开发测定空中花粉的单克隆抗体

兴和和山形研究所卫生研究所开发用单克隆抗体测定室中浮游的杉花粉和丝柏花粉的方法,在10月18日京都召开的日本过敏症学会和国际过敏症学会上发表。花粉症近年来正迅速蔓延。现有方法还停留在用肉眼和显微镜观测在涂抹凡士林的载片上收集到的花粉。因此,必须很有经验,而且由于雨天花粉变形、切断的花粉等原因而难以估测。人们可采用单克隆抗体花粉测定法,测定过敏源,有可能更准确的预报花粉症。该公司用从杉花粉精制的主要过敏源、Cryj Ⅰ免疫小鼠,生产单克隆抗体。已获得只与杉花粉反应的     

用杉花粉变应原开始脱敏疗法的临床试验

林原生物化学研究所使用天然杉花粉变应原和多糖体的支链淀粉(α-1,4-;α-1,6＇-葡聚糖)的复合体疫苗,已开始脱敏疗法的临床试验。 临床试验的详细情况不明,但是在前临床试验时给小鼠和兔皮下使用杉花粉变应原和支链淀粉的复合     

深圳地区粉尘螨Ⅱ类变应原基因的多态性分析及其表达蛋白的变应原性鉴定

粉尘螨Ⅱ类变应原(Der fⅡ)是粉尘螨Dermatophagoides farinae主要变应原之一,可引发Ⅰ型变态反应。从深圳地区挑取活粉尘螨,经形态鉴定后纯培养,提取其总RNA,RT-PCR扩增出Der fⅡ 基因,克隆到pMD18-T载体后测序。通过计算机软件分析该基因的多态性。将该目的基因克隆到pET-His表达载体上得到重组质粒pET-Der fⅡ。工程菌经IPTG诱导培养,表达Der fⅡ目的蛋白,该蛋白主要以包涵体形式存在。重组Der fⅡ蛋白通过6His-tag蛋白纯化系统进行分离、纯化,并进行Western blot检测该重组蛋白与对粉尘螨过敏患者血清中IgE的反应性。结果表明,克隆的5株深圳地区的Der fⅡ 基因与GenBank公布的Der fⅡ(AB195580.1)核苷酸序列同源性为96.8%～99.3%,推导的氨基酸序列同源性为93.8%～98.6%。表达纯化的5种重组Der fⅡ蛋白经Western blot检测,表明都具有良好的变应原性。     

花生主要变应原Ara h2的克隆及原核表达

目的:在原核载体中克隆、表达花生主要变应原Ara h2,为其重组变应原应用研究奠定基础。方法:合成花生主要变应原Ara h2基因,设计特异性引物行PCR扩增,经Eco RⅠ、HindⅢ双酶切后与做相应酶切的pET-28a载体连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及测序分析,使用IPTG诱导融合蛋白表达,使用Ara h2特异性多克隆抗体对表达产物进行免疫印迹鉴定。结果:成功扩增了Ara h2基因,重组质粒双酶切见目的条带,基因测序显示Ara h2在正确开放阅读框中,基因长423bp,编码140个氨基酸,预测的等电点为5.3,分子量约16660.17 Da,基因比对分析显示其与相关报道的核苷酸序列一致性达100%。重组pET-28a-Ara h2/BL21经0.6 mmol/L IPTG诱导表达可见重组融合蛋白在相应分子量大量表达,使用Ara h2多克隆抗体免疫印迹法能检测到目的蛋白。结论:成功克隆、表达了花生主要变应原Ara h2,为其重组变应原应用研究奠定了基础。     

武汉地区老年变应性鼻炎现况分析研究

目的:通过研究老年变应性鼻炎患者年龄分布及变应原阳性率等变化,了解老年变应性鼻炎的发病趋势.方法:回顾性分析2006年至2010年武汉地区294例50～84岁的老年变应性鼻炎患者过敏原点刺试验结果,描述老年变应性鼻炎患者年龄分布及各变应原阳性率随时间变化的临床特征.结果:老年期患者(≥65岁)人数在受试老年患者总人数的比例随时间推移逐渐增加,但差异无统计学意义(P＞0.05).在5年间老年变应性鼻炎患者粉尘螨阳性率为历年最高,其次为屋尘螨,两者的阳性率在5年间差异不具有统计学意义(P＞0.05);艾蒿、豚草花粉、真菌Ⅰ组、真菌Ⅱ组阳性率改变均具有统计学意义(P＜0.05),其中艾蒿、豚草花粉阳性率呈逐年下降趋势,真菌Ⅰ组、真菌Ⅱ组阳性率呈上升趋势;多价兽毛阳性率有增长趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05);春季花粉Ⅰ组、春季花粉Ⅱ组阳性率均呈波动性改变,其中春季花粉 Ⅱ组差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:老年变应性鼻炎患者人数显示逐年增长趋势,尘螨过敏在老年患者中仍为最为常见的变应原,但无整体人群体现出的增长趋势,真菌阳性检出率呈现显著增长趋势,兽毛过敏有较弱升高倾向.     

