药用级微生物谷氨酰胺转胺酶的纯化工艺研究

为了提高谷氨酰胺转胺酶的纯度和扩展在医药领域的应用,探索了一种适合工业化生产的、安全高效的微生物谷氨酰胺转胺酶纯化方法。轮枝链霉菌发酵后,经离心10 000 r/min 4℃除去菌体,调节发酵液电导率至4.1mS/cm和pH6.0后,以直线流速60cm/h通过SP Sepharose FF阳离子交换层析柱对目的蛋白高 选择性和高载量地捕获,再通过phenyl sepharose 6 FF（high sub）疏水层析柱进行精细纯化。纯化后经SDS-PAGE鉴定纯度达到95%以上,HPLC分析纯度> 99%。鲎试剂测定内毒素含量为0.013EU/ml,达到中国药典中血制品要求的低于0.15EU/ml标准。     

水稻锌指蛋白OsRZ3基因克隆及融合蛋白的原核表达、纯化

根据NCBI登录的水稻锌指蛋白基因(NO.AK062094,OsRZ3 gene)设计特异引物,通过RT-PCR克隆该基因cDNA全长序列,核苷酸测序并比对氨基酸同源性表明具有C2HC-锌指结构域、分析预测蛋白质分子量为34kD和等电点为9.05;拟南芥原生质体亚细胞定位检测表明其在细胞核。构建pGEX6P-3::OsRZ3融合载体,电转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株经1 mmol·L-1IPTG小量诱导表达,SDS-pAGEX蛋白电泳表明60 kD融合蛋白4 h最大;在LB液体培养中0.5 mmol·L-1IPTG过夜大量诱导表达,通过GST吸附柱层析获得大量包涵体纯化蛋白,1L菌液可诱导纯化到浓度1.58 mg·mL-1包涵体融合蛋白。所构建的融合蛋白原核表达系统能有效表达pGEX6P-3::OsRZ3融合蛋白,0.5 mmol·L-1IPTG大量诱导,通过GST柱吸附获得包涵体纯化蛋白,为作进一步的抗体制备和染色质免疫共沉淀等DNA结合的特性研究准备了基础。     

人sTNFR1基因的克隆、融合表达与生物学活性

采用RT-PCR,从Hela细胞的mRNA中扩增人sTNFR1基因,构建含有目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆,转化入大肠杆菌,测序证实其序列与基因数据库中sTNFR1基因一致。经异丙基-β-D半乳糖苷酶（IPTG）诱导表达,淀粉树脂亲和层析法纯化,得到融合蛋白sTNFR1-MBP。结果显示：经Western-blotting检测,sTNFR1-MBP具有免疫活性;MTT检测目的蛋白可有效地封闭TNFα对QSG7701的细胞毒性作用;流式细胞术检测目的蛋白对TNF-α诱导QSG7701凋亡有抑制作用;sTNFR1-MBP具有良好的生物活性,为今后的研究打下了基础。     

eEF1A1基因克隆、原核分泌表达及融合蛋白纯化

eEF1A1作为蛋白合成中的重要翻译延伸因子,可与多种功能性蛋白如F-actin、BPOZ-2结合,并在细胞凋亡、蛋白降解方面起重要作用.以往原核基因工程蛋白表达系统大多为包涵体表达的变性分子,需要复性.为了获得eEF1A1原核分泌性可溶性蛋白分子,克隆了人eEF1A1蛋白编码序列(约1 300 bp),并成功构建pET22b-A原核分泌表达重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,0.4 mmol/L终浓度IPTG诱导,经不同温度下包涵体与胞浆蛋白组分分析,快速明确蛋白表达情况,即诱导4 h后,37℃表达于包涵体组分,在30℃分泌表达至胞浆组分.通过His-Trap亲和层析纯化柱进行线性洗脱,Bradford法测定蛋白浓度高达620 mg/mL,SDS-PAGE分析纯度约为95%,蛋白大小符合50 kD,Western blotting显示目的蛋白能被eEF1A1抗体识别;质谱分析证实重组蛋白为人eEF1A1蛋白分子.为进一步研究其与重要功能性蛋白的相互作用及在细胞凋亡和蛋白降解中的作用奠定基础.     

