神经干细胞的分化影响其对肝细胞生长因子的趋化性迁移

神经干细胞（neural stem cells,NSCs）的定向迁移对神经系统发育和损伤后修复至关重要,但NSCs的定向迁移与NSCs的分化之间的关系鲜有研究。该研究以此为切入点,以肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）为趋化因子,神经干细胞系C17．2为研究对象,首先,建立了不同分化阶段的NSCs（分别分化0,12,24,72h）的分化模型;其次,运用Boyden chamber和Dunn chamber研究了不同分化状态下的NSCs对HGF的趋化性迁移。Boyden chamber结果显示：下室加入HGF后,分化12,24h的NSCs迁移至膜下方的细胞数目显著高于分化0,72h的NSCs;Dunn chamber结果显示：分化12,24h的NSCs迁移效率显著高于分化0,72h的NSCs。这些结果表明,NSCs的分化影响其对HGF的趋化性迁移,为在临床上更有效地利用NSCs治疗各种神经系统退行性疾病提供了理论依据。     

不同分化状态下间充质干细胞向血管内皮生长因子的迁移

目的:探讨间充质干细胞(MSCs)对趋化因子VEGF的定向迁移能力与其分化状态之间的关系。方法:本实验运用采用Percoll分离法在体外培养并扩增大鼠骨髓来源MSCs,应用抗氧化剂诱导方案诱导MSCs向神经样细胞分化,运用Boyden chamber及Dunn chamber趋化性迁移装置研究了在趋化因子VEGF诱导下不同分化状态的间充质干细胞定向迁移,比较了各分化状态下细胞的迁移速度和迁移效率。结果:Boyden chamber实验结果显示下室加入不同浓度VEGF后,不同状态细胞向同一浓度VEGF迁移的数量不同,不同浓度VEGF诱导同一状态细胞的迁移数量也不同;Dunn chamber的实验结果显示在某一分化阶段(预诱导24小时)的MSCs具有更高的迁移效率。结论:MSCs的分化影响了其向VEGF的定向迁移,也就是说,不同分化状态的MSCs显示出不同的迁移行为。     

人类多能干细胞向脊髓前角运动神经元定向分化方法研究进展:从发育生物学到临床转化

人类多能干细胞(human pluripotent stem cell,hPSC)包括人胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)及人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC),它们具有向人体多种类型细胞分化的潜能。近年来,其体外定向分化为脊髓前角运动神经元的研究取得了一定进展。该文基于对神经发育的理解,回顾总结了hPSC向脊髓前角运动神经元定向分化的研究进展,并介绍了它们在研究人类神经发育、对疾病进行体外建模和细胞替代疗法方面的应用。     

牛精原干细胞体外分化潜能的分析

家畜精原干细胞操作的核心技术是精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)的长期培养。至今家畜精原干细胞的长期培养方法还没有完善。其中的一个原因是缺乏简便有效的家畜精原干细胞生物活性鉴定手段。该研究的目的是建立一种牛精原干细胞生理潜能的体外分析方法,用于体外培养的牛精原干细胞的生物活性鉴定。首先培养牛精原干细胞,进而用干细胞因子(stem cell factor,SCF)对体外长期培养的牛精原干细胞进行诱导分化。在诱导分化过程中对细胞进行显微观察,并且用免疫荧光染色法鉴定分化的细胞。观察结果显示,经过诱导培养8 d后,牛精原干细胞形态发生了明显改变;细胞的运动行为显示出精母细胞特有的特征。免疫荧光染色结果显示,分化的细胞表达精母细胞的标记基因Scp3。上述结果例证了体外培养的牛精原干细胞具有分化为精母细胞的潜能。该研究建立了牛SSCs体外诱导分化的分析方法,用于鉴定体外培养的牛SSCs的生理潜能。但是体外诱导培养条件不能满足牛SSCs减数分裂的全部要求,导致出现一些不完全符合精母细胞特征的现象。诱导分化培养液尚需改进。     