豌豆肌动蛋白异型体基因的特异性表达

将分属三类豌豆（Pisum sativum）卷须肌动蛋白异型体（PEAc）的基因3'端进行了亚克隆,并利用限制性内切酶从中切聚了完整的3'非翻译区片段,将之做为特异性探针进行DIG标记,并对不同发育时间豌豆根、茎、叶及花粉中提取的总RNA进行点杂交分析。发现其中Ⅰ类（PEAcⅠ）和Ⅱ类（PEAcⅡ）在根、茎、叶中都有表达,但存在发育时间上的表达物质特异性,尤其中叶叶的差异较明显,Ⅲ类（PEAcⅢ）与前二者的差别更大,仅发现其有2d及28d的根、7d的茎及18d的叶中有表达。在花粉中,只有PEAcⅡ有少量的表达,说明在类异型体基因的表达还存在组织特异性。     

哈尔滨地区蒿属花粉过敏临床流行病学调查

目的:评估哈尔滨地区大籽蒿花粉、黄花蒿花粉、艾蒿花粉在蒿属花粉过敏人群中的分布情况.方法:在问诊疑似蒿属花粉过敏患者中,用大籽蒿花粉变应原点刺液、黄花蒿花粉变应原点刺液、艾蒿花粉变应原点刺液、阴性对照液、阳性对照液同时点刺诊断,通过测定点刺液与阳性对照产生丘疹面积的比值来判断患者对蒿属花粉的过敏程度,重点评估三种蒿属花粉在过敏人群中的分布情况.结果:306例问诊疑似蒿属花粉过敏患者中,272例病人通过点刺确诊为蒿属花粉过敏病人,并且对三种蒿属花粉变应原点刺均阳性.哈尔滨地区蒿属花粉过敏患者对三种蒿属花粉均过敏,不同病人对三种蒿属花粉反应性存在差异性.结论:大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原、艾蒿花粉变应原三种蒿属花粉变应原有交叉免疫原性,但也存在其特异性.     

美洲大蠊变应原Cr PI的表达、纯化与免疫学特性鉴定

以阳性噬菌体克隆为模板,通过PCR扩增出目的基因片段并克隆入T载体,经测序证实为美洲大 蠊Periplaneta americana变应原Cr PI后,将该基因亚克隆入表达载体pGEX-5X-1。美洲 大蠊变应原Cr PI在大肠杆菌中得到高效表达,但主要以包涵体形式存在于沉淀中。目的蛋白溶 于6 mol/L盐酸胍并经稀释复性后,经Glutathione Sepharose^TM4B亲和层析,纯度达 90%以上。以蟑螂过敏病人血清进行免疫印迹检测,结果显示重组变应原具有良好的IgE结合活 性。     

丙型肝炎病毒C区基因的克隆与分析

通过RT－PCR从1份来自甘肃武威地区献血员HCV阳性血清顺克隆到573bp的HCV核心基因全片段,用T－A克隆载体法将该片段接入克隆载体pUC19中并测序,结果表明武威地区分离株与Ⅰ型株HCV－Ⅰ和Ⅱ型株HCV－HeBei在该基因区段的核苷酸／氨基酸序列同源性分别为89.6%／95.4%、97.3%／97.4%,属于Ⅱ型株。     