重组人瘦素蛋白纯化鉴定及其单克隆抗体制备

大肠杆菌（E.coli）重组表达获得的重组人瘦素蛋白（rh-leptin）,复性、纯化后进行SDS-PAGE电泳和Western-blot印迹杂交鉴定其免疫学活性,免疫小鼠后制备单克隆抗体,结果表明通过对rh-leptin进行复性和纯化,获得了高纯度的具有免疫学活性的rh-leptin蛋白,并获得一株稳定分泌抗rh-leptin单抗的杂交瘤细胞株。瘦素蛋白的纯化及其单克隆抗体的制备,可供瘦素进一步研究应用。     

重组人EGF-IL-18融合蛋白的表达纯化及复性

融合基因EGF-IL-18与表达载体pET32a( )连接构建融合型原核表达质粒pET32a( )-EGF-IL-18。该基因在E.coliRosetta(DE3)中获得高效表达,SDS-PAGE分析表明表达产物大部分以包涵体形式存在。以2mol/L尿素和1%TritonX-100对包涵体进行反复洗涤后,利用离子交换柱层析对包涵体进行柱上复性,结果表明离子交换层析柱上复性不仅能够获得可溶性的EGF-IL-18融合蛋白,而且产物同时得到纯化,纯度大于90%。复性的EGF-IL-18经分子筛进一步纯化后,体外实验证明具有促进人外周血单个核细胞(PBMC)IFN-g基因表达的能力。该方法简单、高效,为进一步开展EGF-IL-18的动物实验及其大量纯化制备打下基础。     

vMIP-ⅡN端重组肽的表达纯化及活性鉴定

病毒巨噬细胞炎症蛋白-Ⅱ (viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)由卡波西肉瘤疱疹病毒编码,前期研究证明了vMIP-II N端21肽(NT21MP)选择性的阻断趋化因子CXCR4,从而抑制乳腺癌细胞趋化的活性。通过化学合成法获得编码vMIP-ⅡN末端的基因序列,与pGEX-KG（克隆位点的N 端有谷胱甘肽转移酶GST标签序列）连接构建原核表达载体,重组质粒在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中获得表达,免疫印迹显示重组蛋白GST-NT21MP主要在细菌裂解液上清中表达,可溶性部分经亲和层析、超滤、快速蛋白液相色谱（fast protein liquid chromatography,FPLC）纯化获得高纯度的GST-NT21MP蛋白。利用Transwell趋化试验测定GST-NT21MP的活性。结果显示,重组蛋白GST-NT21MP能够抑制乳腺癌细胞SK-BR-3的趋化活性,可作为治疗乳腺癌转移的潜在性靶向药物。     

融合蛋白NusA-hRI的高效异源表达、纯化及活性分析

人核糖核酸酶抑制因子 (human ribonuclease inhibitor, hRI) 是一种能够调节核糖核酸酶活性的酸性包浆蛋白。通过构建含SUMO、IF2、GST、NusA 、MsyB、Trx和 MBP融合标签的重组表达载体,以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌进行自诱导(auto-induction,AI)表达,从而使 hRI 的表达量得以提升。利用MagNi磁珠纯化及电泳分析hRI的表达状况,通过RNase/Sepharose亲和层析获得纯度较高的蛋白。纯化后获得的融合蛋白浓度为2 960.513mg/L,与其它公司的hRI活性进行比较,检测其酶活性约为50U/μl,并使其成功用于RNA的保护,为NusA-hRI的应用提供理论依据。     

SARS病毒S蛋白片段的克隆表达和纯化

以大肠杆菌表达载体pET22b为载体,直接表达SARS病毒S蛋白425-569及894-1033等2片段。表达所获得的包涵体形式蛋白经尿素溶解后分别经过2次离子交换层析,获得初步纯化。在酸性和低尿素浓度环境中,2种S蛋白片段极易沉淀。Western印迹鉴定显示其与抗SARS病毒血清呈阳性反应。获得的纯化蛋白可用于检验受体结合能力等研究。     