沉默ABCE1对神经胶质瘤细胞U251增殖、迁移和凋亡的影响北大核心CSCD

三磷酸腺苷结合盒蛋白E1(ABCE1)是ATP结合盒蛋白亚家族成员之一,在病毒感染、细胞增殖、抗凋亡、翻译起始和核糖体生物发生等过程中发挥重要作用。为了探讨ABCE1对神经胶质瘤细胞U251增殖、迁移和凋亡的作用,本研究通过实时荧光定量PCR和免疫印迹实验,检测ABCE1在神经胶质瘤细胞和正常胶质细胞中的mRNA和蛋白质表达水平。结果显示,ABCE1在神经胶质瘤细胞U251中的表达高于在正常胶质细胞中的表达。利用siRNA靶向沉默ABCE1后,在神经胶质瘤细胞U251中,ABCE1 mRNA和蛋白质的表达水平均显著减少,细胞的凋亡率显著提高,细胞增殖和迁移明显受到抑制,而且细胞对化疗药物替莫唑胺的敏感性增强。此外,沉默ABCE1后使Bcl-2的mRNA和蛋白质表达水平显著下调,而Bax的mRNA和蛋白质表达水平显著上调。以上结果表明,ABCE1与神经胶质瘤细胞的增殖和迁移密切相关,通过siRNA靶向沉默ABCE1基因,可显著降低U251细胞的增殖和迁移能力。     

CCR5基因转染对骨髓源神经干细胞生物学行为的影响

骨髓源神经千细胞（bonemarrow—derived neural stem cells,BM—NSCs）具有自我更新和分化为神经元与神经胶质细胞的潜能,可用于修复治疗多种神经系统退变与损伤性疾病。但由于其表面缺乏趋化因子受体,移植后向中枢病变部位迁移的速度较慢,疗效欠佳。该研究构建了趋化因子受体CCR5基因,并转染BM—NSCs,用免疫荧光细胞化学法、流式细胞胞仪法及Boyden小室细胞趋化实验,体外研究了CCR5高表达对BM-NSCs增殖、分化与迁移能力的影响。结果表明,CCR5高表达能显著增强BM．NSCs~O趋化能力,而不影响其自我更新和分化为神经元与神经胶质细胞的能力,说明其植入体内后可保持细胞替代与神经修复作用,并能快速大量迁移到病灶部位,显著增强疗效。     

胚胎神经干细胞移植及胶质细胞源性神经营养因子对大鼠脊髓损伤的修复作用

将胚胎神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植至成年大鼠损伤的脊髓,观察移植后NSCs的存活、迁移以及损伤后的功能恢复。实验结果显示：动物NSCs移植4周后,斜板实验平均角度和运动评分结果比对照组均有明显增高(P＜0．05),而脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)处的空洞面积显著减小(P＜0．05);在NSCs中加入胶质细胞源性的神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)后,上述改变更加显著。移植后的NSCs不仅能存活,而且向损伤的头端和尾端迁移达3mm之远。这些结果表明,移植的NSCs不仅可以存活、迁移,还可减小SCI空洞面积,促进动物神经功能的恢复;此外,我们的结果还表明GDNF对SCI功能恢复有促进作用。     

胎牛雄性生殖干细胞源类ES细胞的分离培养与多能性研究

雄性生殖干细胞(male germ stem cells , mGSCs)来源于原始生殖细胞(primordial germ cells ,PGCs) ,且终生存在于性分化后的睾丸中。从20周胎牛分离睾丸细胞,2步连续贴壁速率差法能有效纯化胎牛mGSCs ,经流式细胞仪检测,CD9阳性细胞的比例达到95.8 %。原代与支持细胞共培养,出现隆突状和鸟巢状两种细胞集落。获得1株传至4代仍呈现集落生长的细胞株,且集落AKP染色阳性。对第3代鸟巢状细胞集落免疫组化和诱导分化分析,结果显示:SSEA1和Oct-4免疫组化染色阳性;短期内可自发形成c-kit染色阳性的分化态精原细胞;定向诱导分化形成了表达神经丝蛋白(Neuro filament ,NF)的神经样细胞和表达α-actin的心肌样细胞团。试验结果表明:20周胎牛雄性生殖干细胞在体外可形成具有多分化潜能性的类胚胎干(embryonic stem,ES)细胞。     

胎牛雄性生殖干细胞源类ES细胞的分离培养与多能性研究

雄性生殖干细胞（male germ stem cells, mGSCs）来源于原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs),且终生存在于性分化后的睾丸中。从20周胎牛分离睾丸细胞,2步连续贴壁速率差法能有效纯化胎牛mGSCs,经流式细胞仪检测,CD9阳性细胞的比例达到 95.8%。原代与支持细胞共培养,出现隆突状和鸟巢状两种细胞集落。获得1株传至4代仍呈现集落生长的细胞株,且集落AKP染色阳性。对第3代鸟巢状细胞集落免疫组化和诱导分化分析,结果显示：SSEA1和Oct-4免疫组化染色阳性;短期内可自发形成c-kit染色阳性的分化态精原细胞;定向诱导分化形成了表达神经丝蛋白(Neuro filament,NF)的神经样细胞和表达α-actin的心肌样细胞团。试验结果表明：20周胎牛雄性生殖干细胞在体外可形成具有多分化潜能性的类胚胎干（embryonic stem, ES）细胞。     