红星梭子蟹变应原原肌球蛋白基因的克隆、表达及其免疫学鉴定

克隆、表达红星梭子蟹蟹肉中变应原原肌球蛋白（Tropomyosin）,并对其免疫学特性进行鉴定。RT-PCR克隆红星梭子蟹（Portunus sanguinolentus）蟹肉中变应原原肌球蛋白的全长基因,根据序列设计带有酶切位点的特异性引物,扩增蟹Tropomyosin的完整开放阅读框,与pET-28a载体连接并转化大肠杆菌Escherichia. coli BL21(DE3),诱导表达后,Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白,Western-blot检测其免疫学活性,胰酶消化后进行MALDI-TOF-MS质谱分析鉴定。克隆所得蟹Tropomyosin基因包括一个编码285个氨基酸的开放阅读框。序列分析结果显示所克隆得到的基因与已知虾、螨、蟑螂等的Tropomyosin变应原基因有较高的同源性（>80%）。根据变应原的命名规则,将其命名为Pors 1,并提交GenBank数据库,登录号为EF143836。重组蟹Tropomyosin在大肠杆菌中能高效的表达,表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化后进行Western-blot检测,结果显示该重组蛋白具有良好的免疫学活性,MALDI-TOF-MS质谱分析进一步证实了该重组变应原的正确性。本研究成功克隆和表达了红星梭子蟹变应原Tropomyosin,为蟹过敏性疾病的诊断和治疗奠定了基础。     

限制性内切酶SmaⅠ和HincⅡ存在切割序列多态性

ＰＣＲ扩增产物基因组Ｇ—ＣＳＦ基因被克隆至ｐＵＣ１９,在对其进行序列分析时发现,Ｓｍａ　Ⅰ和ＨｉｎｃⅡ共同使用对回收片段进行亚克隆时,有一段序列缺失,序列分析表明这可能是由于Ｓｍａ　Ⅰ和Ｈｉｎｃ Ⅱ同时使用造成的。Ｓｍａ　Ⅰ和Ｈｉｎｃ　Ⅱ可能存在切割序列多态性。     

眼虫Astasia longa类核纤层蛋白基因的初步研究

利用PCR和克隆测序技术,对眼虫Astasia longa的核纤层蛋白（lamin）基因进行了研究。参考多种相对较低等多细胞动物的已知序列,设计出扩增lamin基因尾部区的引物,扩增获得两个主要片段：序列Ⅰ（650bp）和序列Ⅱ（797bp）。测序分析表明,序列Ⅱ包含序列Ⅰ,并具有lamin基因尾部特征（编码“CaaX“序列的四种密码子 终止密码子）的序列片段。     

屋尘螨Ⅰ类变应原Der p1的体内定位

对过敏性疾病主要过敏原屋尘螨Dermatophagoides pteronyssinusⅠ类变应原（Der p1）进行了抗原定位研究。选用经表达和纯化的Der p1抗原蛋白,按常规方法免疫小鼠,分离血清获抗重组Der p1的抗体（Ⅰ抗）,用抗鼠IgG荧光抗体为Ⅱ抗,屋尘螨经石蜡切片,在荧光显微镜下对其特异性变应原的定位进行观察。HE染色显示屋尘螨消化系统占据大部分体腔。组织免疫荧光发现屋尘螨Ⅰ类变应原主要定位于螨的中肠组织及肠内容物,而螨的生殖系统、排泄系统等脏器以及几丁质甲壳均呈阴性反应。据此认为屋尘螨Ⅰ类变应原存在于螨的肠内容物和中肠组织中。     

抗丙型肝炎病毒NS3蛋白不同型单抗制备及应用

目的：制备抗丙型肝炎病毒NS3Ⅰ、Ⅱ型单克隆抗体,用于转HCV全长基因细胞免疫组化定位。方法:克隆表达HCV-NS3Ⅰ、Ⅱ型抗原,免疫Balb／C小鼠,通过细胞融合筛选分泌HCV-NS3Ⅰ、Ⅱ的细胞株,制备腹水,纯化IgG。结果：制备出3株抗HCV-NS3Ⅰ、Ⅱ单克隆抗体,有2株为IgG-1型,1株为IgG-2b型,对转HCV全长基因细胞进行免疫组化染色,胞浆为阳性。结论：制备的抗HCV-NS3Ⅰ、Ⅱ单抗具有良好的特异性。     

Dacrydium花粉在云南第四系的发现

泪杉(Dacrydium)化石花粉在云南第四系中常有发现,尤其在西双版纳傣族自治州勐海县距今2—3万年的湖相沉积中含量较高。伴随泪杉化石花粉的还有山毛榉科的几个属和罗汉松属等,反映了中山雨林植被面貌。泪杉现今主要生长于南半球至热带地区,我国仅有一种生长于海南岛海拔1,000～1,500m的中山雨林中。今日之云南省已无泪杉生长,而大量泪杉花粉在云南第四系中发现,表明了现今云南的气候条件与距今2—3万年以前有明显的差异,主要表现气温升高约1.5～3.5℃,年降雨量减少约500mm,以及云南植物区系成分与海南或更南地区的亲缘关系更密切。     

LB克隆系统的构建及在鞘氨醇单胞菌基因融合表达中的应用

为摆脱限制性酶切位点不足的限制,构建可灵活改变多基因融合方向的表达载体,基于ⅡS型和ⅡT型限制性内切酶LguⅠ和BbvC Ⅰ设计开发了 LB克隆系统.该克隆系统是以广宿主质粒pBBR1MCS-3为初始载体,利用 PCR的方法,在其多克隆位点区插入LB片段(GCTCTTCCTCAGC)构建得到的.LB片段含Lgu Ⅰ和B...     