Cbl-b蛋白的重组表达、纯化和活性检测方法的建立

Cbl-b是一种重要的泛素连接酶E3酶,负责与多种底物蛋白的特异识别,并因此介导特定蛋白的降解。研究表明,Cbl-b缺失可激活自然杀伤细胞,从而阻止肿瘤的扩散转移,因此Cbl-b被认为是一种肿瘤免疫治疗的新靶点。但目前针对Cbl-b蛋白的生化性质以及体外活力测定方法研究较少。本研究构建了Cbl-b不同结构域的重组表达载体。通过对其表达和纯化条件进行优化,确定了Cbl-b的底物结合功能域的最优表达条件,即使用感受态BL21(DE3),在IPTG浓度为0.5 mmol/L、温度25℃下诱导10 h。利用亲和柱和分子筛层析联用纯化方法,提纯得到大小为65 kD的GST-Cbl-b(39~368)重组蛋白,其纯度可达95%。进一步,通过药物设计方法,设计并合成带有荧光素标记的Cbl-b底物Cblin-FAM,并利用配体结合实验验证了Cbl-b(39~368)结合底物的活力。本研究得到了具有活力的Cbl-b底物结合功能域并建立了其体外表达纯化方法,为后续发展基于Cbl-b纯酶的体外泛素化检测方法,以及发展新型、特异靶向Cbl-bE3酶的调控物提供了物质基础。     

HBx-EGFP-TLM融合蛋白表达载体的构建、蛋白表达纯化及活性检测

乙型肝炎病毒X蛋白 (HBx) 具有广泛的转录激活作用,但是由于细胞类型和实验条件的差异,外源启动子介导的HBx瞬时表达水平常表现出不均一性,为其功能的研究带来困难。为了解决HBx研究过程中遇到的这些难题,利用PCR扩增获得HBx及含转导肽TLM的EGFP编码序列,经酶切后插入pGEX-4T-1原核表达载体,成功构建重组质粒pGEX-HBx-EGFP-TLM和pGEX-EGFP-TLM。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞,融合蛋白经IPTG诱导表达,采用?KTATM Purifier 蛋白纯化系统纯化并进行SDS-PAGE和Western blotting分析,确定为目的蛋白。将纯化后的融合蛋白分别与AML12和SMMC-7721细胞共孵育,Western blotting和激光共聚焦显微镜检测证实TLM转导肽能够介导HBx-EGFP和EGFP进入细胞,同时进入细胞的HBx-EGFP-TLM能够发挥转录激活活性,为HBx功能的深入研究奠定了基础。     

干扰素-β1b的高效表达、纯化及抗病毒活性研究

IFN-β1b是大肠杆菌产生的17位Cys被Ser替换的人IFN-β的类似物,为了获得高表达,使用了大肠杆菌的偏爱密码子,人工合成了IFN-β-1b基因,插入质粒pBV220中,转化大肠杆菌DH5α.IFN-β1b的制备过程,包括发酵和一系列的纯化步骤.经修饰,IFN-β1b基因在启动子PRPL控制下发酵表达,合成的蛋白质以包涵体的形式存在.培养的细菌经收集、裂解后,将包涵体释放出来,包涵体经含SDS的溶液溶解,DTT还原.纯化过程包括有机溶剂抽提、分子筛层析、脱盐、氧化复性和反相层析,并用旋转蒸发除去有机溶剂.IFN-β-1b在不同种系来源的细胞上显示不同的抗病毒活性.     

山羊Klf4基因克隆、原核表达和His-Klf4融合蛋白纯化北大核心CSCD

旨在克隆山羊Klf4基因,构建重组质粒pET30a-Klf4,通过原核表达技术获得纯化的His-Klf4融合蛋白。从山羊的生殖脊中提取总RNA,用RT-PCR的方法扩增Klf4基因编码区序列,通过TA克隆构建pMD18-T-Klf4重组质粒。酶切鉴定与测序分析后将Klf4的cDNA亚克隆至pET-30a载体,构建重组质粒pET30a-Klf4。酶切鉴定后将其导入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测确认,镍离子金属螯合亲和层析法纯化His-Klf4融合蛋白。结果表明:(1)从山羊生殖脊中克隆了Klf4基因,其开放阅读框由1 434个核苷酸组成,编码478个氨基酸,而且该序列与绵羊的同源性最高,达到98.5%;(2)经过SignalP 4.0在线分析,Klf4的编码蛋白不存在信号肽;(3)经SDS-PAGE和Western blotting分析表明,重组质粒pET30a-Klf4在大肠杆菌中得以表达;在变性条件下纯化,获得了His-Klf4融合蛋白。     