沉默ABCE1对神经胶质瘤细胞U251增殖、迁移和凋亡的影响

ABCE1是ATP结合盒蛋白亚家族成员之一,在病毒感染,细胞增殖,抗凋亡,翻译起始和核糖体生物发生等过程中有重要的作用。为了探讨ABCE1对神经胶质瘤细胞U251增殖、迁移和凋亡的作用,本研究通过实时荧光定量PCR和免疫印迹实验检测ABCE1在神经胶质瘤细胞和正常胶质细胞中的mRNA和蛋白质表达水平,结果发现ABCE1在神经胶质瘤细胞U251中的表达高于在正常胶质细胞中的表达。利用siRNA靶向沉默ABCE1后,神经胶质瘤细胞U251中ABCE1 mRNA和蛋白的表达水平均显著减少,细胞的凋亡率显著提高,细胞增殖和迁移明显受到抑制,而且细胞对化疗药物替莫唑胺的敏感性增强。此外,沉默ABCE1后,Bcl-2的mRNA和蛋白质表达水平显著下调,而Bax的mRNA和蛋白质表达水平显著上调。以上研究结果表明,ABCE1与神经胶质瘤细胞的增殖和迁移密切相关,通过siRNA靶向沉默ABCE1基因可显著降低U251细胞的增殖和迁移能力。     

Nurr-1基因转染促进脂肪干细胞的神经分化

目的:研究孤儿核受体相关基因1(Nurr-1)对脂肪干细胞(adipose tissue-derived stem cells,ADSC)向神经元方向分化的潜在作用。方法:流式细胞术与成骨、成脂诱导技术鉴定脂肪干细胞;Nurrr-1基因转染脂肪干细胞后,应用神经特异性标志物MAP-2,β-tubulin的免疫荧光染色评估其向神经方向分化的能力。结果:流式细胞术结果表明培养的细胞CD29,CD44表达90%以上,CD45,CD90表达均低于1.5%,经过诱导后,油红O、茜素红S染色均呈阳性,表明所培养的细胞为脂肪干细胞;慢病毒转染Nurr-1基因后,免疫荧光染色检测MAP-2,β-tubulin的免疫荧光强度显著增加;RT-PCR结果显示Nurr-1转染的脂肪干细胞的MAP-2、β-tubulin、NF200的表达量显著提高。结论:Nurr-1基因转染能促进脂肪干细胞向神经方向分化,为神经损伤和神经退行性病变的治疗提供了新途径。     

川芎嗪体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

为了探讨川芎嗪体外诱导小鼠骨髓间质干细胞（BMSCs）分化为神经元样细胞的作用,以小鼠骨髓间充质干细胞为研究对象,实验分为空白对照组、β-巯基乙醇（BME）阳性对照组和川芎嗪诱导组。采用荧光免疫化学和Western blot方法,分别检测神经干细胞巢蛋白（nestin）和经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达;RT-PCR检测诱导不同时间对神经细胞相关基因Nestin、NSE、β-微管蛋白III（β-Tubulin III）和核受体相关因子-1（Nurr1）mRNA表达的影响。结果显示川芎嗪诱导间充质干细胞24 h后,细胞形态发生显著改变,细胞突起形成且数目不等,形成神经元样细胞。细胞死亡率低于β-巯基乙醇诱导组。免疫荧光化学法和western blot结果显示：川芎嗪诱导后的细胞nes-tin和NSE蛋白表达呈阳性,且表达丰度显著高于β-巯基乙醇诱导组。川芎嗪作用不同时间的BMSCs表达神经细胞相关基因Nestin、β-Tubulin III、NSE和Nurrl。结果表明川芎嗪能定向诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,是较理想的诱导剂。     

