH1R促进骨肉瘤进展的机制提供了一定的线索。     

应用酵母双杂交系统筛选BRD7相互作用的蛋白质

BRD7基因是鼻咽癌组织表达下调/缺失的基因, 有强烈的鼻咽癌细胞系HNE1生长抑制作用. 利用酵母双杂交系统筛选与BRD7蛋白相互作用的蛋白, 首先将BRD7基因的完整阅读框架部分亚克隆至pAS2载体(BRD7-BD), 然后以BRD7-BD为靶蛋白, 筛选人胎脑cDNA文库, 在4.8×10⁶个转化子中筛选到11个阳性克隆, 序列测定表明, 分离到溴区包含蛋白3, 溴区包含蛋白2, β-IκB激酶, KIAA1375蛋白, 白介素7和接头相关蛋白复合物3 δ-1亚单位等与BRD7相互作用蛋白, 说明BRD7可能与BRD3或BRD2蛋白形成异源二聚体或三聚体发挥核内转录调节功能.     

酵母双杂交系统在膜蛋白相互作用研究中的应用

膜相关蛋白约占细胞总蛋白质中的1/3,它们大都参与了细胞的诸多生理、病理过程和药物反应机理。研究膜蛋白的相互作用对于揭示细胞的生命活动规律及寻找药物作用靶标都有重要的意义。由于膜蛋白本身的特性及其难以进入核内等原因,经典的酵母双杂交技术并不适用于检测膜蛋白间的相互作用。针对在活细胞中研究膜蛋白相互作用的需要,近年来国际上先后发展了一系列用于膜蛋白相互作用研究的酵母双杂交新系统,并取得了许多重要发现。     

酵母双杂交筛选人乳腺cDNA文库中与Gankyrin相互作用的蛋白

目的：应用酵母双杂交技术,筛选与Gankyrin有相互作用的蛋白质。方法：应用酵母双杂交系统,以Gankyrin基因全长为诱饵,在人乳腺cDNA文库中筛选能与Gankyrin相互作用的蛋白质,并运用营养缺陷型培养基和X-α-Gal等实验提供的信息,筛除假阳性克隆。结果：以Gankyrin为诱饵筛选出了5个阳性克隆,对其中一个蛋白质RhoGDI2与Gankyrin进行了免疫共沉淀与GSTpull-down实验验证,证实了它们的相互作用。结论：Gankyrin能与RhoGDI2发生相互作用,在此基础上,可以开展Gankyrin调控肿瘤发生机制的研究。     

酵母双杂交筛选与果蝇C(2)M相互作用的蛋白

同源染色体联会时形成的联会复合体(Synaptonemal complex, SC)是由减数分裂前期Ⅰ多种蛋白质聚集而成的超级复合结构。生殖细胞特异性的核蛋白C(2)M(Crossover suppressor on 2 of Manheim)在染色体上高度聚集可以诱导SC的形成。本文采用酵母双杂交方法,利用C(2)M的诱饵表达载体筛选果蝇cDNA文库,共发现40个可能与C(2)M相互作用的蛋白,包括多种DNA及组蛋白结合蛋白、ATPase、转录调节因子。从筛选的结果中,选取wech和Psf1基因构建了转基因果蝇,并在生殖细胞中进行了基因沉默,结果显示联会复合体的消失受到延迟。上述结果表明Wech和Psf1蛋白可能与C(2)M形成复合物,共同参与联会复合体的形成或其稳定性的维持。     

利用酵母双杂交系统筛选水稻类受体激酶OsWAK50胞内域相互作用蛋白

细胞壁连接的类受体激酶(wall-associated kinase,WAK)是植物细胞中一类特有的类受体激酶基因亚家族,因其胞外域与细胞壁紧密相连而得名．水稻中共有125个OsWAK基因,OsWAK50编码的蛋白质具有胞外域、跨膜域和激酶域,呈现典型的WAK样受体激酶特征．首先通过对OsWAK50-GFP融合蛋白的观察发现OsWAK50定位于细胞膜并且与细胞壁偶联．进而通过酵母双杂交系统筛选到了20个可能与OsWAK50胞内域相互作用的候选蛋白,并通过一对一酵母转化验证了OsSK4、OsSWIB和OsSWI3C全长均可与OsWAK50胞内域相互作用．进一步分析显示,OsSWIB能够直接与OsWAK50激酶域互作,而OsSK4和OsSWI3C与OsWAK50胞内域的互作是依赖于OsWAK50 C端的．研究还表明,OsSK4和OsSWIB亦能与OsWAK50同源基因OsWAK53a结合,而OsSWI3C则不能与OsWAK53a结合．双分子荧光互补实验证明,OsSK4与OsWAK50和OsWAK53a能够在植物体内发生互作．以上结果为阐明OsWAK50发挥功能的分子机制提供了重要线索．     

采用酵母双杂交系统筛选GmDREB5的互作蛋白

以无自激活活性的GmDREB5蛋白73～226位氨基酸区段为诱饵,采用酵母双杂交系统筛选干旱处理5 h大豆cDNA文库.结果发现:一个互作蛋白含有保守的TPR(Tetratricopeptide repeat)结构域,与拟南芥的TPR蛋白仅有14%的相似性,说明其可能是一类新的大豆TPR蛋白,将其定名为GmTPR1;表达特性分析表明,GmTPR1基因受干旱、低温、高盐、ABA的诱导;证明GmTPR1不仅参与植物对非生物胁迫的响应,同时参与对GmDREB5蛋白水平的调控.