PTD-BDNF融合基因克隆、表达和纯化

构建含蛋白转导结构域(PTD)与脑源性神经营养因子(BDNF)融合基因的质粒,并在大肠肝菌中表达。用PCR扩增PTD-BDNF融合基因,经DNA测序无误后插入表达质粒pJW2构建质粒pJPB,转化大肠杆菌并进行PTD-BDNF蛋白的诱导表达和纯化。结果DNA序列分析表明构建含有PTD-BDTF融合基因的质粒与设计相同,PTD-BDNF融合蛋白在大肠杆菌中获得表达并进一步纯化。     

两步柱色谱法纯化 CHO 表达的重组人β神经生长因子（β-rhNGF）

基因重组技术生产蛋白药物较传统提取生产方式具有诸多优点。本文运用一步离子交换色谱层析（Sepharose Fast Flow）和反相(C4)色谱层析串联纯化了CHO 工程细胞株分泌表达的重组人β 神经生长因子（β-rhNGF）,纯化产物经SDS-PAGE及反相HPLC 分析纯度均达到 95% 以上,生物学活性经 PC12 细胞和鸡胚背根神经节测定均与 Sigma 标准品无差异。产物经两步纯化后的收率达70% 以上,为建立该产品切实可行的工业化纯化工艺提供了依据。     

十二节杆菌胞外脂肪酶的纯化和性质研究

十二节杆菌发酵得到的胞外脂肪酶,在5L发酵罐经过34h培养,最高酶活可达75 U/mL。通过硫酸铵梯度沉淀和疏水层析纯化,脂肪酶纯化26倍,总得率24.3%。SDS-PAGE显示脂肪酶分子量为33 kD,脂肪酶在40℃和pH 7.0时酶活力最高,同时在24℃经过48h仍保持一半左右的活力。该脂肪酶的酶活受K ,Mg2 激活,而受Zn2 与Co2 的抑制。     

人血浆载脂蛋白A-Ⅱ的分离纯化及鉴定

 用硫酸右旋糖酐沉淀法和超速离心法从正常人血浆制备高密度脂蛋白(HDL)。脱脂后经制备性等电聚焦和Sephacryl S-200层析分离纯化载脂蛋白A-Ⅱ(apolipoprotein A-Ⅱ,简称apoA-Ⅱ)。经鉴定SDS-PAGE呈一条谱带,其亚基分子量为8700±280(n=4),等电点为4.80—5.17,氨基酸组成分析不含组氨酸和精氨酸,与抗apoA-Ⅱ血清发生特异免疫反应。     

重组小鼠IL-33成熟蛋白的原核表达、纯化及活性检测

目的为了在大肠埃希菌中表达具有生物学活性的小鼠IL-33成熟蛋白。方法利用PCR技术从pc DNA3.1-IL-33质粒中扩增小鼠IL-33成熟蛋白的基因,将其插入原核表达载体p ET21a(+),构建成p ET21a-m IL-33质粒,转化至大肠埃希菌BL21,筛选出可表达m IL-33的大肠埃希菌工程菌株。经IPTG诱导表达,用镍柱亲和层析法纯化。结果经SDS-PAGE分析获得纯度高达95%的m IL-33蛋白,相对分子质量18 000。ELISA试验显示m IL-33可以有效的促进肠系膜淋巴细胞产生Th2型细胞因子(IL-5),与未处理组的差异具有显著的统计学意义。结论利用大肠埃希菌表达系统表达了具有生物活性的m IL-33蛋白,为继续开展IL-33在炎症性肠病的免疫治疗研究奠定了基础。     

细叶百合LpPEX5基因克隆及蛋白表达纯化

[目的]探究Lp PEX5蛋白表达与纯化的最佳条件。[方法]从细叶百合的鳞茎中克隆出过氧化物酶体生物合成蛋白基因(Lp PEX5),在详细分析该蛋白质同源氨基酸序列比对、进化树、保守区域,二级结构与三级结构预测等生物信息学后,构建到p QE-30原核表达载体上,转化大肠杆菌M15,通过SDS-PAGE凝胶电泳对不同诱导时间、诱导温度、IPTG浓度影响蛋白的表达量进行研究。利用亲核层析树脂纯化获得融合蛋白。[结果]成功克隆出Lp PEX5基因,构建p QE-Lp PEX5原核表达载体并且诱导和纯化出Lp PEX5蛋白。[结论]Lp PEX5蛋白的最佳诱导条件为30℃,1 mmol/L IPTG诱导5h。该研究为分析Lp PEX5蛋白的活性、验证蛋白间的相互作用等后续试验研究奠定了基础。