Nogo—p4与NgR结合抑制神经干细胞分化为双极形星形胶质细胞的突起生长

目的观察Nogo—p4是否通过与NgR结合的途径对大鼠脊髓来源神经干细胞分化形成双极形星形胶质细胞突起长度产生抑制。方法取4只出生24h内的Wistar大鼠,悬浮培养法培养大鼠脊髓来源的神经干细胞。把神经干细胞分为A、B、C、D四组,A组加入血清,B组加入血清和Nogo—p4,C组神经干细胞经RNA干扰沉默NgR基因后加入血清分化,D组神经干细胞经RNA干扰沉默NgR基因后加入血清和Nogo—p4。分化第7d,GFAP抗体标记星形胶质细胞,使用Image—ProPlus5．0软件测量双极形星形胶质细胞突起长度。结果神经干细胞分化第7d,四组均可形成双极形星形胶质细胞。B组中双极形星形胶质细胞的突起长度明显短于其它各组。A、C、D组中双极形星形胶质细胞的突起长度没有显著差异。结论Nogo—p4经与NgR结合途径显著抑制脊髓来源神经干细胞分化成的双极形星形胶质细胞的突起生长。     

人源胚胎神经干细胞移植可对抗大鼠的脑缺血/再灌注损伤

本文旨在研究人源胚胎神经干细胞(human embryonic neural stem cells,h NSCs)移植到脑缺血/再灌注损伤大鼠脑内后的迁移、分化,以及对大鼠脑卒中的疗效。我们在大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)1 h的大鼠模型上,于血流再灌注后第7天注射h NSCs到缺血侧侧脑室,通过焦油紫染色测量大鼠的脑梗死体积,通过检测大鼠的感觉运动行为评估其神经功能的恢复水平,通过免疫荧光共标观察移植后的h NSCs在脑内的迁移与分化。结果显示,h NSCs移植后能够显著减小脑卒中大鼠脑梗死体积,并改善脑卒中大鼠的转棒、错步和转角等运动行为能力;侧脑室注射的h NSCs优先向胼胝体以及梗死区周边迁移,迁移到胼胝体的h NSCs可以分化成少突胶质细胞和星形胶质细胞,迁移到梗死区周边的细胞能够分化成神经元。以上这些结果提示,侧脑室移植的h NSCs可能通过向特定脑区的迁移和分化发挥对脑缺血/再灌注损伤大鼠的保护作用。     

小鼠胚胎干细胞定向分化为神经干细胞过程中microRNA的变化

目的用生物芯片技术分析胚胎干细胞定向分化为神经干细胞过程中microRNA(miRNA)的表达变化,筛选调控的分化的miRNA,研究分化调控机制。方法胚胎干细胞在含LIF培养基中培养3d后,采用经典5步培养方法定向诱导向神经干细胞分化,采用nestin作为神经干细胞标记进行鉴定,送检胚胎干细胞及神经干细胞,提取总RNA以及小分子RNA,经荧光标记后与miRNA基因芯片杂交,获得胚胎干细胞诱导前后miRNA表达谱。结果1)胚胎干细胞在含LIF培养过程中保持未分化状态,Oct-4、碱性磷酸酶表达阳性;2)经典五步法诱导胚胎干细胞定向分化为神经干细胞,nestin阳性细胞为85%;3)通过基因微阵列分析,有90个miRNA的改变显著,其中68个表达上调,22个表达下调。结论miRNA可能对胚胎干细胞定向分化为神经干细胞过程起到关键作用。     

苦参碱引起C6胶质瘤细胞凋亡及其对TRADD表达的影响

目的:应用一系列分子生物学检测技术采检测苦参碱对胶质瘤细胞中TRADD表达的影响,以进一步推测其诱导胶质瘤细胞凋亡的作用机制.方法:采用MTT法测定不同浓度苦参碱作用于C6胶质瘤细胞后的吸光值以计算其抑制率:采用Annexin/FITC染色进行流式细胞术检测来测定不同浓度苦参碱诱导C6胶质瘤细胞的凋亡率;采用ICC(免疫细胞化学)、Westem-blotting及Real-timePCR array(实时定量PCR芯片)方法来检测苦参碱对胶质瘤细胞TRADD表达的影响.结果:MTT结果显示细胞抑制率随着药物剂量的增加而增加;Annexin/FITC染色进行流式细胞术的检测结果显示胶质瘤细胞的凋亡率随着药物剂量的增加而增加;ICC、Western-blotting及Real-time PCR array结果显示苦参碱可诱导胶质瘤细胞TRADD基因及蛋白表达的上调.结论:苦参碱可以诱导胶质瘤细胞凋亡,其诱导胶质瘤细胞凋亡可能是通过上调TRADD的表达,以死亡受体途径来实现的.     