青霉素酰化酶调节基因的定位和反式作用

青霉索酰化酶基因(pac)的定位研究表明它的调节基因和结构基因位于3．5kb的HindI—EcoR I片段。本文报道构建一系列质粒pPA 6的缺失衍生物,并测定这些缺失对pac表达的影响。结果表明调节基因位于pac结构基因内的spb I—Pvu I片段。SphⅠI—PvuⅡ片段克隆到质粒pTzl8u,所得质粒pPA57转化到青霉素酰化酶产生菌E．ColiD816,观察sphⅠ—PvuⅡ片段对染色体pac基因表达的影响。结果表明在sph Ⅰ—PvuⅡ片段内的调节基因反式调节pac基因表达。计算机分析表明在sph Ⅰ—PvuⅡ片段内有两个ORF是编码调节蛋白的可能候选者。Pac调节基因的精确定位正在进行中。     

骨形态发生蛋白的受体及其信号传递过程

近年来已克隆出几种Ⅰ型和Ⅱ型BMP受体.BMP受体属于TGFβ受体超家族的成员,具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性.Ⅰ型与Ⅱ型BMP受体均可与BMP配基结合,但若执行传递信号功能,两受体需首先形成复合物.删除突变和基因剔除研究证明,ⅠA型BMP受体对动物的中胚层发育至关重要.而ⅠB型BMP受体在软骨细胞形成、成骨细胞分化以及程序化细胞死亡方面起主要作用.BMP受体信号传递分子Smad 1和Smad 5也已被克隆和鉴定,它们在BMP受体介导的功能中起重要作用.     

小鼠3种α1,2岩藻糖转移酶基因的比较

利用RT-PCR方法克隆小鼠3种GDP岩藻糖：β-半乳糖苷α1,2-岩藻糖转移酶（α1,2-fucosyltansferase,α1,2-FT）基因编码区MFUT-Ⅰ、MHJT-Ⅱ、MFUT-Ⅲ,序列分析结果表明MFUT-Ⅰ、MFUT-Ⅱ和MFUT-Ⅲ间具有相当的同源性,且分别与人类H基因（78．4％）、Se基因（79．0％）和Secl基因（74．9％）具有序列同源性。将3种基因编码区分别插入表达载体pcDNA3．1的多克隆位点,并将其分别转染于COS-7细胞,结果显示MFUT-Ⅰ和MFUT-Ⅱ基因转染后的COS-7细胞具有α1,2-FT活性,但在MFUT-Ⅲ基因转染后的COS-7细胞中检测不到这种活性。应用Northern印迹杂交法研究基因在小鼠组织中的表达情况。证实MRJT-Ⅱ可在多种组织中产生3．5kb大小的mRNA转录产物,然而MFUT-Ⅰ和MFUT-Ⅲ分别只在附睾和睾丸中显著表达。Southern印迹杂交分析结果显示：基因MFUT-Ⅱ仅为一个拷贝,而MFUT-Ⅰ和MFUT-Ⅲ可能存在2个拷贝。因此,MHJT-Ⅰ、MFUT-Ⅱ和MFUT-Ⅲ分别为鼠的H基因、Se基因和Sec1基因。     

adr亚型乙型肝炎病毒DNA的酶切图谱分析

<正> 本文报道以pAT153质粒为载体克隆的adr亚型乙型肝炎病毒(HBV)全基因的限制性内切酶图谱。重组质粒已命名为pHBV-NCl。重组质粒的提取和酶解采用常规方法。限制性内切酶为Bio-Labs公司产品。用Sepharcry S-1000纯化得到的质粒,经电泳鉴定都是完整的超螺旋DNA。经过鉴定其BamHⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ、SstⅡ、SphⅠ、BglⅠ、BglⅡ、BstEⅡ、AceⅠ、AvaⅠ、HincⅡ、HpaⅠ等12种酶的21个切口已被定位。其中XhoⅠ、XbaⅠ、SstⅡ、