神经干细胞向少突胶质前体细胞的定向分化诱导

本研究采用神经胶质瘤细胞株(B104 neuroblatoma cells,B104 cells)培养上清(B104CM)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF),将冷冻复苏的大鼠胚胎脊髓神经干细胞(neural stem cells,NSCs)定向诱导为少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precusor cells,OPCs)。形态学和免疫组化的结果显示,诱导后95％以上的细胞具有双极或多极突起的典型OPCs形态,并表达A285和血小板源生长因子受体-α(platelet derived growth factor receptor-α,PDGFR-α等0PCs标志,所有PDGFR-α阳性的OPCs均不表达β-Tublin Ⅲ,其中仅少量细胞表达胶质原纤维酸性蛋白(glia fibrillary acidic protein,GFAP)。在B104CM和bFGF共存的培养条件下,悬浮培养的OPCs可大量增殖形成少突胶质细胞球,该细胞球可通过传代继续扩增,且扩增的OPCs仍能维持其特有的形态和自我增殖的特性。撤去bFGF和B104CM后,OPCs能进一步分化为成熟的少突胶质细胞(oligodendrocytes,OLs)或Ⅱ型星形胶质细胞。实验表明,诱导NSCs产生的OPCs在形态、增殖以及分化格局等方面均与已报道的存在于胚胎脑区的O-2A前体细胞相类似。该培养系统可为实验性细胞移植的研究提供丰富的细胞来源。     

不同ES细胞系体外定量神经分化的比较

利用视黄酸(RA)诱导小鼠胚胎干细胞通过悬浮类胚培养法体外定量分化为神经样细胞.结果显示能够进行种系嵌合的MESPU22细胞系与不能进行种系嵌合的MESPU13细胞系的体外神经分化比例在统计学上没有明显差异.此结果对于人的胚胎干细胞全能性的鉴定与检测有重要启示。 Abstract: Murine embryonic stem cells were induced to differentiate into neuron-like cells by all-trans Retinotic Acids through embryoid body culture. The results indicate that there is no obvious difference between MESPU22 cell line which is highly germline competent and MESPU13 cell line which has no germline competence. The result has important illumination on the identity of the totipotence of human embryonic stem cells.     

胎胰源性Nestin阳性细胞向多巴胺能细胞元定向诱导分化的研究

目的：探讨胎儿胰岛源性Nestin（神经上皮干细胞蛋白）阳性干细胞分化为多巴胺能神经元的潜能。方法：用胶原酶消化法分离胎儿胰岛,贴壁培养后获得增殖力旺盛的细胞;用免疫组化法、免疫荧光法分别检测其增殖细胞核抗原（PCNA）及神经干细胞标志物Nestin的表达;用流式细胞术测定Nestin阳性细胞的比例;经N2培养液筛选后,分别用SHH（sonichedgehog）蛋白、成纤维细胞生长因子（FGF）8、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和脑源性神经营养因子（BDNF）向多巴胺能神经元定向诱导,检测诱导细胞的多巴胺能神经元标志酪氨酸羟化酶（TH）和芳香左旋氨基酸脱羧酶（AADC）的表达情况。结果：免疫荧光显示,从胎儿胰岛分离的干细胞表达PCNA和Nestin;流式细胞术检测Nestin阳性率达13．74％;筛选后向神经细胞定向诱导分化,细胞表达TH和AADC。结论：从胎儿胰岛中可以分离出Nestin阳性的神经干细胞,该细胞具有向多巴胺能神经元定向分化的能力。     

人胚胎干细胞高效分化为巨核细胞模型的建立

人胚胎干细胞具有无限增殖潜能,且能够分化为包括巨核细胞在内的大多数的成熟血细胞。因此,为解决临床治疗血小板来源不足而建立一种由人胚胎干细胞高效分化获得成熟巨核细胞的分化模型具有重要应用前景。该文利用人胚胎干细胞与m AGM-S3基质细胞系共培养进行早期造血前体细胞的定向分化,并在分化第14 d获得大量"卵石样"造血前体细胞(CD43+细胞、CD45+细胞)。将"卵石样"造血前体细胞分离后,用无血清培养基分阶段添加SCF、TPO、IL-6、IL-3、FLt-3、IL-11等细胞因子进行巨核细胞定向诱导分化。结果显示,在分化的第3 d,CD41a+细胞比例可高达48.5%,CD42b+细胞比例可高达30.0%。对分化第6 d的细胞进行Wright-Giemsa染色,可见形态典型的巨核细胞。综上所述,该研究初步建立了一种人胚胎干细胞高效分化为巨核细胞的模型,为体外获得大量巨核细胞奠定了基础。